猪microRNAs的克隆、鉴定及表达分析

MicroRNAs（miRNAs）是一种长11~22 nt,具有调节作用的小分子RNA,可通过抑制蛋白质的合成和降解mRNAs来沉默靶基因。猪因具有产肉特性,成为了农业生产中一种重要的动物,此外,由于其与人类的亲缘关系较近,与小鼠模型相比,猪更具有作为模型组织的巨大的生物医学重要性。到目前为止,在哺乳动物中（如人、老鼠等）已鉴定出数百个miRNAs,但猪基因组中的miRNAs研究却较少。因此,本试验对猪不同组织中的保守miRNAs进行了鉴定,并对其表达模式进行了分析。通过对猪心脏、肝脏和胸腺中提取的混合RNA进行测序,构建了一个小RNA基因库,在该基因库中共鉴定出了120个保守的miRNA。对14个不同组织中的保守miRNAs进行表达分析。结果表明,miR-499和miR-208在心脏中特定表达,miR-122在肝脏中特定表达。除此之外,miR-1和miR-133、miR-181a和miR-142-3p、miR-194、miR-143在心脏、胸腺、肝脏和胃中均有较高的表达水平;miR-22、miR-26b、miR-29c和miR-30c在不同的猪组织中均有表达。猪不同组织中特定的miRNAs表达模式并不相同。 因此,本研究鉴定出了120个miRNAs,并对其在猪不同组织中的特定表达进行了检测,为对猪和一些相关的哺乳动物（包括人）转录后的基因调控感兴趣的分子生物学家、育种工作者、生物医学研究者提供了宝贵的资料。     

鸡性成熟启动前后下丘脑microRNA表达谱分析

本研究旨在探讨miRNA在鸡性成熟启动调控中的作用。利用Solexa高通量测序技术检测了鸡性成熟启动前(Before puberty onset,BPO)和性成熟启动后(After puberty onset,APO)下丘脑中miRNA表达谱,通过生物信息学方法进行靶基因预测和功能分析。结果表明,在鸡下丘脑中鉴定出374个已知miRNAs、46个新miRNAs,144个已知miRNAs(reads10)的表达水平在性成熟启动前后发生了显著改变(P0.05)。5个差异表达miRNAs被qRT-PCR方法进一步验证。15个差异最显著miRNA(|log2(fold-change)|2.0,P0.01)预测到2 013个靶基因,GO富集和KEGG调节通路分析结果表明,这些差异表达miRNAs在性成熟启动转录调节和信号转导通路中发挥了重要作用。综上表明,miRNA是参与鸡性成熟启动新的调节因子。鉴于miRNA功能的保守性,该研究结果将为深入开展动物(包括人类)性成熟的分子调控机制研究提供新的理论依据。     

microRNA与猪肌肉发育

MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,成熟的miRNAs可通过与靶基因的3′UTR结合,从而发挥对靶向基因负调控作用。目前,研究人员已经证明miRNA在机体的生长、发育、繁殖、分化和凋亡等生理过程中发挥重要的作用。猪肌肉发育的相关研究备受关注,猪肌肉的发育与其他动物一样,受众多基因的调控,这些基因的表达和翻译同时受miRNAs的调控。本文对miRNAs与猪肌肉发育的相关性进行了系统的分析,提出miRNAs在猪生产中的研究和应用的某些展望。     

猪血清和血浆外泌体miRNA的鉴定与比较

为了解血液中外泌体miRNA的表达情况,利用高通量测序技术检测了来源于相同个体的猪血清和血浆外泌体miRNA表达谱。结果显示,血清外泌体中提取的RNA浓度显著高于血浆外泌体(P=0.02),从2个文库中共检测到187个成熟体miRNAs,对应165个前体。鉴定出了在2个文库中丰富表达的17个miRNAs,暗示这些miRNAs在血清和血浆中发挥着重要的作用。筛选出99个差异表达miRNAs,其中54个在血清外泌体中高表达,45个在血浆外泌体中高表达。通过靶基因预测和功能注解分析,丰富表达的miRNAs广泛地参与到机体的生理学过程中。本研究对猪血清和血浆外泌体miRNA进行了鉴定及比较,为深入研究外泌体miRNA在生物体内的功能提供理论依据。     

牛基因组中新的microRNA预测及分析

MicroRNA(miRNA)是一类调控真核基因表达的非编码小分子RNA,目前已证实miRNA在生物体生长、发育和疾病发生等过程中起着重要的作用。用同源搜索的计算分析法预测新的miRNAs是当前发现和鉴定miRNA的有效方法之一,本研究根据NCBI数据库中的牛EST、GSS信息以及猪、家犬、人、大猩猩和小家鼠5种哺乳动物的已经注册miRNA分子信息,预测牛新的候选miRNA,通过碱基错配、二级结构、A+U含量、自由能大小等分析候选序列特征,得到了17条牛新的候选miRNA。这对进一步寻找牛的miRNA和遗传育种研究提供了新的思路,具有一定的理论和实际意义。     

调控香猪繁殖候选miRNA筛选

研究旨在从香猪卵巢small RNA测序数据中挖掘调控香猪繁殖的microRNA （miRNA）,解析miRNA调控香猪卵巢功能及繁殖性状的分子机制,对于猪的遗传选育具有重要意义。研究选取发情期和间情期的香猪各4头,屠宰后取其卵巢组织,提取总RNA进行small RNA测序,利用生物信息学方法检测miRNA表达谱,筛选差异表达的miRNA,预测差异表达miRNA靶基因,并对靶基因进行GO功能富集和KEGG通路富集分析。结果显示,香猪卵巢组织中miRNA在染色体上呈不均匀分布,主要分布于1号染色体和X染色体上。香猪卵巢中共有627个已知猪miRNAs表达,其中有34个差异表达miRNAs,表达量前五的分别是miR-23、let-7i-5p、miR-103、miR-30e-5p和miR-1271-5p。GO功能分析结果显示,靶基因主要参与的生物学过程是细胞过程（cellular process）,主要分布于细胞（cell）,主要分子功能是结合（binding）;KEGG显著富集通路中,促性腺激素释放激素受体通路（gonadotropin-releasing hormone receptor pathway）、胰岛素样生长因子通路（IGF pathway）和表皮生长因子受体信号通路（EGF receptor signaling pathway）与卵母细胞的发育成熟相关,因此推测miR-23b、let-7i-5p、miR-103、miR-30e-5p和miR-1271-5p可能参与了香猪繁殖调控。本研究初步筛选出5个可能调控香猪繁殖性能的miRNAs,可为从分子水平提高香猪产仔数提供理论基础。     

牛多个组织microRNA Solexa测序与生物信息学分析

本研究旨在发掘牛更多的microRNA(miRNA)信息及新的miRNA序列,为进一步研究miRNA的生物学功能奠定理论基础。运用高通量测序技术对来自一头西门塔尔公牛和一头荷斯坦母牛的多个组织的小RNA进行混池测序,对测序结果进行了生物信息学分析。随机选取了一条成熟miRNA:bta-miR-2346-5p和两条新预测的miRNAs:novel_miR-48和novel_miR-86,采用茎环RT-PCR进行验证。共鉴定了604条miRNAs,其中429条为牛的已知miRNAs,175条为新预测的miRNAs。通过茎环RT-PCR发现选取的这3条miRNAs在背最长肌、心肌、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大肠、小肠中均有表达,证明了高通量测序结果的准确性。本试验得到的数据在一定程度上丰富了牛miRNA的数量和种类,为后续牛或其他物种的miRNA相关生物学研究提供了更加详实的信息。     

牛多个组织microRNASolexa测序与生物信息学分析

本研究旨在发掘牛更多的microRNA(miRNA)信息及新的miRNA序列,为进一步研究miRNA的生物学功能奠定理论基础.运用高通量测序技术对来自一头西门塔尔公牛和一头荷斯坦母牛的多个组织的小RNA进行混池测序,对测序结果进行了生物信息学分析.随机选取了一条成熟miRNA:bta-miR-2346-5p和两条新预测的miRNAs:novel_miR-48和novel_miR-86,采用茎环RT-PCR进行验证.共鉴定了604条miRNAs,其中429条为牛的已知miRNAs,175条为新预测的miRNAs.通过茎环RT-PCR发现选取的这3条miRNAs在背最长肌、心肌、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大肠、小肠中均有表达,证明了高通量测序结果的准确性.本试验得到的数据在一定程度上丰富了牛miRNA的数量和种类,为后续牛或其他物种的miRNA相关生物学研究提供了更加详实的信息.     

猪完整发育阶段microRNA组图谱研究

家猪对农业有重要的意义,也是研究人类疾病良好的模式动物,而猪microRNA(miRNA)组图谱研究滞后,有必要建立一个汇总micRNA调节功能和相互作用的文库以便对其信息进行解读。本研究收集了猪从胚胎到成年发育的全部代表性时期共10个阶段的样品,建立了miRNA序列库,并对其miRNA进行了研究。测序结果与哺乳动物miRNA、前体发夹序列(pre-miRNA)、首次公布的猪基因组序列,以及表达序列标签(EST)进行比对分析。该研究结果使猪miRNA组序列数增至867条(623条与基因组序列相匹配),可编码1004个miRNA,其中777个是特异性序列。该研究还运用实时定量PCR技术从47个特异组织样品中选择30种miRNA进行试验,定量结果与测序结果完全一致。本研究成果提供了很多关于miRNA的末端序列变异、miRNA前体结构、染色体定位、特定发育阶段的miRNA表达和保守序列的信息;为猪miRNA组图谱、miRNA种类及异构体和miRNA特征的研究提供了很多宝贵的数据资源;也将大大促进猪生物学和以猪作为模式动物进行的人类生物学和生物医学的发展。     

饲粮中添加共轭亚油酸对猪肌肉组织miRNA表达谱的影响

旨在探讨共轭亚油酸(CLA)通过影响猪肌肉miRNA表达调控肌肉代谢的分子机制。本研究选用体重相近的初产荣昌母猪12头,随机分为对照组和CLA组,CLA组母猪饲粮从妊娠初期开始添加1.5%CLA,持续到仔猪28日龄断奶;断奶后分别从对照组和CLA组挑选仔猪各30头,原CLA组仔猪饲粮中继续添加1.5%CLA。待仔猪体重约30kg时,每组各选择6头进行屠宰,采集背最长肌和腿肌样品。提取RNA后将对照组和CLA组的背肌和腿肌进行建库;通过Solexa高通量测序技术检测CLA对猪肌肉组织miRNA表达谱的影响,利用生物信息学进行差异显著表达miRNA的靶基因预测和功能分析。结果显示:1)背肌和腿肌分别获得了44 869 982条和45 105 806条clean reads,大多数序列长度在20~23nt。2)背肌和腿肌分别鉴定到306和304个已知miRNAs,有295个miRNAs共表达。3)添加CLA后能改变猪肌肉中miRNA的表达,分析表明,CLA对腿肌miRNA表达的影响要强于背肌;背肌和腿肌中分别发现5个和12个差异显著表达的miRNAs(P0.05),其中ssc-miR-224在两种组织中都差异表达,因此共有16个差异表达miRNAs。4)对16个差异表达miRNAs进行靶基因预测和KEGG通路富集分析,发现它们的靶基因主要富集于292个通路,其中24个通路显著富集(P0.05),包括与肌肉代谢密切相关的MAPK信号通路和Notch信号通路。5)利用荧光定量PCR对随机选择的6个差异表达miRNAs进行验证,证实其表达水平和测序结果基本一致。以上结果说明,CLA可能通过影响肌肉miRNA表达,调控重要肌肉代谢通路。