高温胁迫下瓜实蝇的内参基因筛选

基于实时荧光定量PCR技术,测定瓜实蝇雌成虫GAPDH、SD、β-TUB、ACT和RPL13共5个备选内参基因分别在25(CK)、37、45℃下处理1 h的m RNA水平表达情况,并借助Bestkeeper、Normfinder和Ge Norm程序分析5个备选内参基因表达的稳定性。筛选得出Best Keeper:SD值排序为SD(0.06)=GAPDH(0.06)RPL13(0.11)β-TUB(0.15)ACT(0.23);Normfinder:稳定值排序为SD(0.004)=RPL13(0.004)GAPDH(0.005)β-TUB(0.006)ACT(0.010);Ge Norm:M值排序为SD(0.011)=RPL13(0.011)=GAPDH(0.011)β-TUB(0.012)ACT(0.016)。综合分析结果可选定SD为最稳定的内参基因,RPL13和GAPDH次之。该结果可为深度开展高温胁迫下瓜实蝇其它基因的表达情况研究提供参照。     

茶树低温胁迫下microRNA实时定量PCR内参基因的筛选

MicroRNA（miRNA）在基因的转录后调控上起到重要作用,对其表达水平的定量研究已成为一种常见实验,选择合适的内参基因是确保实时荧光定量PCR（qRT-PCR）准确性的先决条件。本研究以茶树为材料,挑选了9个候选内参基因,用qRT-PCR技术检测它们在不同样本中的表达量,采用BestKeeper和geNorm软件进行表达稳定性综合分析。结果表明,一种茶树新miRNA（PC-3p-222）在不同低温处理以及不同茶树组织中表达最为稳定,Ct平均值为22~23,丰度适中,可以作为茶树低温胁迫下miRNA qRT-PCR的内参基因,为miRNA定量研究工作提供参考。     

甘蔗基因表达定量PCR分析中内参基因的选择

以甘蔗接种黑穗病菌后0、6、12、24、48、60和72 h时间点的材料为研究对象,应用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR Real-time qPCR)技术,探讨25S rRNA、GAPDH、β-actin和β-tubulin4个内参基因mRNA水平的表达情况.经geNorm程序统计学分析,4种内参基因的表达稳定性各异,25S rRNA>GAPDH>β-actin>-tubulin,其中以25S rRNA表达稳定性最好,且根据该基因设计的两对定量PCR引物都是可行的.同时,甘蔗PPO基因表达特性的定量PCR分析也显示,甘蔗PPO基因与植物的抗病性相关.结果显示,研究中所筛选的内参基因是合适的.     

菠萝蜜实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选

为筛选菠萝蜜实时荧光定量PCR研究用的内参基因,以菠萝蜜不同发育阶段的果实、叶和花序为材料,分析GAPDH、18S rRNA、UBQ、ɑ-tubulin和β-tubulin 5个内参基因的表达情况,并对其表达稳定性进行分析。结果表明,在各组织不同发育阶段中,5个内参基因的表达丰度变化存在差异;geNorm、NormFinder和BestKeeper 3种方法得出的结论有所不同,经RefFinder综合评价后,果实中最稳定的3个内参基因是UBQ、GAPDH、18S rRNA;叶片中最稳定的3个内参基因是UBQ、GAPDH、β-tubulin;花序中最稳定的3个内参基因是UBQ、GAPDH、ɑ-tubulin。     

温度和药剂胁迫下黄翅绢野螟实时荧光定量PCR内参基因筛选

为筛选黄翅绢野螟(Diaphania caesalis)逆境胁迫下稳定表达的内参基因,使该虫抗逆基因的定量表达分析标准化.本研究根据黄翅绢野螟成虫转录组注释结果,利用qPCR技术分析了9个分别编码ACT、β-TUB、GAPDH、G6PDH、RPS3a、RPL13a、EF1α、EIF4A、/3-ACT的候选内参基因在温度...     

红麻细胞质雄性不育系与保持系总蛋白提取及双向电泳体系优化

为进一步研究高等植物体内控制蔗糖合成的关键酶基因蔗糖合酶基因Susy在甘蔗中的表达情况，本研究以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因为内参基因，通过对退火温度、循环数的优化建立了一个稳定、方便的半定量RT-PCR体系。通过该体系检测干旱处理下甘蔗叶的Susy基因表达，并结合叶片酶活性和蔗糖含量进行分析。结果表明：甘蔗Susy基因的半定量RT-PCR扩增，以循环数30个、退火温度为54 ℃、内参基因与目的基因同批异管进行扩增为宜。甘蔗Susy基因在不同叶位中的表达有很大差异，总体上表现为：+1叶、+2叶>+5叶、+6叶>心叶，干旱胁迫可诱导幼嫩叶中Susy基因的表达量上升，基因表达的变化与其酶活性和蔗糖含量变化的情况相一致。     

铝胁迫下橡胶苗实时荧光定量PCR内参基因的筛选

铝毒是热带地区酸性土壤上抑制作物生长的主要因素,但目前关于铝活化后对橡胶树生长和产胶的影响及橡胶树耐铝机制的研究很少。为了筛选出橡胶树在铝毒胁迫下稳定表达的内参基因用于实时荧光定量PCR分析,本研究选择了Actin、Actin7、18S rRNA、40S rRNA、YLS8、UBC2、UBC4、GAPDH、FP和ADF等10种常见的基因作为候选内参基因,通过qRT-PCR检测,利用内参基因评价软件geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta Ct算法以及综合评价软件RefFinder对10个候选内参基因的表达稳定性进行评估。综合评价结果表明,铝胁迫后表达稳定性排名前3的内参基因依次分别为UBC4、40S rRNA和FP。进一步选取UBC4、40S rRNA、FP基因和UBC4+40S rRNA+FP基因组合以及稳定性较差的GAPDH基因作为内参基因对橡胶树铝诱导苹果酸分泌转运蛋白基因HbALMT-1和HbALMT-2进行相对表达分析,结果显示2个目的基因相对于3个内参基因及其组合均显示出一致的表达水平,而稳定性较差的内参基因GAPDH未能准确地对目的基因的表达量进行校正。综上所述,筛选出UBC4、40S rRNA和FP基因以及UBC4+40S rRNA+FP基因组合可作为铝毒胁迫不同天数下表达最稳定的内参基因,可用于铝毒胁迫下橡胶树相关基因的表达分析。     

二化螟实时荧光定量PCR内参基因筛选和表达稳定性评价

【目的】筛选特定试验条件下二化螟(Chilosuppressalis)稳定表达的内参基因,为二化螟基因表达研究奠定基础。【方法】根据二化螟转录组测序结果挑选出11个候选基因,利用实时荧光定量PCR测定其在二化螟不同发育历期、不同组织、温度处理、杀虫剂处理、取食不同饲料、取食不同水稻、dsRNA处理和混合样品的表达量,利用RefFinder、BestKeeper、Ge Norm和NormFinder等软件和ΔC_t值对11个候选基因的稳定性进行评估。【结果】5种分析方法表明,在二化螟不同发育历期稳定性较高的内参基因是AK、RPL10和EF1,不同组织中稳定性较高的内参基因是EF1、TUB和ACTB,不同温度下较稳定的内参基因为TUB、RPL10和EF1,杀虫剂处理样品中较稳定的是TF4和ACTA,取食不同饲料较稳定的是TUB、TF4、EF1和RPL10,取食不同品种水稻较稳定的是TUB和EF1,dsRNA处理样品中较稳定的是TUB、AK、ACTB和EF1,混合样品中较稳定的是EF1、TUB和ACTB。【结论】为不同试验条件下选择合适的内参基因提供了参考,也有利于在二化螟基因表达研究中获得更加可靠准确的数据。     

茶树新梢不同叶片中β-葡萄糖苷酶和β-樱草糖苷酶基因表达的实时定量PCR分析

在建立茶树基因表达绝对定量实时PCR检测方法后,检测了龙井43新梢不同部位叶片中的β-葡萄糖苷酶和β-樱草糖苷酶基因的表达情况,结果表明β-葡萄糖苷酶在一芽五叶新梢的第四叶中表达活性最高,为2.86E+08拷贝/μl,第四叶>第三叶>第五叶>第二叶>一芽一叶;而β-樱草糖苷酶基因在一芽一叶中最高,为4.31E+06拷贝/μl,一芽一叶>第二叶>第三叶>第四叶>第五叶。与茶叶香气密切相关两个基因在茶树不同部位的叶片中表达量和表达类型存在明显差异。本实验建立的实时荧光定量PCR可有效地用于茶树基因表达的定量分析。     

茶树CsLHTs亚家族基因的克隆与表达分析

氨基酸是茶叶的重要品质成分和氮素贮存形式,因此开展茶树体内氨基酸转运蛋白的研究尤为重要。本研究从茶树转录组中筛选得到5条茶树LHTs(Lysine histidine transporters,赖氨酸/组氨酸转运蛋白)家族基因序列,并从龙井43中成功克隆获得4个茶树LHTs基因,分别命名为CsLHT1、CsLHT6、CsLHT8.1和CsLHT8.2。对该亚家族编码的氨基酸序列的理化性质和功能结构进行预测,结果显示CsLHTs亚家族含有9~11个跨膜区;且含有与氨基酸转运相关的结构域。为了明确在不同茶树品种和氮素水平间CsLHTs基因的表达差异,本研究选用3个茶树品种的扦插苗为试验材料,水培条件下氮饥饿两周后,分别用0.2、2、10mmol·L^-1的NH4NO3进行处理。利用qRT-PCR分析了CsLHTs在不同组织间的表达情况,结果表明4个基因在茶树营养组织中均有表达。经氮素处理后,CsLHTs基因在3个氮素水平和3个品种中呈现出不同的变化规律。CsLHT1、CsLHT6和CsLHT8.2在品种间的表达差异程度高于不同氮素水平间的基因表达差异。CsLHT8.1对氮素处理有明显的响应,尤其经0.2mmol·L^-1和10mmol·L^-1的NH4NO3处理72h后,在氮高效品种中茶302根中呈上调表达,表明CsLHT8.1可能参与氨基酸由根部向地上部的转运过程。     

实时荧光定量PCR筛选稻曲病菌内参基因

 通过实时定量PCR分析了稻曲病菌中5个传统内参基因18S rRNA、GAPDH、ubiquitin、β actin、α tubulin的mRNA差异表达情况,并利用geNorm软件分析了它们在4个发育时期和NaCl胁迫处理中的表达稳定性。结果表明,在菌龄为7 d、8 d、9 d、10 d的稻曲病菌中,α tubulin 2和β actin表达稳定;在0.4 mol/L  NaCl溶液处理0 h、4 h、8 h、12 h、16 h后,β actin和α tubulin 2表达稳定。因此,当利用荧光定量PCR分析比较稻曲病菌基因表达差异时,可选择α tubulin和β actin作为内参基因。     

茶树硝态氮转运蛋白NRT1.1基因的克隆及表达分析

以茶树(Camellia sinensis(L.))品种龙井43为试材,采用PCR结合RACE技术,克隆得到硝态氮转运蛋白基因(NRT1.1)的c DNA全长序列,基因序列全长1 880 bp,其中开放阅读框(ORF)1 788 bp,编码595个氨基酸,预测蛋白质分子量为65.9 k D,理论等电点为8.99,命名为Cs NRT1.1。序列分析表明,Cs NRT1.1与葡萄NRT1.1氨基酸序列的相似性最高。通过生物信息学分析,对Cs NRT1.1的氨基酸理化性质、亲/疏水性、跨膜区域及亚细胞定位进行了预测。实时定量PCR表达分析表明,茶树根和叶片中Cs NRT1.1在1 mol·L~(-1) NO3-处理5 min内均受到抑制,叶部Cs NRT1.1表达量0.5 h后即达到最大值,24 h内各个时间点均高于根部,根中表达量Cs NRT1.1始终低于对照。本研究结果为研究茶树对NO3-的吸收、转运和调控机理提供了分子生物学基础。     

茶树CLH基因家族的鉴定与转录调控研究及其在白化茶树中的表达分析

叶绿素酶（Chlorophyllase,CLH）是叶绿素降解过程中的关键酶,将叶绿素a脱去植醇,形成脱植基叶绿素a。以白化茶树白鸡冠新梢叶片为材料,克隆获得3条CsCLHs基因cDNA全长序列,并进行生物信息学分析。结果表明,3条CsCLHs基因分布于2个亚家族,其蛋白质编码区（Coding sequence,CDs）长度为894~975 bp,编码氨基酸个数为297~324,蛋白质分子量为31.99~34.91 kDa,等电点为4.89~7.61,不稳定系数为38.94~48.24,其中CsCLH1.1和CsCLH1.2为不稳定蛋白,CsCLH2为稳定蛋白。Cell-PLoc亚细胞定位预测结果表明,3个CsCLHs蛋白均定位于叶绿体;而WolfPsort亚细胞定位预测结果显示,CsCLH1.1和CsCLH1.2定位于细胞质,CsCLH2定位于叶绿体。遮阴和恢复光照处理下的qRT-PCR结果显示,遮阴抑制白鸡冠叶片CsCLHs的表达,光照诱导白鸡冠叶片CsCLHs的表达。不同品种中CsCLHs表达模式分析表明,CsCLH1s在白化叶中高表达。另外,酵母单杂交结果表明,CsCDF5可以与CsCLH1.1和CsCLH2启动子结合。综上所述,CsCLHs在白化茶树叶片中可能参与叶绿素降解,在叶片白化过程中发挥重要作用,结果可为进一步探究茶树CLH基因家族的功能及茶树叶片白化机理提供参考。     

基于转录组测序对茶树GST基因表达的研究

谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-transferases,GSTs)在植物体内普遍存在,是一类具有多种生物学功能的超家族蛋白酶。本研究通过对中黄2号、龙井43在正常光照和遮荫处理下的转录组测序,筛选获得了49个Cs GSTs基因家族成员,并对其中19个在芽叶中表达量较高的Cs GSTs基因进行了序列分析和聚类分析。另外对表达量较高的8个候选基因进行荧光定量表达分析,研究它们在龙井43不同叶位中的表达模式。结果表明这些Cs GSTs基因在一芽一叶到第六叶中均有表达,但各自呈现出不同的变化规律。Cs GST20在龙井43一芽一叶到第六叶中的表达量逐渐上升,可能与植物抗胁迫有关,而Cs GST24的表达量则显著下降,可能与花青素代谢有关。     

茶树胡萝卜素合成关键基因CsLCYb和CsLCYe的克隆与功能鉴定

胡萝卜素是茶树叶片色素重要的组分之一,具有参与光合作用、保护光合系统的功能。从茶树叶片转录组中获得两个胡萝卜素合成关键基因:番茄红素-β-环化酶基因(CsLCYb)和番茄红素-ε-环化酶基因(CsLCYe),它们分别含含1515bp和1524bp的开放阅读框,编码504和507个氨基酸残基,与其他植物的同源基因高度相似。利用多基因串联表达证明CsLCYb能够将番茄红素环化成胡萝卜素,而CsLCYe则无此活性。通过ELISA分析胡萝卜素生成效率,发现含有CsLCYb表达载体的菌落能够产生大量胡萝卜素,与阴性对照差异极显著,而含有CsLCYe表达载体的菌落则与阴性对照一致,无胡萝卜素产生。这与茶树中胡萝卜素的种类和含量水平一致,说明茶树主要是通过LCYb途径产生胡萝卜素。qRT-PCR分析表明,CsLCYb在黄化品种中黄2号的不同叶位中表达水平与其黄化程度呈正相关,与胡萝卜素含量水平相一致,并且该基因在正常叶色品种龙井43和中黄2号的相对表达结果也符合这一规律。这充分证明CsLCYb在黄化茶树叶片的胡萝卜素合成和叶色变化过程中扮演了重要的角色。本研究阐明了茶树胡萝卜素合成的关键基因和主要途径,为揭示茶树黄化的分子机理提供了重要的遗传基础。     

白茶萎凋过程萜烯类合成相关基因的鉴定和表达分析

萜烯类化合物是植物中重要的次生代谢产物之一,对茶树挥发性香气的组成起着重要作用。从茶树基因组数据库中鉴定获得了141个茶树萜烯类合成相关基因,并对其不同组织表达特异性进行分析,筛选出16个在茶树顶芽和嫩叶中高表达的萜烯类合成代表基因。生物信息学分析结果表明,系统进化关系将茶树与拟南芥和葡萄的萜烯类合成相关基因分成了4个亚家族;茶树萜烯类合成相关基因含有5~14个外显子,在上游启动子区域分析发现了大量与光响应、植物生长发育、激素和胁迫响应密切相关的顺式作用元件。荧光定量检测发现,CsMVK、CsDXS和CsGGPS在白茶萎凋过程中的表达显著上调;CsDXR、CsMCT、CsCMK、CsMCS、CsHDS、CsGPPS和CsGGPPS在萎凋4 h和24 h的表达达到峰值。本研究结果为进一步挖掘茶叶萎凋过程中萜烯类合成相关基因对茶叶香气组分积累提供了理论依据。