夜来香LIS基因的克隆与表达分析

为了研究夜来香生物钟和花香代谢机制,本研究以夜来香花瓣为材料,利用PCR技术,从中获得了夜来香LIS基因的全长cDNA,并命名为CnLIS。生物信息学分析结果表明:该cDNA序列全长为1 800 bp,编码560个氨基酸,其中ORF为1 683 bp,5'UTR为56 bp,3'UTR为61 bp;该序列编码的氨基酸序列与软枣猕猴桃、温州蜜柑LIS基因的同源性分别为55%、50%,属于类异戊二烯合成C1超级家族。实时荧光定量PCR分析结果表明,0~12 h CnLIS表达水平较低,16 h后表达量明显上调,20 h表达量达最大,随后表达量急剧下降,其表达量随花瓣开放与闭合呈节律性变化。推测CnLIS可能参与夜来香香气形成,调控花香形成过程,同时,该基因的表达可能受生物钟基因所调控。     

与核桃早实性连锁的SCAR标记基因的克隆与表达

克隆与新疆早实核桃(Juglans regia L.)早实性紧密连锁的SCAR标记相关基因,分析其在原核和转基因烟草中的表达,可为今后进一步研究其功能和克隆早实相关基因奠定基础。本研究采用RT-PCR和RACE技术克隆核桃早实性连锁标记SCAR相关基因的c DNA全长序列,分别构建该基因的融合原核表达载体ET28a-300与植物表达载体PBI121,并在大肠杆菌DH5α中诱导表达及通过农杆菌介导法转入烟草进行表达分析。结果显示:该基因c DNA为1 167 bp,包含一个最大为486 bp的ORF,编码162个氨基酸;诱导蛋白大小为18 k D,等电点为7.59;与一些预测蛋白具有一定的同源性。其核苷酸编码序列与藜科苜蓿的mth2-21d12(AC150566.16)、葡萄全序列鸟基因枪法获得的基因(AM460831.2)同源性分别为80%和82%;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白相符合,并将该基因命名为Jr2-7300。转早实SCAR标记连锁的Jr2-7300基因的烟草植株与对照烟草在长势方面无显著差异。核桃早实SCAR标记连锁的相关基因Jr2-7300与早实性紧密连锁,但尚缺乏直接的证据控制核桃的早实性。     

甘蓝型油菜Cu/ZnSOD和FeSOD基因的克隆及菌核病菌诱导表达

依据拟南芥、芥菜型油菜和白菜已知超氧化物歧化酶(SOD)保守序列设计引物,用同源序列法和RT-RACE技术克隆甘蓝型油菜Cu/ZnSOD和FeSOD基因,经序列分析和基因片段拼接,得到Cu/ZnSOD和FeSOD基因的全长cDNA,分别为756 bp (GenBank登录号AY970822)和1 037 bp (GenBank登录号EF634058)。以cDNA序列设计引物,获得1 322 bp的Cu/ZnSOD基因组DNA (GenBank登录号DQ431853)和1 659 bp的FeSOD基因组DNA (GenBank登录号EF634057)。生物信息学分析表明,Cu/ZnSOD基因ORF框长459 bp,编码152个氨基酸残基的蛋白质,在基因组序列结构上具有7个外显子和6个内含子。而FeSOD基因ORF框长792 bp,编码263个氨基酸残基的蛋白质,在基因组序列结构上具有8个外显子和7个内含子。二者外显子和内含子交接处完全符合GT/AG规则。利用获得的Cu/ZnSOD的cDNA片段作探针,对菌核病菌诱导甘蓝型油菜叶片的mRNA进行Northern blotting分析,结果显示在同一品种(系)中菌核病菌诱导后Cu/ZnSOD mRNA表达量比诱导前升高,抗(耐)型油菜Cu/ZnSOD mRNA表达量明显高于感病型。油菜叶片SOD酶活性分析结果也获得了完全一致的结果。以上结果表明,甘蓝型油菜SOD基因与菌核病抗性相关。     

苎麻ACC合酶基因(BnACS1)的克隆和表达分析

根据苎麻转录组测序中的ACS基因片段, 利用RT-PCR结合RACE技术从湘苎3号中克隆了该基因的全长cDNA序列, 命名为BnACS1, 在GenBank中的登录号为JQ970520。该基因的cDNA序列全长为1 674 bp, 其开放阅读框长1 470 bp, 编码489个氨基酸多肽, 预测其分子量和等电点分别为54.55 kD和6.37, 与苹果(AB034993)、枇杷(GQ370520)、苦瓜(AF248734)、牡丹(DQ337250)、烟草(AY426755)和胡杨(AB033502) ACS基因核苷酸序列的相似性分别为74%、74%、72%、71%、70%和70%, 氨基酸序列的相似性分别为75%、74%、71%、71%、70%和74%。半定量RT-PCR分析表明, BnACS1基因在根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达, 其中在根和雄花中表达较高, 在茎中表达最低。荧光定量PCR分析表明, BnACS1受ABA和干旱的诱导表达上调, 不受高盐诱导表达。     

大豆低温诱导启动子GmERF9P的克隆及活性鉴定

为获得低温诱导基因GmERF9启动子,并分析该启动子的功能,利用PCR技术从大豆叶片基因组DNA中克隆1885bp的GmERF9启动子序列GmERF9P。序列分析表明,GmERF9P序列中含有多种与逆境相关的顺式作用元件。将GmERF9P构建到植物表达载体pCAMBIA1301上并转化烟草。通过PCR检测共获得6株T_1阳性转基因烟草株系。对野生型烟草和转基因烟草进行低温处理2h,通过GUS组织化学染色和实时荧光定量PCR检测GUS基因的表达量。结果显示GmERF9P在低温处理下能够提高GUS基因的表达量,具有低温诱导启动活性。     

副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5基因的克隆和表达

副猪嗜血杆菌病(Haemophilus parasuis)是规模化猪场的重要细菌性疾病之一。对已发表的HPS外膜蛋白P5序列进行相关序列分析,设计合成引物,以HPS血清5型基因组为模板,通过PCR扩增HPS外膜蛋白P5编码基因,获得1 116 bp的预期基因片段。该基因编码372个氨基酸的蛋白质,预测分子量大约为41 kDa,利用基因工程的方法将该基因片段定向克隆至表达载体pGEX-6p-1中,诱导表达后的分子量约为67 kDa。该研究为制备亚单位疫苗和诊断试剂奠定了基础。     

远缘杂交转育抗烟草花叶病N基因同源基因片段的初步研究

烟草普通花叶病(TMV)是烟区的主要病害之一,生产上所用抗源都来自烟属的心叶烟(Nicotiana glutinosa),其携带N基因对TMV免疫,但因连锁累赘导致烟叶品质差,难以在生产上大面积使用。因此,从烟属植物中挖掘新的TMV抗源尤为必要。本研究以烤烟品种红花大金元与野生种圆锥烟草(N.paniculata,PI 555550)为亲本,开展远缘杂交,获得了种间杂种。杂交种SSR、GISH及抗病性鉴定结果表明,杂交种含双亲特征条带,接种TMV后,叶片有枯斑反应。N基因特异引物在圆锥烟草及杂交种中未能扩增,而根据N基因同源基因Np片段设计的特异引物扩增到500 bp的片段,携带N基因的RBST及心叶烟草(N.glutinosa PI 555507)中未扩增到此特异片段,在杂交种扩增到此特异片段。该研究为获得新的TMV抗源奠定了材料基础。     

小麦TaABC1L的克隆及表达特性分析

通过反向Northern筛查小麦旱选10号幼苗水分胁迫诱导表达的cDNA文库,选择一个在水分胁迫1、6和12 h均上调表达的cDNA克隆作为“种子”序列,利用电子延伸和RT-PCR方法,获得一个开放阅读框为1 434 bp,编码477个氨基酸的cDNA序列。由该序列推测编码的蛋白含有1个典型的ABC1保守域（123~243氨基酸）和1个AARF域（42~369氨基酸）,但是没有发现ABC1向线粒体转移的信号肽前体序列（PD017350）,因此,将该基因命名为TaABC1L。同源比对结果表明,TaABC1L只与水稻、拟南芥中4个尚未研究功能的基因编码的氨基酸序列高度同源。实时定量RT-PCR结果显示,TaABC1L对渗透、高盐、低温等逆境胁迫和ABA处理均表现出应答反应,但是在不同胁迫条件下表达高峰出现的时间和表达强度上存在差异。其中受NaCl胁迫1 h,基因的表达量已达到对照的30倍,之后其表达量迅速回落,但仍高于对照;受ABA诱导时,其表达量略有增加,在12 h的最高表达量也仅为对照的2倍。     

甜菜nia基因的克隆及不同氮素形态诱导的差异表达

利用同源序列克隆方法从二倍体甜菜品种Ty7中获得氮素诱导nia基因片段,通过RACE技术克隆nia基因全长序列,该基因ORF长度2 718 bp,编码905个氨基酸,并已在GenBank上登录(EU163265),基因组中nia以低拷贝数存在。nia编码蛋白的等电点为6.12,推测分子量为102 kD,以NADH为电子供体。为揭示不同氮素形态和处理对甜菜nia基因表达的影响,采用半定量PCR方法检测不同氮素形态诱导nia基因mRNA的表达,同时测定酶活力。结果表明,当铵态氮诱导nia基因时,低浓度的铵离子能促进基因的表达,过高浓度的铵离子抑制基因的表达。当硝态氮诱导nia基因时,随处理浓度的增加,nia的表达加强,呈正相关关系。用30 mmol L^–1硝态氮诱导4 h后,nia基因表达达最高值,约在6 h后,表达明显下降。     

花生病程诱导蛋白基因AhPIP1和启动子的克隆、序列分析及原核表达

本文采用RACE法克隆了花生病程诱导基因(pathogenesis-induced protein gene)全长,命名为AhPIP1,并在GenBank登录,登录号为EU860093.序列分析表明该基因的开放读码框579 bp,编码193个氨基酸.以YY20基因组DNA为模板PCR扩增获得AhPIP1基基因组序列长1 883 bp,包含3个外显子和长度分别为602 bp和600 bp的2个内含子.同源性比较发现AhPIP1与辣椒病程诱导蛋白CaPIP1(ABF72432,AAT35532)相似性达82%.采用Genome Walldng方法获得AhPIP1启动子,序列分析表明该启动子序列长513 bp,包含干旱胁迫、病程胁迫应答元件和生长素、赤霉素应答元件.构建pET32a-AhPIP1原核表达载体,转化表达受体菌Ecoli BL21,原核表达获得大小约40 kD AhPIPl融合蛋白,与推测的AhPIP1基因编码产物的大小一致,表明AhPIP1基因在大肠杆菌中能够表达.     

N基因标记基因PCR检测方法的建立及其在遗传育种中的应用

烟草的N基因是一个较为有效的抗烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)基因,在抗病育种中发挥着重要的作用。为建立其标记基因PCR检测体系,评估已知目的基因cDNA序列作为分子标记的目的基因辅助育种的可行性,本文依据N基因cDNA序列设计4对扩增范围在150～950bp的不同片段长度引物,并对含有N基因的coker176基因组DNA进行PCR扩增。扩增结果表明,有3对可扩增出特异产物。测序结果表明,有2对引物的扩增产物含有内含子。根据所获得的DNA序列设计出2对用于分子标记辅助育种的引物,并分别对C151、NC89、coker176等11个品种的基因组DNA进行扩增,结果表明在coker176、龙江912、吉烟9号和龙江911品种中有扩增产物,除龙江911外,这一结果与已知的N基因在11个品种的分布相一致,成功建立了N基因PCR检测体系,并证明以cDNA序列设计引物扩增DNA序列的目的基因辅助育种技术完全可行。并对实验中出现的问题进行了研究。     

两种苎麻纤维素合酶基因cDNA序列的克隆及表达

从苎麻转录组数据出发, 利用Blast工具从中分析出与多种植物纤维素合酶高度相似的片段CL789和Unigene20360。根据片段信息设计特异性引物, 从苎麻[Boehmeria nivea (Linn.)Gaud.]栽培种湘苎3号中克隆纤维素合酶核心片段, 并利用5'及3'RACE技术获得2个片段的全长cDNA。两者都具有典型的纤维素合酶特征结构域, 表明为2个苎麻纤维素合酶基因CesA的cDNA序列, 分别命名为BnCesA2和BnCesA3。BnCesA2基因编码区全长度3240 bp, 编码1 079氨基酸多肽; BnCesA3基因编码区全长3120 bp, 编码1039氨基酸多肽。对BnCesA2和BnCesA3基因在湘苎1号、湘苎3号、湘潭大叶白和城步青麻苎麻品种木质部和韧皮部荧光定量PCR分析显示, 2个基因在不同品种苎麻的木质部及韧皮部都有表达, 但表达量存在着一定差异, 整体而言BnCesA2具有更高的表达水平, 其木质部和韧皮部的表达都为BnCesA3的2~5倍。推测BnCesA2和BnCesA3都参与了苎麻细胞壁的次生合成。     

Development and application of a molecular marker for TMV resistance based on <Emphasis Type="Italic">N</Emphasis> gene in tobacco (<Emphasis Type="Italic">Nicotiana tabacum</Emphasis>)

Tobacco mosaic virus (TMV) caused serious loss in yield and quality of tobacco every year. It is a long-term goal to improve the tobacco resistance against TMV by tobacco breeding. N gene was the firstly reported TMV-resistant gene, which showed resistance against all Tobamoviruses except the Ob stain and belonged to the toll-interleukin-1 receptor/nucleotide-binding site/leucine-rich repeat class of plant resistance (R) genes. At present, N gene had already been widely used in tobacco conventional breeding, but there is rare available molecular maker used in marker-assisted selection of TMV resistance. In this study, we designed a pair of primers that specific amplify N gene fragment based on the sequence of N gene intron III, named N-marker. Then, we identified TMV resistance by two selecting methods, PCR with N-marker and inoculated with the TMV-C strain. Results from the two method showed that (1) 13 varieties among 67 tobacco varieties displayed hypersensitive reaction when inoculated with the TMV-C strain, also contained N gene fragments screened by PCR with N-marker; (2) 105 strains of 200 BC1 strains showed resistance against TMV when inoculated with TMV-C strain, meanwhile, 103 of the 105 strains contained N gene fragment verified by PCR with N-marker. Therefore, the N-marker is reliable for high throughput screening of germplasm resources and tobacco breeding materials in selection of N-mediated TMV resistance. Our study not only developed a molecular marker for tobacco breeding, but also identified new germplasm resources that are resistant to TMV.     

花生Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因启动子的克隆及功能分析

Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶(SAD)是决定植物体内饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸比值的关键酶。以花生品种豫花9326基因组DNA为模板,通过基因组步移技术,克隆到花生Δ~9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因(Ah SAD)起始密码子ATG上游720 bp片段,利用5'RACE方法获得了该基因的5'UTR序列,通过序列比对确定720 bp片段为Ah SAD启动子区域。PLACE在线启动子预测分析表明,该序列具有真核生物启动子必需的核心元件TATA-box和CAAT-box,含有多个与光诱导和激素响应相关顺式序列元件。将Ah SAD启动子片段替换pBI121质粒中的CaMV35S启动子驱动下游GUS基因表达,构建植物表达载体pBI-PAh SAD。通过农杆菌介导法转化拟南芥和在花生不同组织中瞬时表达,利用GUS组织化学染色研究其表达特性。表明在拟南芥和花生受体中,AhSAD启动子主要调控下游基因在根、茎、叶片和子叶中表达,在花生的果针中也检测到GUS活性;拟南芥的茎生叶只有叶脉中具有GUS活性,而花生整个叶片中都具有GUS活性。     

棉花纤维特异表达基因GhF1的分离及鉴定

采用mRNA荧光差异显示结合cDNA末端快速扩增技术,克隆了一个棉纤维特异表达基因的全长cDNA,命名为GhF1,该cDNA全长622 bp,含有一个编码66个氨基酸蛋白的开放阅读框。Southern杂交分析表明该基因在陆地棉(Gossypium hirsutumL.)中含有两个拷贝。Northern杂交分析表明该基因在棉花纤维细胞特异表达,在纤维发育过程中,GhF1转录产物的累积主要发生在纤维细胞发育的早期阶段。尽管未发现该基因与已知基因有任何同源性,但其分布的组织特异性和表达的发育阶段性暗示该基因在纤维伸长中起作用。     

油脂形成期棉花种子全长cDNA文库的构建

 提取海岛棉7124开花后25～35 d胚的总RNA,利用SMART技术,经21轮LD-PCR扩增获得全长双链cDNA,经SfiⅠ酶切、层析柱分离后,收集500 bp以上的片段与pDNR-Lib载体连接并转化到感受态DH10B细胞,构建了棉花种子全长cDNA文库。所构建的原始文库库容为5×10⁶,文库滴度为1.5×10⁸ cfu·mL^-1。在文库中随机挑取180个克隆进行PCR检测,结果显示,文库中插入片段长度为0.5～2.5 kb,将挑取的180个单克隆进行EST测序,无空载序列,说明文库重组率为100%;序列分析结果表明,其中与油脂形成相关的EST有13条。以上数据说明构建的文库质量较高,为进一步从文库中分离棉花脂肪酸代谢关键基因,提高棉花含油量奠定了基础。     

甘蓝型油菜BnFAD2-C1基因全长序列的克隆、表达及转录调控元件分析

脂肪酸去饱和酶基因(FAD2)是控制植物体中油酸含量的关键基因,在甘蓝型油菜中有4个FAD2基因的拷贝,分别定位在A1、C1、A5、C5染色体上。本文克隆了1个FAD2拷贝基因,依据油菜基因组数据库信息,将其定位到C1染色体上,命名为Bn FAD2-C1,其开放阅读框为1155 bp。采用RACE(rapid-amplification of c DNA ends)技术获得了175 bp的5?UTR序列和212 bp的3?UTR序列。采用荧光定量PCR技术研究发现,Bn FAD2-C1在根、花和角果皮中仅保持本底水平的表达,在种子发育中期呈现高效表达,具有种子特异性诱导表达的特征。根据甘蓝和油菜基因组数据库信息,同源克隆到Bn FAD2-C1基因的启动子(promoter)和内含子(intron)序列,并通过PLACE和Plant CARE网站分析,初步预测到调控该基因转录的潜在顺式作用元件。通过茉莉酸诱导处理,Bn FAD2-C1基因表达量发生变化,推断茉莉酸在Bn FAD2-C1基因的表达过程中可能发挥一定的调控作用。     

利用改进的差异显示技术分离烟草中受乙烯利诱导的新基因(英文)

利用改进的差异显示技术从烟草中分离受乙烯利调控的新基因。在分离到的24个差异片段中,通过点杂交验证，表明其中17个为阳性。对这些阳性片段的序列分析表明有4个新基因（DF6，DF8，DF9，DF13）。其中DF8是一个未知基因,其他3个通过GenBank搜索可以找到一些同源的已知基因。RT-PCR分析表明，DF6、DF8、DF13在对照中也     

用SOE PCR方法获得新城疫病毒La Sota株全基因组cDNA

为了获得新城疫病毒La Sota株全基因组cDNA。根据SOE PCR方法要求设计引物,对NDV LaSota株进行分段扩增,然后应用SOE PCR方法连接各片段,全基因连接可得到约15000 bp的扩增片段,所得到的产物为NDV La Sota株全基因组cDNA。结果表明:采用SOE PCR方法合成的基因序列经测序及酶切鉴定,与GenBank上登陆的NDV La Sota株全基因组序列基本一致。本研究为构建新城疫LaSota株的感染性cDNA奠定了物质基础;并为进一步研究NDV的生物学特性、结构与功能的关系,探讨影响NDV毒力的因素、及研制新型疫苗载体提供了可靠依据。     

甜菜M14品系BvM14-STPK基因的生物信息学分析及响应盐胁迫的表达分析

旨在进一步研究BvM14-STPK蛋白激酶对盐胁迫的应答反应,本研究以甜菜M14品系为材料,使用特异性引物通过聚合酶链式反应进行扩增,获得BvM14-STPK基因cDNA全长,并进行生物信息学分析,采用荧光定量PCR探究该基因响应盐胁迫的表达分析。生物信息学分析结果表明,BvM14-STPK基因cDNA全长1668 bp,包含1527 bp的最大ORF,编码508个氨基酸;BvM14-STPK蛋白激酶具有典型的蛋白激酶保守结构域。实时荧光定量PCR结果表明,BvM14-STPK基因在甜菜M14品系叶、根中均有广泛表达,叶中的表达量高于根中。该基因在200、400 mmol/L NaCl处理下,在叶片和根中呈现不同的表达状态,表明该基因可以应答盐胁迫,但在不同组织中应答盐胁迫的表达量存在差异。本项研究在挖掘甜菜M14品系优质基因和提高栽培甜菜抗逆性等方面具有重要指导意义,为进一步开展甜菜遗传改良工作奠定基础。