亮甲酚蓝染色法筛选卵母细胞对牛体细胞克隆胚体外发育的影响

为探索用亮甲酚蓝染色法筛选卵母细胞是否有利于牛体细胞克隆胚的体外发育,将采集的卵母细胞分成3组:对照组,采集后的卵母细胞直接放入成熟液培养,不用亮甲酚蓝处理;控制对照组,卵母细胞于PBS 中放置90 min后放入成熟液中培养;试验组,将采集的卵母细胞在含有26 μmol/L亮甲酚蓝的PBS中放置90 min.然后将处理过的卵母细胞根据着色情况分为两组,即BCB+(胞质呈蓝色,成熟卵母细胞)和BCB-(胞质未着色,生长期卵母细胞).各组卵母细胞24 h体外成熟培养,统计各组卵母细胞成熟率.分别用成熟后的各组卵母细胞用于细胞核移植,统计体细胞核移植的卵裂数、囊胚数和囊胚细胞数.结果表明,BCB+组卵母细胞的成熟率明显高于BCB-组卵母细胞的成熟率(74.0%,53.4%),差异显著(P<0.05).BCB+组的囊胚率(45.0%)与对照组、控制对照组和BCB-组的囊胚率(34.9%,36.4%和5.2%)相比差异显著(P<0.05).另外BCB+组的囊胚细胞总数(114.5±7.5)较其他组差异显著(P<0.05).表明通过亮甲酚蓝染色法筛选出成熟的高质量牛卵母细胞用于体细胞核移植,可以获得更高的克隆囊胚率.     

牛卵泡卵母细胞冷冻保存后发育潜力的研究

对用３种不同方法（Ａ法：１．０ｍｏｌ／Ｌ甘油平衡，从２０℃开始以１℃／ｍｉｎ的速度降至－℃，植冰，１０ｍｉｎ后以０．３℃／ｍｉｎ降至－３０℃，再以０．１℃／ｍｉｎ降至－３３℃，投入液氮；Ｂ法：１．６ｍｏｌ／Ｌ丙二醇＋０．ｌｍｏ１／Ｌ蔗糖平衡，５℃冰箱中保存１５ｍｉｎ，从Ｏ℃开始按Ａ法中的程序降温；Ｃ法：即玻璃化法）冷冻保存的牛ＧＶ期卵母细胞的发育潜力进行了研究。解冻后，Ｃ组卵母细胞形态正常率显著高于Ａ、Ｂ两组。３种方法冷冻的卵母细胞成熟培养后，平均卵丘扩展率为６０％，其中Ｃ组最高（６９．９％）。卵丘扩展的卵母细胞中，７９．３％发生ＧＶＢＤ，但大多数没有达到ＭＩ期。３组冷冻卵母细胞的体外成熟率、体外受精率分别为１４．２％、８．３％、２０．０％和１０．０％、７．１％、１２．１％，其中Ａ组中有１枚卵裂。     

影响牛卵母细胞体外发育能力的因素

本文重点从三个方面探讨了影响卵母细胞成熟发育能力的制约因素：（1）通过分析卵母细胞核成熟和胞质成熟的过程及成熟时各细胞器的状态，指出在体外培养系统中卵母细胞的核成熟，并不代表胞质的成熟，推迟卵母细胞减数分裂的恢复能够有效促使胞质成熟；（2）针对母牛卵巢的功能结构和形态变化，卵泡发育程度及母牛发情周期的不同阶段等有关内容的实验材料，分析了卵泡发育过程中的几种关键因素对卵母细胞发育能力的影响，为了获得较多具有发育潜力的卵母细胞，提出了采集母牛卵巢的适宜情期阶段；（3）根据卵母细胞发育的不同的阶段，提出改善培养体系能提高卵母细胞的发育力。     

山羊活体采卵的理论基础

对山羊卵泡发育模式的了解和人工调控是开展活体采卵的基础，文章综述了山羊卵泡发育模式及垂体促性腺激素对卵泡发育的调控。     

玻璃化冷冻牛卵母细胞单精子注射后体外发育能力的研究

实验研究了不同成熟培养时间的牛卵母细胞玻璃化冷冻及胞质内单精子注射(ICSI)后的受精效果。结果表明:成熟后的新鲜牛卵母细胞按照ICSI注射方法穿刺而不注射精子组与未经穿刺的对照组相比,孤雌激活后的卵裂率、囊胚发育率及囊胚细胞数无显著差异(P>0.05);成熟培养16h(MⅠ)和23h(MⅡ)卵母细胞冷冻解冻后形态正常率均显著低于新鲜对照组(76.66%、87.33%vs100.0%)(P<0.05),冷冻解冻后二者分别成熟培养至24h,ICSI后胚胎的囊胚发育率(5.29%、14.41%)显著低于新鲜对照组(24.40%)(P<0.05);成熟培养23h与成熟培养16h的卵母细胞冷冻解冻后形态正常率及ICSI后囊胚发育率(14.41%vs5.29%)均有显著性差异(P<0.05)。实验证明,ICSI操作不会影响卵母细胞发育潜力;玻璃化冷冻影响卵母细胞解冻后形态正常率以及ICSI后胚胎的发育能力;成熟培养23h比16h的卵母细胞冷冻保存后经ICSI的胚胎发育潜力高。     

发育阶段对牛卵泡卵母细胞冷冻效果的影响

研究了用3种不同方法（A法：程序冷冻法：B法：超快速冷冻法；C法：玻璃化冷冻法）冷冻保存的牛GV期和IVM卵母细胞的发育潜力，结果表明，无论采取哪种方法。GV期卵母细胞的发育潜力均显著低于IVM卵母细胞。三种冷冻方法中，以玻璃化冷冻为最佳。     

山羊活体采卵及卵母细胞体外受精研究

选择健康空怀山羊母羊,随机分组,分别用PMSG1000u和FSH325~375u超数排卵处理,研究利用外源激素进行超排对山羊活体采卵效果的影响,比较活体采集与屠宰场采集的卵母细胞体外受精效果。结果表明,经超排处理后,卵巢明显增大,同时提高了采集卵母细胞的数量和质量。用FSH超排,≥2mm的卵泡数为23.00个±5.69个,采集卵母细胞数为12.67枚±4.06枚,极显著大于对照组(P<0.01)。活体采集的卵母细胞的体外成熟率及受精率分别为44.44%和33.33%,均略高于从屠宰场获取卵巢采集的可用卵泡卵母细胞,但差异不显著(P>0.05)。     

牛GV期卵母细胞冷冻保存后发育潜力的研究

二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇(PROH)、乙二醇(EG)和甘油(GL)4种冷冻保护剂程序化冷冻牛GV期卵母细胞的结果表明,EG和PROH的保护效果比GL和DMSO好。4种不同冷冻方法冷冻保存牛GV期卵母细胞,比较解冻后卵母细胞的体外成熟率、受精后卵裂率。结果表明,在程序化冷冻法与细管玻璃化法(Straw)之间的差异不显著(P>0.05),在开放式拉管法(OPS)与毛细玻管法(GMP)之间的差异不显著(P>0.05);但OPS和GMP与程序化冷冻法和Straw之间的差异极显著(P<0.01)。玻璃化冷冻效果优于程序化冷冻。说明GMP和OPS玻璃化冷冻优于Straw玻璃化冷冻。说明可以采用GMP方法冷冻保存牛GV期卵母细胞。     

糖对牦牛卵母细胞体外成熟及其发育能力的影响

试验旨在研究不同种类、不同浓度的糖对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的影响,进一步探索和优化牦牛卵母细胞培养体系,提高卵母细胞体外成熟和胚胎生产效率。在牦牛卵母细胞成熟液中添加不同浓度（0、5和10 mmol/L）的葡萄糖或蔗糖,培养24 h或预培养2 h后移入无糖培养基中继续培养22 h,统计卵母细胞体外成熟率及体外受精（IVF）后的胚胎卵裂率和囊胚率。结果显示,与对照组（0 mmol/L）相比,5和10 mmol/L葡萄糖组牦牛卵母细胞核成熟率和体外受精胚胎卵裂率均显著提高（P<0.05）,10 mmol/L葡萄糖组的囊胚率最高,且与对照组相比差异显著（P<0.05）。添加10 mmol/L蔗糖可以显著提高牦牛卵母细胞核成熟率（P<0.05）,但胚胎囊胚率与对照组相比差异不显著（P>0.05）。此外,用10 mmol/L葡萄糖预处理牦牛卵母细胞后其核成熟率、胚胎卵裂率和囊胚率最高,且均显著高于对照组（P<0.05）。由此可见,糖对牦牛卵母细胞体外成熟和发育有一定的影响,在成熟过程中添加适当浓度的糖能提高卵母细胞成熟率及体外受精胚胎发育能力。     

开放式拉长细管冷冻法对牛卵母细胞体外受精后发育的影响

在常规牛体外受精(IVF)技术的基础上,分别采用开放式拉长细管 (OPS,open pulled straw)法和细管法对未经成熟培养的卵丘卵母细胞(COCs)进行玻璃化冷冻,解冻后再进行体外成熟(IVM)、IVF和早期胚胎的体外培养(IVC)。结果表明,细管组和 OPS组的解冻后 COCs正常率分别为 59.4%±4.3%和 77.9%±4.1%(P<0 01);成熟率分别为48.2%±5.3%和66.0%±5.8%(P<0 01);卵裂率分别为18.5%±2.0%和32.8%±1.4%(P<0 01);8 细胞阶段的成功率分别为14.8%±2.5%和 24.8%±1.5%(P<0 01);桑椹胚发育率分别为 0 和5 3%±1.1%,明显低于未经冷冻的鲜卵组(21.0%±3.8%;P<0 01);囊胚发育率分别为0和4.0%,明显低于鲜卵组(P<0 01)。说明OPS玻璃化冷冻法可以使未经成熟培养的牛 COCs冷冻后获得桑椹胚和囊胚,但桑囊胚发育率仍较低,方法有待改进。     

Effect of Sugar on in vitro Maturation and Developmental Competence of Yak Oocytes

This study was designed to investigate the effect of different types and different concentrations of sugar on in vitro maturation(IVM) and developmental competence of yak oocytes, for being further research and optimization culture system of yak oocytes for efficient maturity yak oocytes and productivity of embryos. Immature yak oocytes were matured in vitro on culture medium with different concentrations (0,5 and 10 mmol/L) of glucose and sucrose in incubator for 24 h or 2 h pretreament with sugar and 22 h without sugar. Subsequently, then the maturation of oocytes,the cleavage rates and blastocyst formation rates after in vitro fertilization(IVF) were evaluated. The results showed that a medium with 5 and 10 mmol/L glucose IVM could significantly increase the yak oocytes maturation and cleavage (P<0.05), and the highest blastocyst formation rates in 10 mmol/L glucose group was significantly higher than 0 mmol/L glucose (P<0.05).10 mmol/L sucrose could increase significantly the nucleus maturation rates (P<0.05),and there was no significant difference of the blastocyst formation rates after IVF between 0 and 10 mmol/L sucrose (P>0.05). Furthermore, the nucleus maturation rates,IVF cleavage rates and blastocyst formation rates of yak oocytes which pretreated with 10 mmol/L glucose were the highest in these groups, and were higher than 0 mmol/L glucose (P<0.05). It manifested that the appropriate concentration of sugar could improve the quality of yak oocytes and embryos in vitro developmental competence, so it influenced in vitro development of yak oocytes indirectly.     

玻璃化冷冻对牦牛未成熟卵母细胞发育能力及COC转录组的影响

旨在探讨玻璃化冷冻-解冻对牦牛未成熟卵母细胞发育能力及卵丘-卵母细胞复合体（COCs）转录组的影响,为完善牦牛COCs冷冻保存技术提供理论依据。本研究将未经成熟培养的牦牛COCs进行玻璃化冷冻-解冻后分为2组,A组：COCs体外成熟（IVM）后用普通牛精子进行体外受精（IVF）,获得的受精卵在G-1胚胎培养液中培养72 h后转入G-2培养液培养96 h;B组：IVF后,受精卵在G-1培养液培养120 h后转入G-2培养液培养48 h;以未进行冷冻处理的新鲜COCs作为对照组（C组）：IVF后,受精卵在G-1培养液培养72 h后转入G-2培养液培养96 h。对牦牛新鲜COCs（n=3）和玻璃化冷冻-解冻的COCs（n=3）进行扩增、建库和转录组测序（RNA-seq）分析。结果发现,B组的卵裂率、囊胚率显著高于A组（P<0.05）,但A组和B组的卵裂率、囊胚率均显著低于C组（P<0.05）。以|log₂（fold change）|≥ 2,Q<0.05为阈值,牦牛冻融COCs相对于新鲜COCs共筛选出851个差异表达基因（DEGs）,其中上调846个,下调5个。GO分析表明,DEGs主要富集于生物过程、细胞组分和分子功能3大类;KEGG注释结果表明,DEGs富集到258条通路,其中16条通路显著富集（P<0.05）。研究表明,IVF后在G-1培养液中培养120 h可以提高牦牛玻璃化冷冻卵母细胞的后续发育能力;玻璃化冷冻影响牦牛COCs转录组,从而降低卵母细胞的发育潜力。该发现为完善牦牛COCs玻璃化冷冻技术提供了一定的理论基础。     

丁内酯-I对绵羊卵母细胞体外成熟及发育能力的影响

研究从丁内酯-I(BL-I)的浓度筛选、作用时间以及作用解除后的成熟培养时间等方面分别进行了试验,以观察其对绵羊卵母细胞核成熟的抑制程度以及对卵母细胞体外成熟及发育能力的影响。结果表明:150μmol/L的BL-I能将62.9%的卵母细胞抑制在GV期。BL-I抑制8、16 h和24 h后绵羊卵母细胞停滞在GV期的比率差异不显著(P>0.05);抑制24 h时卵裂率和囊胚率低于对照组,16 h的囊胚率也低于对照组,抑制8 h的卵裂率和囊胚率与对照组差异不显著(P>0.05)。去除抑制后卵母细胞的成熟能力不受影响。由此可得出,丁内酯-I能可逆性抑制绵羊卵母细胞的核成熟,但未能提高其发育潜力。     

生殖激素对奶水牛卵母细胞成熟及发育潜能的影响

本试验以屠宰场获取的奶水牛卵巢为试验材料,收集卵母细胞进行体外成熟培养(IVM)、体外受精(IVF)及早期胚胎培养(IVC)。研究激素(FSH、LH、E2、P4)的不同浓度对奶水牛卵母细胞成熟和早期胚胎发育的影响,以期探讨奶水牛卵母细胞成熟和早期胚胎体外培养发育机制,优选不同激素的最佳浓度。结果表明:添加FSH试验组奶水牛颗粒细胞扩散率和卵裂率高于未添加试验组(P<0.05);添加LH试验组奶水牛颗粒细胞扩散率、卵裂率及8-细胞率与未添加试验组比较,差异不明显(P>0.05);17β-E2试验组(1.0μg/mL)的奶水牛颗粒细胞扩散率、卵裂率及8-细胞率高于未添加试验组(P<0.05);添加P4试验各组(0.9μg/mL、1.2μg/mL)的颗粒细胞扩散率明显低于未添加试验组(P<0.01)。     

丁内酯-Ⅰ对绵羊卵母细胞体外成熟及发育能力的影响

研究从丁内酯-Ⅰ(BL-Ⅰ)的浓度筛选、作用时间以及作用解除后的成熟培养时间等方面分别进行了试验,以观察其对绵羊卵母细胞核成熟的抑制程度以及对卵母细胞体外成熟及发育能力的影响.结果表明:150μmol/L的BL-Ⅰ能将62.9%的卵母细胞抑制在GV期.BL-Ⅰ抑制8、16 h和24 h后绵羊卵母细胞停滞在GV期的比率差异不显著(P＞0.05);抑制24 h时卵裂率和囊胚率低于对照组,16 h的囊胚率也低于对照组,抑制8 h的卵裂率和囊胚率与对照组差异不显著(P＞0.05).去除抑制后卵母细胞的成熟能力不受影响.由此可得出,丁内酯-Ⅰ能可逆性抑制绵羊卵母细胞的核成熟,但未能提高其发育潜力.     

In vitro Developmental Competence of Adult Sheep Oocytes Treated with Roscovitine

The efficiency of in vitro sheep embryo production is still low compared to that observed in vivo and in other species. In this context, meiotic inhibition strategies emerged as a promising alternative to improve this biotechnology. So, this study aimed to evaluate, for the first time, the effects of roscovitine on in vitro maturation of sheep oocytes and their subsequent embryo development. For this, cumulus–oocyte complexes (COCs) were cultured for 6 h in the presence (Rosco) or absence (Control) of 75 μm roscovitine and, subsequently, in vitro matured (IVM) for 18 h with gonadotropins. At 0 (Immature), 6 and 24 h of culture, the nuclear status of oocytes was evaluated by Hoechst staining. Embryo cleavage and blastocyst formation were recorded 30 h after in vitro fertilization and on day 7 of culture, respectively. Blastocyst quality was evaluated by differential staining. At 6 h, the GV rate in the Rosco treatment (93.8%) was similar to that observed in the Immature oocytes (94.9%) and significantly higher compared to Control (41.3%). After IVM for 18 h, a high and similar proportion of oocytes from Rosco (93.6%) and Control (88.4%) reached the MII stage. In both treatments, approximately 70% of oocytes cleaved and 50% of them developed up to blastocyst. The mean percentage of blastocyst cells, embryoblast, trophoblast and pyknosis did also not differ between Control and Rosco. In conclusion, roscovitine, at the studied experimental conditions, was efficient to reversibly inhibit the meiosis of adult sheep oocytes without detrimental effect on development and quality of the in vitro produced embryos.     

The Effect of Species-Specific FSH Administration During In vitro Maturation of Bovine Oocytes on Embryonic Developmental Capability

Veterinary Research Communications -     

牛卵母细胞的玻璃化冷冻研究

本试验通过牛卵母细胞玻璃化冷冻过程中采用载体、冷冻时卵母细胞所带颗粒细胞层数和其成熟培养时间这3个方面对牛卵母细胞的玻璃化冷冻进行了探讨。(1)不同载体的对比:玻璃OPS管和塑料OPS管冷冻效果较好。玻璃OPS管冷冻卵母细胞,解冻后形态正常率、体外受精后卵裂率和囊胚率分别为91.2%、41.3%和14.52%。塑料OPS管冷冻卵母细胞,解冻后形态正常率、体外受精后卵裂率和囊胚率分别为89.09%、40.90%和14.54%。(2)保留2￣3层颗粒细胞的卵母细胞玻璃化冷冻的冷冻效果较好,其冷冻解冻后形态正常率、体外受精后卵裂率和囊胚率分别为90.79%、40.13%和15.13%。(3)体外成熟培养22h的卵母细胞冷冻效果较好,其冷冻解冻后形态正常率、体外受精后卵裂率和囊胚率分别为94.14%、41.80%和15.23%。