猪源大肠杆菌志贺样毒素2型突变体B亚基与LTB基因的融合与表达

猪水肿病的主要毒力因子是志贺样毒素的2型突变体(Stx2e),毒素的A亚基是有毒的酶活性单位,B亚基无毒,介导毒素与受体的结合。为了增加B亚基的免疫原性,采用重叠PCR将猪源志贺样毒素Ⅱ型突变体B亚单位(Stx2e B)连接至热敏肠毒素的B亚单位(LTB)成熟肽N末端,获得Stx2e B与LTB相连的融合蛋白基因Stx2e B-LTB。融合基因克隆到表达载体pQE30中,在IPTG的诱导下,融合基因在大肠杆菌中获得表达,表达量占细菌总蛋白的8%。融合蛋白的获得为猪水肿病基因工程亚单位疫苗的制备、猪水肿病的预防奠定了基础。     

大肠杆菌志贺样毒素Ⅱ型基因的分子克隆

本文克隆了含大肠杆菌志贺样毒素Ⅱ型基因的2．0kbSau3AⅠ酶切片断，对插入片段进行了核苷酸序列测定，1298bp的核苷酸序列包含2个完整的开放读框，其中SLT ⅡA亚基基因编码区长957bp，编码319个氨基酸多肽，SLTⅡB亚基基因编码区长267bp，编码89个氨基酸多肽，与已知人源的SLTⅡ基因核苷酸序列比较具有99％的同源性，与SLTⅠ结构基因相比，A亚基同源序列为56．43％，B亚基为60．15％。     

产志贺毒素大肠杆菌毒素基因的敲除

根据GenBank上致仔猪水肿病大肠杆菌志贺毒素(Stx2e)A单位基因序列(M21534)以及Red重组系统试剂盒提供的FRT-PGK-gb2-neo-FRT序列设计1对引物;引物的5′端与Stx2e基因同源,3′端与FRT-PGK-gb2-neo-FRT序列同源。使用合成的引物利用PCR扩增FRT-PGK-gb2-neo-FRT序列片段。将扩增的PCR片段转化带有pRedET重组质粒的产志贺毒素大肠杆菌(STEC)S451521菌株(F18+)的感受态细胞中,通过同源重组技术替换Stx2eA单位基因的805～1 152bp区域。通过卡那霉素抗性以及PCR检测获得同源重组的STEC后,将708-FLPe质粒进一步转化重组菌,利用Flp重组酶去除了重组菌的卡那霉素抗性。另外,研究还发现Stx2e基因在STEC基因组中并非单拷贝。     

3株被膜态产志贺毒素大肠杆菌产志贺毒素能力的分析

为了解食源性产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC)的菌株特征及潜在致病性,分析其在被膜状态下产志贺毒素能力的变化情况。采用传统PCR技术扩增stx基因亚型,菌株1携带stx1c+stx2d亚型,菌株2携带stx1+stx2f亚型,菌株3携带stx2e亚型。多位点序列分型(MLST)结果显示3株菌株亲缘关系较远,具有遗传多样性。分别利用结晶紫染色试验和Vero细胞毒性试验探究菌株在4、10、25和37℃下被膜形成能力和产志贺毒素能力。结果表明,温度显著影响被膜形成能力和产志贺毒素能力,37℃时3株菌株的被膜形成能力和产志贺毒素能力最强。Vero细胞毒性试验结果表明,4个温度条件下,菌株2产志贺毒素能力最弱。菌株3在4个温度条件下均表现强被膜形成能力和产志贺毒素能力,尤其在4和10℃时,菌株3较其他2株菌被膜形成能力强。我国市场零售肉存在STEC污染,部分菌株具有潜在致病性,尤其是强被膜形成能力、产志贺毒素能力菌株的发现,应加强对食品加工处理过程中STEC的监测。     

志贺样毒素ⅡeA酶活性位点基因突变株的构建与表达

利用重叠延伸PCR法对志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位(SLT-ⅡeA)基因进行修饰扩增,将第167位编码Glu的密码子突变为Gln的密码子,第170位编码Arg的密码子突变为编码Lys密码子,并用质粒载体pGEX-6P-1在大肠杆菌BL21中进行融合表达,在不改变其蛋白空间构象的同时降低其毒性。重组SLT-ⅡeA突变株pGEX-Amu的大量表达为研究SLT-ⅡeA在体内的生物学特性提供依据。     

猪水肿病病理模型复制

以小鼠为试验动物,分别经腹腔注射产志贺样毒素大肠埃希菌菌液和志贺样毒素二型变异体粗制品,复制猪水肿病病理模型。结果表明,小鼠最佳感染细菌数为1.6×1010,志贺样毒素二型变异体最佳感染剂量为0.25 mg。大肠埃希菌菌菌液和志贺样毒素二型变异体人工感染小鼠,其临床症状、病理变化没有明显差异。主要病理组织学变化为:肝变性、坏死,脾巨细胞增生、部分淋巴细胞坏死,肺充血,肾间质血管微血栓形成,小肠绒毛结构被破坏,固有层水肿,间质微血管充血,大脑噬神经现象和卫星化现象等。结果表明志贺样毒素二型变异体是引起猪水肿病主要致病因子,小鼠可作为研究猪水肿病的动物模型。     

志贺样毒素IIeA酶活性位点基因突变株的构建与表达

利用重叠延伸PCR法对志贺样毒素 型变异体A亚单位(SLT- eA)基因进行修饰扩增,将第167位编码Glu的密码子突变为Gln的密码子,第170位编码Arg的密码子突变为编码Lys密码子,并用质粒载体pGEX-6P-1在大肠杆菌BL21中进行融合表达,在不改变其蛋白空间构象的同时降低其毒性。重组SLT- eA突变株pGEX-Amu的大量表达为研究SLT- eA在体内的生物学特性提供依据。     

多重PCR检测猪源大肠杆菌毒素基因

根据猪源大肠杆菌产生的4种主要毒素(STa、STb、LT、SLT-2e)基因序列，设计4对聚合酶链式反应(PCR)引物，建立多重PCR方法。该方法能快速地检测和鉴定产肠毒素大肠杆菌(ETEC)和产志贺样毒素大肠杆菌(SLTEC)菌株，准确地了解所检测菌株产生肠毒素和志贺样毒素的情况。对215株猪源病原性大肠杆菌进行检测，其中STa为52．56％，STb为26．51％，STa STb为8．84％，STa STb SLT-2e为6．51％。这表明多重PCR可为猪源大肠杆菌毒素基因的检测提供一种更加快速、经济、易行的技术。     

产志贺毒素大肠杆菌stx2基因荧光定量PCR检测方法的建立及应用(英文)

[目的]建立检测产志贺毒素性大肠杆菌(STEC)stx2基因荧光定量PCR方法。[方法]根据GenBank中已发表的STEC stx2基因序列,在保守区域设计PCR引物和探针,构建重组质粒作为阳性模板,优化反应条件,建立荧光定量PCR方法。[结果]利用优化的荧光定量PCR反应体系建立了标准曲线。表明起始模板浓度与Ct值之间线性关系好,相关系数R2均达0.995以上;此方法特异性好,对10种非STEC肠道病菌无特异性扩增;敏感性高,初始模板的检出下限达1.0×102拷贝数/μl;重复性好,批内、指间变异系数均分别小于1%和5%。[结论]该研究成功建立了检测STEC stx2基因的荧光定量PCR方法,为快速检测样品中STEC提供了技术手段。     

产志贺毒素大肠杆菌stx2a和stx2b的血清和牛奶抗体检测

于新桥医院采集健康人群血清535份,两个屠宰场采集商品猪血清415份,5家奶牛场和1家奶站采集新鲜牛奶326份,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清(牛奶)中的stx2a和stx2b抗体.用P/N2.1作为阳性判定标准,535份健康人群血清检测到stx2a抗体阳性和stx2b抗体阳性血清各21份(3.93%); 415份商品猪血清检测到stx2a抗体阳性血清4份(0.96%),stx2b抗体阳性血清2份(0.48%);326份新鲜牛奶检测到stx2a抗体阳性血清25份(7.46%),stx2b抗体阳性血清21份(6.44%).牛奶中stx2抗体阳性率最高,健康人群血清次之,商品猪血清的阳性率最低.由此表明重庆市STEC菌株中携带stx2基因.     

猪源大肠埃希菌喹诺酮类耐药基因的检测及分析

【目的】探究江苏泰州地区猪源致病性大肠埃希菌对喹诺酮类药物的耐药情况以及喹诺酮相关耐药因子的流行情况.【方法】采用纸片法对81株临床分离的猪源致病性大肠埃希菌进行喹诺酮类药物耐药性的检测,通过PCR方法检测质粒介导的喹诺酮类耐药基因(PMQR)和喹诺酮类耐药决定区基因(QRDR)并进行分析.【结果】菌株对萘啶酸和环丙沙星的耐药最为严重,耐药率分别为69.1%和51.9%,且多呈现多药耐药现象.PMQR检测结果表明aac(6′)-Ib-cr基因检出率最高,为76.5%,其次为qnrS,qnrA,qnrD,qnrB,检出率依次为45.7%,34.6%,23.6%,2.5%,未检出qepA基因.QRDR突变分析中,常见的gyrA中Ser83突变为Ile, Asp87突变为Asn或Gly和parC中Ser80突变为Ile均被检测到,突变率分别为84.0%,61.7%和60.5%.而gyrB中Asp426突变为Gly还是首次报道,突变率为35.8%.此外,parC还检测到1株Phe64突变为Pro,2株Gln91突变为His.【结论】江苏泰州地区猪源大肠埃希菌中PMQR基因普遍存在,且QRDR基因突变严重,提示应加强抗生素的合理使用以及对喹诺酮相关耐药基因的监控.     

Cloning of Shiga-like toxin structural genes from a toxin converting phage of Escherichia coli

The genes controlling high-level production of Shiga-like toxin (SLT) in Escherichia coli were cloned from the SLT converting phage 933J. This phage was isolated from a strain of E. coli that caused a foodborne outbreak of hemorrhagic colitis. The genes that convert normal E. coli to organisms producing high levels of toxin were cloned into the plasmid pBR328 and expressed in E. coli HB101. DNA restriction mapping, subcloning, examination of the cloned gene products by minicell analysis, neutralization, and immunoprecipitation with antibodies to SLT were used to localize the toxin converting genes and identify them as structural genes for SLT. Southern hybridization studies established that the DNA fragment carrying the cloned toxin structural genes had homology with the DNA of Shigella.     

鸡源大肠杆菌中QRDR基因的检测

为分析鸡源大肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药机制,使用PCR技术从对喹诺酮类药物具有耐药性的大肠杆菌中扩增出喹诺酮耐药决定区(QRDR)基因。通过对所测序列结果的分析,得到DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ基因(gyrA、gyrB、parC、parE)的突变位点及其氨基酸的表达情况。根据基因型研究QRDR的流行病学情况,可指导喹诺酮类药物的临床合理用药。     

鸡源大肠杆菌四环素耐药基因检测

用肉汤稀释法测定32株鸡源大肠杆菌对四环素等8种抗菌药物的敏感性,用PCR方法检测5种四环素耐药基因(tet基因),并用ERIC-PCR方法分析试验菌株间的克隆关系。结果显示:32株大肠杆菌对四环素、多西环素的耐药率分别为84%、75%,tetA和tetB阳性率分别为78%和25%。总tet基因阳性率为90.6%,与对四环素、多西环素的耐药率基本一致。携带1种或2种tet基因的临床分离菌,不仅对四环素类药物耐药,还对头孢噻肟、环丙沙星、新霉素和氟苯尼考耐药,呈现多重耐药的特点。试验菌共分为A^O 15个ERIC型,tetA和tetB几乎均匀分布于不同ERIC型菌株中,表明其在试验菌株间水平扩散。     

动物源大肠杆菌PMQR基因流行性检测

【目的】检测分离自广东省散养型养殖场的动物源大肠杆菌中oqxAB基因及其它质粒介导喹诺酮类耐药基因(PMQR)的流行情况。【方法】采用PCR方法检测oqxA、oqxB、qnr、qepA和aac（6′）-Ib-cr基因;琼脂平板稀释法对PMQR阳性菌株进行18种抗菌药物的最小抑菌浓度测定。【结果】qnrB 、qnrS、aac（6′）-Ib-cr、oqxA、oqxB的检出率依次为10.49%、18.88%、31.47%、44.8%和48.9%,但未检测到qnrA、qnrC、qnrD和qepA。oqxA与oqxB的检出率较高,且oqxA与oqxB常常同时存在。多数菌株同时携带两个或两个以上的PMQR基因。PMQR阳性菌对18种兽医临床常用抗生素耐药率较高。【结论】PMQR基因在广东省兽医临床传播广泛,广东省大肠杆菌对临床常用抗菌药物耐药较为严重,药敏谱呈多样化,多重耐药株比例较高。     

优化致仔猪水肿病大肠杆菌培养物方法的研究

为摸索提高致仔猪水肿病大肠杆菌培养菌数的简单易行的方法，以普通肉汤和马丁汤为基础培养液，分别调整培养成分、通气培养和人工调节培养液的pH值，结果表明：通气培养和维持适宜的pH值能大幅度提高菌数，且马丁汤培养液明显优于普通肉汤培养液。     

鸡源大肠杆菌四环素耐药基因检测

用肉汤稀释法测定32株鸡源大肠杆菌对四环素等8种抗菌药物的敏感性,用PCR方法检测5种四环素耐药基因(tet基因),并用ERIC-PCR方法分析试验菌株间的克隆关系。结果显示:32株大肠杆菌对四环素、多西环素的耐药率分别为84%、75%,tetA和tetB阳性率分别为78%和25%。总tet基因阳性率为90.6%,与对四环素、多西环素的耐药率基本一致。携带1种或2种tet基因的临床分离菌,不仅对四环素类药物耐药,还对头孢噻肟、环丙沙星、新霉素和氟苯尼考耐药,呈现多重耐药的特点。试验菌共分为A~O 15个ERIC型,tetA和tetB几乎均匀分布于不同ERIC型菌株中,表明其在试验菌株间水平扩散。     

青岛地区鸡源大肠杆菌耐药性检测

从青岛平度、即墨、莱西3个地区的多家养殖场中分离了鸡源大肠杆菌89株,并进行了鉴定及药敏试验。结果表明,所调查地区鸡源大肠杆菌耐药性较严重,对恩诺沙星、氨苄西林耐药最为普遍,其次是氟苯尼考、庆大霉素与环丙沙星。同时发现,调查地区大肠杆菌耐药谱广且多重耐药性严重。     

茶树Mn-SOD基因在大肠杆菌中的高效表达

聚合酶链式反应(PCR)扩增茶树嫩叶锰超氧化物歧化酶基因,并与原核表达载体pET22b( )连接,构建重组质粒pET/msod,将该质粒转化至大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3),获得转基因工程菌BL21-pET/msod。在1 mmol.L-1异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)诱导下,重组蛋白得到高效表达,酶活性可达2×105U.L-1。SDS-PAGE检测表达蛋白分子量为25 kD,与通过核苷酸推测的分子量一致。