养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)腹水病的病原多样性及其耐药性分析

为了解引起养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)腹水病的病原多样性及其耐药性情况,针对2002-2010年由不同地区病样分离的27株细菌性病原进行了16S rDNA鉴定,并采用K-B法测定了27株细菌对22种抗生素的耐药性,分析了病原菌的耐药谱及耐药率变化.结果显示,大菱鲆腹水病病原菌主要有大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas espejiana).山东青岛地区以大菱鲆弧菌为主,威海地区以迟钝爱德华氏菌为主,烟台地区菌株种类分布平均.5类细菌对青霉素类、头孢菌素类、大环内酯类、复方新诺明耐药率高于50％.只有1株迟钝爱德华氏菌对氟苯尼考产生了耐药,其余菌株对其均没有耐药性,且在长期使用中不易产生耐药性,证实氟苯尼考为当前防治腹水病的一种良好抗菌药物.27株病原菌的耐药谱数量为27个,每个菌株具备自己独特的耐药谱,74.1％的菌株对10种以上的抗菌药物产生了耐药性,均有多重耐药性.     

发病鲆鲽类分离菌株的16S rRNA基因测序分析

细菌性疾病是中国海水养殖鲆鲽类的主要病害,为全面了解病原菌种类,本研究对1999~2012年从山东、江苏、河北、天津等沿海地区养殖场发病鲆鲽鱼类中分离得到的124株优势菌株进行了16S rRNA基因测序和系统发育学分析。将基因序列与GenBank核酸序列数据库进行相似度比对分析,结果显示,有83株与弧菌属(Vibriosp.)细菌相似度最高,11株与气单胞菌属(Aeromonas sp.)细菌相似度最高,4株与爱德华氏菌属(Edwardsiella sp.)细菌相似度最高,26株为其他15种属的细菌。根据系统发育学分析结果,进一步将66株菌鉴定为16个种,优势种为溶藻弧菌(V.alginolyticus)、哈氏弧菌(V.harveyi)、鳗弧菌(V.anguillarum)、杀鲑气单胞菌(A.salmonicida)和迟缓爱德华氏菌(E.tarda)。选择其中的9株鳗弧菌和4株迟缓爱德华氏菌进行人工感染实验,结果显示,其中7株鳗弧菌和3株迟缓爱德华氏菌对大菱鲆(Scophthalmus maximus)有较强的致病性。研究结果可为阐明中国海水养殖鲆鲽类的流行病发生历史、病原种类、病原监测及疾病控制提供重要参考。     

“大菱鲆迟钝爱德华氏菌活疫苗”获批兽药产品批准文号并投入应用

<正>迟钝爱德华氏菌引起的腹水病是海水养殖鲆鲽类的一种严重病害,给我国大菱鲆养殖业带来了严重损失。通过863计划海洋技术领域五年的支持,华东理工大学科研团队通过病原基因组和致病机制的基础研究、高效疫苗分子设计和评价的关键技术、疫苗应用规程和规模示范的疫苗开发全链条创新,研制出针对迟钝爱德华氏菌的大菱鲆迟钝爱德华氏菌活疫苗(EIBAV1株),并于2015年获颁国家新兽药一类注册证书。这是我国注册的第一个海水养殖动物活疫苗,也是世界上第一个获得政府许可的针对迟钝爱德华氏菌的鱼用疫苗。2016年12     

迟钝爱德华氏菌耐药表型及4种耐药基因检测

从7起牙鲆迟钝爱德华氏菌感染病例中分离到130株致病菌,每个病例挑选5株共计35株,用K-B纸片扩散法检测其耐药表型;用PCR方法检测!-内酰胺类TEM基因、氨基糖苷类ant(3")-Ⅰ基因、磺胺类Sul3基因和四环素类tet(A)基因,分析耐药基因与耐药表型间的关系,以查明牙鲆源致病性迟钝爱德华氏菌不同类型常见耐药基因的携带状况,探讨耐药基因与耐药表型之间的相关性。结果显示,所检的35株迟钝爱德华氏菌均携带TEM基因和ant(3")-Ⅰ基因,62.9%(22/35)携带Sul3基因,未检出tet(A)基因;所有菌株均具有多重耐药性,大部分菌株耐抗菌类药物达7~9种;耐药基因的携带与耐药表型间存在较密切的相关性,但并非完全对应。     

养殖大菱鲆爱德华氏菌病的研究

2004年5月至2005年9月间,先后对潍坊、烟台、威海和青岛等沿海区域养殖的大菱鲆自然发生的6宗爱德华氏菌感染病例进行了流行病学、病原分离鉴定和组织病理学等方面的调查研究。根据分离菌株的形态、生理生化特性,并结合16S rDNA序列分析,将其鉴定为迟钝爱德华氏菌 (Edwardsiella tarda)。人工感染实验证实该菌为大菱鲆爱德华氏菌病的致病菌。大菱鲆迟钝爱德华氏菌病具有急性和慢性两种感染形式。迟钝爱德华氏菌感染可引起大菱鲆肾脏、脾脏、肝脏、肠、鳃、皮肤等器官组织发生不同程度的病理变化,其显著特点是单核巨噬细胞增生,使得各器官组织出现巨噬细胞浸润现象。病鱼的组织病理变化以肾脏最为明显,包括巨噬细胞大量增生,多发性局灶坏死伴有渗出性炎症反应以及肉芽肿的产生;肾脏外观则显示异常膨大,正常组织转变为白色脓疡或豆腐渣状。本文属国内首次报道爱德华氏菌感染大菱鲆致病,为该鱼类的健康养殖和疾病防治提供参考和依据。 关键词：大菱鲆;迟钝爱德华氏菌;细菌鉴定;组织病理学;16S rDNA     

大菱鲆源杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)的分离鉴定

从患腹水病大菱鲆Scophthalmus maximus的肝脏中分离到一株优势细菌G1,经人工感染实验表明G1为引发大菱鲆腹水病的致病菌,且半致死浓度为LD50=1.21×105 CFU·g-1。采用常规的生理生化鉴定方法及分子生物学方法对G1进行分析,结果表明,G1的16SrRNA基因序列与杀鱼爱德华氏菌Edwardsiella piscicida的同源性达100%,系统发育分析表明菌株G1与杀鱼爱德华氏菌分支聚为一支,结合生理生化鉴定结果确定G1为杀鱼爱德华氏菌。药敏试验表明菌株G1对头孢曲松、环丙氟哌酸、左氧氟沙星等8种抗菌药物高度敏感。     

2012年～2014年南海海水养殖鱼类病原菌哈维弧菌分离株的耐药性分析

哈维弧菌(Vibrio harveyi)是海水养殖鱼类主要的病原菌,给养殖业带来了巨大的损失.该研究采用K-B法对南海地区沿岸养殖鱼类90株哈维弧菌分离株进行抗生素耐药性分析,通过系统聚类法以平方Euclidean距离来分析菌株间的耐药性同类关系,探讨哈维弧菌耐药性的时空分布和耐药谱的多样性.结果显示,90株哈维弧菌共有耐药谱26种,谱型丰富度为28.9％.其中,多重耐药谱(耐3类及以上抗生素)21种,包含菌株共35株,占总菌株数的38.9％,谱型丰富度为80.8％.从时间分布上看,2012年、2013年和2014年分别具有10、18和8种耐药谱型;从地区分布上看,海南、广东和广西3个地区分别包含17、13和2种耐药谱型,时间与地区的耐药谱型差异明显.90株哈维弧菌样本聚类分析得到Group Ⅰ、GroupⅡ和其他组群,分别含有11、12和4种耐药谱,耐药谱型率分别为16.9％、57.1％和100％,而Group Ⅰ和GroupⅡ组群进而分为5个亚群i～v.结果表明,在广东、海南和广西地区养殖鱼类中所分离到的哈维弧菌耐药谱具有复杂多样性特征,随着时间年份的递增,哈维弧菌耐药谱种类也发生着更新变化,耐药谱不断扩大延伸.     

牙鲆腹水病病原免疫血清的制备和纯化试验研究

用迟钝爱德华氏菌免疫家兔,制备出高效价迟钝爱德华氏菌免疫血清.先制备迟钝爱德华氏菌抗原, 耳缘静脉注射免疫家兔.经微量反应板法检测血清效价, 效价达到1 ∶ 2560;用Millipore Montage抗体纯化试剂纯化抗体,纯化的抗体经SDS-PAGE电泳,杂带较少,条带主要集中于50 kD处;用斑点酶联免疫吸附试验检测时, 迟钝爱德华氏菌呈阳性, 温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、河流弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、腐败希瓦氏菌、产碱普罗威斯登菌、阪崎肠杆菌和大肠杆菌均呈阴性.试验结果表明,特异、高效价的迟钝爱德华氏菌免疫血清,为快速检测牙鲆腹水病病原奠定了基础.     

迟钝爱德华氏菌对牙鲆半致死浓度的测定

腹水病是牙鲆常见的细菌疾病之一,具有感染率高、死亡严重、流行速度快、前期症状不明显,难以防治等特点,给我省的牙鲆养殖业造成很大的损失.本实验中用迟钝爱德华氏菌对牙鲆进行了感染实验,被感染的牙鲆出现了腹水病相似的症状,表明迟钝爱德华氏菌是牙鲆腹水病病原之一.迟钝爱德华氏菌对牙鲆的半致死浓度为2.1×105 CFU/mL.     

养殖大菱鲆的爱德华氏菌病

2004年5月至2005年9月间,先后对潍坊、烟台、威海和青岛等沿海区域养殖的大菱鲆自然发生的6宗爱德华氏菌感染病例进行了流行病学、病原分离鉴定和组织病理学等方面的调查研究。根据分离菌株的形态、生理生化特性,并结合16S rDNA序列分析,将其鉴定为迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。人工感染实验证实该菌为大菱鲆爱德华氏菌病的致病菌。大菱鲆迟钝爱德华氏菌病具有急性和慢性两种感染形式。迟钝爱德华氏菌感染可引起大菱鲆肾脏、脾脏、肝脏、肠、鳃、皮肤等器官组织发生不同程度的病理变化,其显著特点是单核巨噬细胞增生,使得各器官组织出现巨噬细胞浸润现象。病鱼的组织病理变化以肾脏最为明显,包括巨噬细胞大量增生,多发性局灶坏死伴有渗出性炎症反应以及肉芽肿的产生;肾脏外观则显示异常膨大,正常组织转变为白色脓疡或豆腐渣状。本文属国内首次报道爱德华氏菌感染大菱鲆致病,为该鱼类的健康养殖和疾病防治提供参考和依据。     

辽宁省大菱鲆源弧菌的药物敏感性分析(上)

正随着养殖规模的扩大、养殖密度的不断增加、饲养频率的提高以及养殖环境质量的不断下降,大菱鲆在养殖过程中也产生了许多疾病,例如细菌病、病毒病、寄生虫病等。其中,细菌病是我国大菱鲆养殖中受到损害最严重的一类疾病,据报道,我国大菱鲆养殖各种致病菌主要有大菱鲆弧菌、迟钝爱德华氏菌、鳗弧菌、鱼肠道弧菌、溶藻弧菌、大菱鲆源副溶血弧菌等,常引起鱼类的败血症、鱼皮下出血、鳞片黏膜脱落、鳍基部充血、溃烂症、腹水症、肠道白浊、肠黏膜腐烂脱落等,导致鱼的大量死亡,造成重大经济损失。     

红鳍东方鲀体表溃烂病优势菌的分离、鉴定及治疗

2021年11月，辽宁大连某养殖场红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)出现死亡。通过对患病红鳍东方鲀病灶部位进行细菌分离培养、细菌革兰氏染色、以及细菌16S rDNA序列分析，从患病红鳍东方鲀中共分离出3株优势菌且均为弧菌，分别为哈维弧菌(Vibrio harveyi)、大菱鲆源弧菌(V.scophthalmi)、费氏弧菌(Aliivibrio fischeri)。药敏检测结果表明，费氏弧菌对复方新诺明、氟苯尼考、多西环素3种抗生素敏感；大菱鲆源弧菌仅对恩诺沙星敏感；哈维弧菌对环丙沙星、复方新诺明、氟苯尼考、多西环素、恩诺沙星5种抗生素敏感。3种优势菌对16种抗生素的药物敏感实验结果表明3种优势菌均为多重耐药菌。结合药敏实验结果与相关研究，推荐联合多西环素与山苍子植物精油对红鳍东方鲀体表溃烂病进行防治。     

日本鳗鲡败血腹水病病原研究

2000年3月中旬，自福建仙游某日本鳗鲡（Anguilla japonica)养殖场患败血腹水症的发病日本鳗鲡的肝脏及腹水处分离到四株细菌，经鉴定其中一株为迟钝爱德华氏菌（dwardsiella tarda)，一株温和气单胞菌（Aeromomas sobria)和两株嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila)溶血试验，小鼠攻毒试验显示，上述四株细菌都有较强制 毒力，综合分析，上述菌株可能是引发这次日本幼鳗败血腹水病之病原菌。     

一株广温性大菱鲆肠道益生菌的筛选与鉴定

从健康的大菱鲆肠道内分离细菌,以大菱鲆致病菌鲨鱼弧菌Vibrio archariae和大菱鲆弧菌Vibrio scophthalmi为指示菌,根据拮抗作用原则,分离得到一株菌TYTG-1.根据菌株的形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析,菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis.从养殖大菱鲆肠道中分离获得枯草芽孢杆茵在国内属首次报道.该株茵在4～42℃均能生长,属广温性.经过28d的投喂添加浓度为107和109CFU/g枯草芽孢杆菌的饲料,大菱鲆生长正常,未产生不良反应.该株枯草芽孢杆茵对引起大菱鲆腹水病和肠炎病的两株致病弧茵具有良好的拮抗作用,其具有较大潜力作为肠道益生菌应用于大菱鲆的养殖.     

5株鲆鲽鱼类病原菌多克隆抗体的制备与应用

本研究制备了鳗弧菌Vibrio anguillarum、杀鲑气单胞菌Aeromonas salmonicida、副溶血弧菌V. parahaemolyticus、哈维氏弧菌V. harveyi和腐败希瓦氏菌Shewanella putrefaciens 5株鲆鲽鱼类病原菌的兔抗血清,建立了5种菌的间接ELISA检测方法,并将该检测方法用于鱼类细菌分离物病原检测。人工感染结果显示,5株菌对大菱鲆的半数致死量(LD50)在102~107CFU/fish;制备的兔抗血清效价分别为1∶2 048 000、1∶16 000、1∶16 000、1∶1 024 000、1∶128 000;交叉反应结果显示,鳗弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌3株弧菌与抗血清相互之间存在交叉反应;抗血清特异检测灵敏度分别为104、108、107、105、106cell/ml;对13株海水鱼类细菌分离物进行检测,有1株腐败希瓦氏菌阳性,两株哈维氏弧菌阳性;1株副溶血弧菌和哈维氏弧菌均为阳性,该结果与16S rDNA序列的分子分析方法一致。     

加州鲈迟缓爱德华氏菌病的检测和防治

以江苏省吴江市八坼镇区域养殖场加州鲈鱼病鱼的细菌性病原体为研究对象。通过分离纯化,形态学观察,结合16S rRNA基因序列同源性检索,对该病原菌进行初步判断。同时进行药敏实验,了解该病原菌对各种抗生素的耐药性和敏感程度。研究结果:分离纯化得到2株纯菌株L2F和L2P2,革兰染色均呈红色,阴性杆状菌。16S rDNA序列分析,L2F和L2P2菌株与迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的同源性达99%。初步判断该菌为迟缓爱德华氏菌。药敏实验结果,该菌对磺胺异恶唑、链霉素和利福平等药物不敏感或耐药,对左氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、强力霉素、氟苯尼考、头孢哌酮相对敏感。     

养殖牙鲆致病性弧菌的鉴定及药敏分析

2020年丹东东港市某养殖厂养殖1龄牙鲆(Paralichthys olivaceus)突发病害,表现为腹水病症状。取患病的5尾养殖牙鲆的鳃、肝、脾、肠道、腹水为材料进行细菌分离及纯培养,选择优势菌株通过全自动细菌分析仪及16S rDNA序列分析对该菌株进行鉴定,结果表明分离纯培养的14株菌(DS200401-DS200414)共鉴定出2种,其中1种为该病的致病菌:弧菌属灿烂弧菌(Vibrio splendidus)。随后进行人工感染试验和药敏试验。用12种抗菌药物对3种菌进行药敏试验,结果显示在不同菌株间无明显的敏感与耐药性差异。     

水产动物6种主要病原菌与抗血清的免疫交叉反应

采用ELISA、试管凝集、Western-blot等方法,分析了鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(V. harveyi)、溶藻胶弧菌(V. alginolyticus)、副溶血弧菌(V. paraheamolyticus)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和荧光假单胞菌(Psedomonas fluorescens)等水产养殖中主要病原细菌与抗血清之间的免疫交叉反应.结果表明,弧菌属细菌之间的交叉反应程度比较大,而与其他两属的细菌之间存在的交叉反应程度小,或不存在交叉反应;Western-blot分析结果显示,哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌和副溶血弧菌抗血清分别与其他3种弧菌在分子量为135.6 kD和121.5 kD;95.6 kD,48.4 kD,39.2 kD和34.9 kD;55.1 kD的蛋白带处存在交叉反应,而这些分子量的蛋白带与其他两属的抗血清均不发生反应.     

迟缓爱德华氏菌间接ELISA快速检测法

以迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)WY28作为抗原,免疫新西兰兔,获得效价为1:2 048的多克隆抗体;以此多克隆抗体作为-抗,山羊抗兔IgG-HRP作为酶标二抗,建立迟缓爱德华氏菌的间接EIJSA快速检测法.采用棋盘滴定法确定抗原与一抗的最佳工作浓度分别为106 CFU·mL-1和1:10 000;酶标二抗的最适工作浓度为1:1 000.病原菌检测灵敏度为每孔103 CFU.该方法标准化后具有快速、灵敏等特性,与肠杆菌科其他细菌参考菌株无交叉反应,具良好的特异性.对养殖场发病大菱鲆(Scophthalmus maximus)和半滑舌鳎中分离的细菌菌株进行检测,从56株分离菌株中检测出27株迟缓爱德华氏菌,阳性检出率为48.2%.该方法的建立有助于快速准确地诊断由迟缓爱德华氏菌引起的养殖鱼类病害.     

中华绒螯蟹“腹水病”及“抖抖病”并发病病原的研究

于1998～1999年对中华绒螯蟹主要细菌性疾病“腹水病”、“抖抖病”并发病病原进行研究。结果表明经细菌学鉴定6株病原菌,其中5株为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila),1株为拟态弧菌(Vibrio mimicus),用细菌人工感染蟹,其LD