鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白A原核表达及间接ELISA方法的建立和初步应用

为建立鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,以RA贵州分离株RAG06基因组为模板扩增并克隆鸭疫里默氏杆菌OmpA基因,构建pET32a-OmpA重组原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,重组菌经诱导、超声、纯化后,通过SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定获得OmpA重组蛋白大小约57 KD;以OmpA重组蛋白为包被抗原初步建立ELISA方法并优化,经多次方阵检测结果显示,OmpA蛋白以2.243 mg/mL的浓度进行包被,血清以1∶100稀释,抗原包被条件为4℃过夜、封闭条件为37℃120 min、血清反应时间为37℃60 min、酶标抗体工作浓度为1∶1000、酶标抗体反应时间为37℃60 min、显色时间为15 min为最佳条件。确定临界值为0.389。特异性试验表明RA阳性血清有较好反应外,其他血清均无明显反应。批内变异系数2.77%～8.00%,批间变异系数为1.10%～7.80%。当阳性血清稀释比例为1∶1600时,仍可判断为阳性,敏感性较高。应用该方法检测贵州...     

四种血清型鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白免疫原性分析

采用超声波裂解和超速离心法提取1型、2型、10型与11型鸭疫里默氏杆菌(Ra)的外膜蛋白(Omp),经SDS-PAGE分析,以上4个血清型Ra的Omp均由13～17个蛋白多肽组成,其分子质量大小为20～120 ku,相同血清型的电泳图谱相似,不同血清型的电泳图谱差异较大.交叉免疫印记试验结果表明,4种血清型在44～69 ku有交叉反应的蛋白多肽.     

云南鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白A 及16S rRNA序列分析

为了探讨鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer, RA)云南流行株的外膜蛋白A (OmpA)的基因序列差异及其与16S rRNA序列的相关性,PCR扩增18株云南流行株鸭疫里默氏杆菌OmpA基因及16S rRNA核苷酸序列,分别构建其系统进化树,分析其系统进化关系。结果表明,18株鸭疫里默氏杆菌OmpA基因分为2个群,其同源性分别为86%~99.2%和92.6%~100%。18株鸭疫里默氏杆菌16S rRNA基因同属1个群,同源性高达96.1%~100%。 RA-1、RA-2、RA-11和RA-39 4株分离株的OmpA基因位于进化树的同一个亚群,其16S rRNA基因也位于进化树的同一亚群,两者呈现出明显的相关关系,其他14株分离株的OmpA基因系统进化树与16S rRNA基因系统进化树无明显的相关关系。     

血清2型鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白多肽的组成及免疫原性

采用超声波裂解和超速离心法提取血清 2型鸭疫里默氏杆菌 (RA)的外膜蛋白 ,在透射电镜下观察 ,外膜蛋白呈典型的双层泡状结构 ,形态主要呈 O型或牙齿状或不规则的小碎片。SDS- PAGE电泳分析 ,血清 2型 RA的外膜蛋白由 11条多肽组成 ,相对分子质量 (Mr)在 2 6 0 0 0～ 135 0 0之间 ,主要蛋白为 310 0 0、330 0 0、75 0 0 0、10 10 0 0和 116 0 0 0 ,其相对百分含量分别为 16 .97%、15 .14 %、13.97%、19.83%和 12 .6 9%。经免疫印迹证实 ,血清 2型 RA的 4 0 0 0 0外膜蛋白与免疫鸭血清呈较强的阳性反应 ,是主要免疫原蛋白。用分离的外膜蛋白加上弗氏佐剂制备的亚单位疫苗免疫雏鸭后 ,可诱导产生较强的抗体 ,免疫鸭对同源 RA菌株的攻击可产生 10 0 %的免疫保护     

鸭疫里默氏杆菌病的血清型与防治研究进展

综合当前对该鸭疫里默氏杆菌（RA）的血清型、流行病学、临床诊断和防治等方面的研究进展,为养鸭生产中防治RA的感染提供较为全面的参考资料,主要包括临床诊断、药物使用、免疫接种等。     

鸭疫里默氏杆菌siderophore基因的克隆与表达

根据鸭疫里默氏杆菌全基因组序列,设计一对特异性引物,扩增了siderophore基因序列,克隆至pGEM-Teasy载体后进行序列测定及分析。结果表明,阅读框架全长为729bp,编码243个氨基酸。将该基因克隆到原核表达载体pET-28a后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析结果显示,已成功表达28ku的融合蛋白。     

徐州地区鸭疫里默氏杆菌病的药物防治试验

分别选用中草药复方制剂与高敏感抗茵药对确诊为RA感染的各2个鸭场进行治疗观察。都取得了良好的治疗效果,其中使用抗茵药鸭场的治愈率都在93％左右,采用中草药鸭场的治愈率为85％以上。     

鸭疫里默氏杆菌GroEL蛋白的原核表达和单克隆抗体制备

本试验旨在研制鸭疫里默氏杆菌GroEL蛋白的单克隆抗体。将鸭疫里默氏杆菌WJ4菌株的groEL基因进行原核表达,重组蛋白经过纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经过3次免疫后,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,用间接ELISA筛选阳性细胞株并进行3次亚克隆后制备小鼠腹水单克隆抗体。共获得2株稳定分泌鸭疫里默氏杆菌GroEL单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G2B6和1G2F10。2株单克隆抗体均为IgG1亚类。腹水单克隆抗体ELISA效价达到1:102 400。Western blot检测结果表明2株单克隆抗体均能与鸭疫里默氏杆菌血清1、2和10型菌株发生特异性结合,而与禽致病性大肠杆菌、沙门氏菌和禽巴氏杆菌菌株无反应性。本研究成功制备了稳定性好、特异性强的鸭疫里默氏杆菌GroEL单克隆抗体,为进一步研制基于抗体检测鸭疫里默氏杆菌抗原的试剂盒奠定了基础。     

3株鸭疫里默氏杆菌OmpA单克隆抗体的制备及特性鉴定

鸭疫里默氏杆菌(RA)病,是家禽中主要的细菌性传染病之一,血清型复杂且各血清型间缺少交叉免疫保护,其中血清1型、2型、10型是国内优势血清型。外膜蛋白A(OmpA)是RA的毒力因子之一,在不同血清型RA中保守性良好。用OmpA蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,与骨髓瘤细胞SP2/0融合后用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,腹腔注射BALB/c小鼠制备单克隆抗体。通过间接ELISA检测单克隆抗体效价及稳定性,秋水仙素法进行染色体分析,Western blot和玻片凝集试验鉴定单克隆抗体特异性。获得3株稳定分泌抗RA OmpA的单克隆抗体,分别命名为2D5、2A6、4H8;3株单克隆抗体的亚型均为IgG2a,腹水效价均为1∶2 048 000,均与鸭疫里默氏杆菌血清1型RA-CH3、血清2型RA-NJ3、血清10型RA-HXb2发生特异性反应,而与其他禽源致病菌不发生交叉反应。本研究成功研制的3株单克隆抗体具有良好的菌种特异性,有助于RA致病机理和RA快速诊断试剂盒的研制。     

鸭疫里默氏杆菌病疫苗研究进展

鸭疫里默氏杆菌病是危害水禽养殖健康发展的主要疫病,本文从疫苗的应用类型及免疫机理两方面对该病疫苗近年来相关研究进行了综述.     

鸭疫里默氏杆菌研究现状

为调查鸭疫里默氏杆菌的研究现状,方法：综述了鸭疫里默氏杆菌的诊断方法、致病机理、疫苗研制、耐药性现状以及药物防治方面取得的重大成果,结果：发现各方面研究成果显著,总结：提出检测不同地区RA的优势血清型和耐药性,成为一项常态化的工作。     

鸭疫里默氏杆菌OmpA基因的克隆与表达

利用本实验室分离、鉴定并保存的鸭疫里默氏杆菌血清1型湖北云梦分离株（RA-YM）,根据GenBank上的序列设计了1对引物,用PCR方法扩增了RA-YM株的主要外膜蛋白OmpA基因,并克隆到pMD18-T载体,序列测定结果表明OmpA基因全长1152bp,序列同源性分析表明该基因相当保守,与其他不同RA菌株OmpA基因之间的核苷酸序列同源性为93%～97%。用pGEX-KG构建了原核表达载体pKG-OmpA,在大肠杆菌中进行了高效表达,表达蛋白约占菌体总蛋白的30%,主要为包涵体形式。SDS-PAGE电泳结果显示表达的融合蛋白大小约为68000,Western-blot结果表明该表达蛋白具有抗原性。     

鸭疫里默氏杆菌免疫原性研究

本研究对Ｉ型鸭凤里默氏杆菌的荚膜提取物的免疫的性进行了研究,结果表明,荚且提物和经过苯酚抽纯化后的荚膜提取物经２次免疫７日龄北京鸭后对同源细菌的攻毒保护率分别为９０％和７０％;采用ＥＬＩＳＡ检测荚膜提取物免疫后抗体产生的免疫组,前者抗体下降速度较后者慢。     

浅谈鸭疫里默氏杆菌病及其防控措施

鸭疫里默氏杆菌病又称鸭传染性浆膜炎,由鸭疫里默氏杆菌引起,是一种急性、慢性细菌性传染病。各日龄阶段鸭均能感染,2～3周龄鸭感染后死亡率最高。鸭场一旦发病,细菌可长期存在,很难根除,给养鸭业造成了严重的经济损失。文章综述了鸭疫里默氏杆菌的病原、流行病学、临床症状、病理变化、诊断及防控措施,以期为鸭疫里默氏杆菌病的防控提供参考。     

鸭疫里默氏杆菌病原及其防控关键技术研究

文章回顾了鸭疫里默氏杆菌的病原鉴定、主要抗原、耐药机制等若干基础问题的研究进展,分析了鸭疫里默氏杆菌全基因组测序工作的完成对进一步深入开展致病机理研究和疫苗研发的重要意义。同时,从我国水禽生产的角度对鸭疫里默氏杆菌病的防控关键技术进行了详细阐述。     

鸭疫里默氏杆菌明胶酶的纯化及特性分析

为阐明鸭疫里默氏杆菌明胶酶的特性,试验以液化明胶的AF株为研究对象,纯化了其明胶酶,并对该酶进行热稳定性、蛋白化学修饰剂抑制作用、金属离子及络合物的影响和致病性等特性分析。结果表明,鸭疫里默氏杆菌AF株的培养上清经超滤浓缩、70%硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、疏水柱层析和凝胶柱层析,可获得纯化的明胶酶,SDS-PAGE显示单条带,相对分子质量约59000。该酶在65℃迅速失活,Cu2+、Cd2+、Mn2+、Hg2+对酶活性有强烈的抑制作用,络合物EDTA和EGTA的抑制作用可被Ca2+逆转,PMSF、NBS和AAD可抑制其活性。明胶酶对雏鸭具有毒力,能缩短鸭疫里默氏杆菌致病菌株感染的潜伏期和致死动物的时间,显著提高动物的死亡率。以上结果表明,鸭疫里默氏杆菌明胶酶是一种具有致病作用的金属蛋白酶。     

鸭疫里默氏杆菌疫苗研究进展

文章对目前国内外研制的鸭疫里默氏杆菌疫苗,包括灭活疫苗、弱毒活疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗等研究情况进行综述,分析各种疫苗的优缺点,指出今后的研究方向,为鸭疫里默氏杆菌病的免疫防控提供参考。     

2型鸭疫里默氏杆菌的分离

从北京地区两个发病的鸭场中分离到两株细菌,经过染色,生化鉴定,凝集试验和琼扩试验,鉴定为２型鸭设里默氏杆菌,经过致病性试验,其中一株有很强烈致病性,另一株在实验室条件下,人工感染小鸭未能引起小鸭发病。     

鸭疫里默氏杆菌研究进展

我国是水禽养殖量及相关产品消费的第一大国.鸭疫里默氏杆菌是水禽的一种重要细菌性病原,主要导致10～50日龄的雏鸭发病,给水禽的健康养殖带来了较大的经济损失.本文针对该病原的流行病学、病原学、耐药性及当前的疫苗研究工作进行了概述,期望对鸭疫里默氏杆菌的科学用药、新型疫苗研发和疾病的综合防控提供一定的理论基础.     

鸭疫里默氏杆菌病的防治

鸭浆膜炎是由鸭疫里默氏杆菌引起的传染病，该菌有21个血清型。本试验通过对发病鸭的临床诊断和病原进行分离鉴定。用本场的菌株制作灭活苗进行预防免疫，取得了很好的防治效果，保护率高达90％以上。