菜心ISSR-PCR反应体系的优化

以菜心(Brassica campestris L. ssp. Chinensis Var. utilis Tssen. et Lee.)为材料, 对影响ISSR-PCR扩增结果的因素如Mg2 、 Taq DNA聚合酶、 dNTPs、 Primer、模版DNA的浓度及引物退火温度、延伸时间和循环次数进行了探讨, 确立了适合菜心ISSR-PCR分析的最佳反应体系和PCR扩增参数 在25 μL反应体系中含10×buffer 2.5μL, 2.0 mmol/L Mg2 , 0.5 U Taq DNA聚合酶, 0.2 mmol/L dNTPs, 0.5 μmol/L引物, 30 ng模板DNA. PCR扩增程序 94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性1 min, 49.7～56 ℃退火(退火温度随引物不同而定)1 min, 72 ℃延伸45 s, 40个循环; 72 ℃延伸5 min.     

沙地云杉ISSR-PCR反应体系的初步优化

以沙地云杉叶基因组DNA为材料,采用单因素试验方法对ISSR-PCR体系中的主要成分Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物浓度、退火温度进行筛选,建立并优化沙地ISSR-PCR反应体系。结果表明,UBC835是最适引物,适宜退火温度为50℃。沙地云杉ISSR-PCR分析的最适反应体系(20μL PCR反应体系)为:2.0 mmol/L Mg2+、1.0 U/μL Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/L dNTPs、0.25μmol/L引物、50 ng/μL模板DNA。PCR扩增程序:94℃预变性4 min;94℃变性45 s,50℃退火45 s,72℃延伸2 min,40个循环;72℃延伸7 min,4℃保存。     

春兰ISSR-PCR反应体系的优化

以春兰为材料,对影响ISSR-PCR扩增结果的因素如模板DNA、dNTPs、MgCl2、primer、TaqDNA聚合酶的浓度及引物退火温度、反应循环数进行了探讨,确立了适合春兰ISSR-PCR分析的最佳反应体系和PCR扩增参数:在15μL反应体系中含1×buffer,0.2 mmol/L dNTPs,2.0 mmol/L MgCl2,0.2μmol/L引物,0.3 UTaqDNA聚合酶,20 ng模板DNA。PCR扩增程序:94℃预变性2.5 min;94℃变性45 s,48~58℃退火(退火温度随引物不同而定)45 s,72℃延伸2 min,35个循环;72℃延伸5 min。     

黑木耳菌丝体DNA提取及RAPD扩增条件的优化

对黑木耳菌株基因组DNA进行RAPD-PCR反应体系及扩增程序优化.结果表明,采用CTAB法快速提取到较高质量黑木耳基因组总DNA用于RAPD-PCR扩增,确定黑木耳基因组DNA RAPD-PCR最适25μL反应体系为:模板DNA浓度15 ng/μL,Mg2 浓度2.0 mmol/L,Taq DNA聚合酶1 U,dNTP浓度150μmol/L,10碱基引物浓度10 pmol,10×缓冲液,其余用重蒸馏水补充.扩增程序为:预变性94℃5 min,变性94℃1 min,退火36℃1 min,延伸72℃1.5 min,共40个循环,72℃最终延伸7 min.     

花生基因组SRAP-PCR体系的优化

【研究目的】研究花生基因组SRAP-PCR的扩增条件,建立其优化扩增体系;【方法】对模板DNA、引物、dNTP mixture、Taq DNA聚合酶浓度及退火温度设置不同梯度,研究各因素对PCR结果的影响;【结果】扩增程序为:94℃变性2min,1Cycle;94℃变性30s,48℃复性30s,72℃延伸1min,40Cycles;72℃延伸7min。反应体系成份为:DNA模板80ng,左右引物各200ng,dNTP mixture2.0mmol/L,Taq DNA聚合酶3U,10×Buffer8μl,总体积60μl。【结论】建立了满足花生基因组SRAP-PCR的优化扩增体系。     

龙眼ISSR反应体系的建立和优化

对影响龙眼ISSR-PCR扩增反应的各个参数进行优化,建立适合龙眼的ISSR反应体系:PCR反应体积为20μl,其中模板DNA 25ng,引物0.2μmol/L,dNTP 100μmol/L,Taq DNA聚合酶0.5U,MgCl2 2.5mmol/L,10×PCR缓冲液2.0μl;扩增程序为94℃预变性5min;94℃变性1min,退火温度1min,72℃延伸90s,40个循环;72℃延伸7min。     

北五味子RAPD-PCR反应条件优化

以采自吉林省汪清地区野生北五味子叶片为材料,提取其基因组DNA,并以此为模板进行北五味子RAPD—PCR反应条件的优化．结果表明,PCR反应混合液为：25μLPCR反应体系中加入20ng模板DNA,200μmol／LdNTPs,0．3μmol／L引物,2．0mmol／LMg^2＋,1UTaqDNA聚合酶,2．5μL 10×Buffer;PCR反应程序为：94℃预变性5min后,在94℃变性1rain,40℃退火1min,72℃延伸2min,共40个循环后,在72℃下最后延伸5min时,在不同引物中均扩增出清晰而稳定的DNA电泳谱带．     

人参黑斑病菌RAPD反应体系的优化

采用改良的CTAB法提取人参黑斑病菌的基因组DNA,建立人参黑斑病菌RAPD反应的体系.最佳体系容积为25μL,其中包括10×Taq配套缓冲液2.5μL,模板DNA 20 ng/μL,引物15 pmol/L,dNTP 150μmol/L,Taq DNA聚合酶1 U,Mg2+1.5 mmol/L,其余部分用DW补充.PCR扩增程序为:94℃预变性5 min,94℃变性1 min,40℃退火1 min,72℃延伸2 min,40次循环,72℃延伸7 min.     

冷暖型小麦基因差异的最佳RAPD反应体系研究

为了建立小麦RAPD反应的最佳体系,保证反应结果的稳定性和可靠性,寻找小麦冷暖型基因差异,降低试验成本,在相同PCR扩增程序(94℃预变性5 min,94℃变性45 s,38℃退火1 min,72℃延伸1.5 min,40个循环,72℃延伸10 min,4℃保存)下,对冷暖型小麦基因组DNA的RAPD扩增体系各参数进行比较筛选,创建其最佳反应体系为:25μl反应体系中,模板DNA 20 ng,10×PCR缓冲液2.5μl,dNTPs 0.2 mmol/L,Taq酶1 U,Mg2+浓度为2.0 mmol/L,ddH2O 12μl,随机引物10 ng。     

巨竹ISSR反应体系的建立与优化

以巨竹叶片提取的基因组DNA为材料,用引物UBC810(序列为GAG AGA GAG AGA GAG AT)研究了PCR反应体系的主要成分、退火温度及循环次数对该种植物ISSR扩增结果的影响。结果表明,20μL的反应体系含40 ng模板DNA、0.6μmol.L-1引物,1.0 U Taq DNA聚合酶,2.5 mmol.L-1Mg2+,0.25 mmol.L-1dNTPs,1×Buffer。PCR扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,54.5℃复性30 s,70℃延伸90 s,循环40次;72℃延伸10 min,置4℃保存。     

小麦干种子基因组DNA的提取及效果研究

分别采用试剂盒和CTAB法提取小麦干种子基因组DNA,DNA样品经紫外光谱吸收、琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增检测。结果表明,试剂盒提取DNA操作过程快速简便、成本较低,DNA产率和纯度优于CTAB法。通过多重PCR技术分别以小麦LMW-GS亚基Glu-B3位点和黑麦碱secalin-p基因的特异引物进行扩增,均能够扩增出清晰的目标条带,提取的基因组DNA能够满足分子检测的实验要求。     

优质小麦品种Glu-A3位点LMW-GS基因的克隆及分子特征

【目的】揭示小麦不同品种Glu-A3位点低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS)基因的分子特征,寻找在小麦品质改良方面有潜在应用价值的优质候选基因。【方法】选用小麦Glu-A3位点LMW-GS基因特异引物,以中国优质小麦品种小偃6号、陕优225,澳大利亚面包小麦Suneca、Cook以及遗传背景已揭示清楚的中国春小麦为材料,通过基因组特异PCR方法克隆其Glu-A3位点LMW-GS基因,并进行了分子特征比较。【结果】获得了5个Glu-A3位点LMW-GS基因,分别命名为：CookGlu-A3（登录号为EU871816）、XYGlu-A3（FJ876820）、SYGlu-A3（FJ876819）、SunecaGlu-A3（FJ876822）和CSGlu-A3（FJ876821）,这5个基因均有完整的ORF、上游197 bp的启动子区和终止密码子下游51 bp序列,推导蛋白均属于LMW-i型亚基,其差别在于不同序列之间存在着一些SNP位点和插入/缺失片段。其中,CookGlu-A3推导蛋白含7个Cys残基,在C端区缺失了包含第7个保守Cys残基在内的38个氨基酸片段。基于51个染色体位点已知的LMW-GS基因编码区序列比对结果构建的系统发生树,将这些序列分为3大类：所有Glu-A3位点LMW-GS基因编码序列单独聚为第Ⅰ类;部分Glu-D3位点基因被聚在第Ⅱ类;剩余Glu-D3位点基因和全部Glu-B3位点基因被聚在第Ⅲ类,而在第Ⅲ类中这2个位点的LMW-GS基因又各自聚为2个不同的亚类,即Ⅲ-1和Ⅲ-2。【结论】从小麦品种Cook中克隆的CookGlu-A3是编码含7个Cys残基的LMW-i型亚基基因,可能是一个新的LMW-GS基因类型;不同染色体位点的LMW-GS基因在其编码区存在特异性;Glu-A3位点LMW-GS基因与Glu-B3或Glu-D3位点LMW-GS基因编码区序列差异较大。     

新疆稻麦低分子量谷蛋白亚基基因序列分析

根据普通小麦低分子量谷蛋白亚基基因保守区序列,设计了一对引物(P1和P2),采用PCR法对新疆稻麦(Triticum petropavlovskyiUdacz.et Migusch)的基因组DNA进行扩增,获得1条约900 bp的片段,纯化后克隆到载体pMD18-T后,对筛选阳性克隆测序,获得1个基因LMWXJ-1(Genbank登录号:AY695380)。序列分析的结果表明LMWXJ-1具有典型的低分子量谷蛋白亚基基因的基本结构。推导的氨基酸序列比较结果表明,LMWXJ-1与Glu-A3和Glu-D3位点的低分子量谷蛋白基因具有较高的相似性(最高相似性分别为82%和80%),而与Glu-B3位点的差异较大(最高相似性仅有68%)。     

编码Glu-A3位点低分子量麦谷蛋白亚基的基因在山东小麦中的分布

低分子量麦谷蛋白亚基（LMW-GS）赋予面团延展性，对小麦加工品质有重要影响。本试验以545份山东小麦为材料，采用特异引物PCR技术对其Clu-A3位点低分子量麦谷蛋白的7个亚基基因进行了鉴定和分析。结果表明：地方品种中，g亚基的含量最丰富，达到52.3％，历史品种中，c、d亚基的含量较丰富，分别为47.0％和25.2％，与地方品种相比，历史品种中a、c、d亚基所占比例的提升幅度较大，而g亚基的比例则大幅减低。     

小麦Glu-3位点基因拷贝数的变异分析

【目的】基因拷贝数变异是一种常见又重要的基因结构变异,往往影响个体表型。低分子量麦谷蛋白（low-molecular-weight glutenin subunit,LMW-GS）是小麦贮藏蛋白的主要组成部分,位于Glu-3位点。小麦作为异源六倍体,其庞大且复杂的基因组结构导致难以利用传统方法检测目的基因的拷贝数,针对小麦基因组,筛选可靠稳定的内参基因和体系,探索适合复杂基因组的拷贝数变异测定技术,测定Glu-3位点LWM-GS基因拷贝数。【方法】以Acc1为内参基因,根据基因序列设计内参引物和探针,通过定性和定量PCR测定内参基因在12个普通小麦品种中的拷贝数,分析该基因拷贝数在不同品种间的稳定性;又以小麦品种篙优2018的5个稀释浓度的基因组DNA为模板,利用qRT-PCR验证Acc1内参系统的重复性和准确性;根据Glu-A3位点LMW-GS基因序列设计特异性引物及探针,利用qRT-PCR和ddPCR 2种方法检测8个小麦品种Glu-A3位点基因拷贝数,比较后选择更优的高通量基因拷贝数检测方法;再根据Glu-B3和Glu-D3位点LMW-GS基因序列设计相应的特异性引物及探针,并利用ddPCR技术检测和分析了231份小麦品种的Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3位点上LMW-GS基因拷贝数。【结果】Acc1在12个普通小麦品种间、同一品种5个DNA稀释浓度间的拷贝数测定结果一致,技术重复间的变异系数仅为0.07%—0.77%,所构建的Acc1内参系统稳定;比较qRT-PCR和ddPCR 2种拷贝数检测方法,8个品种所测的Glu-A3位点拷贝数结果一致,分别为3、5、3、4、3、3、3和3;且ddPCR检测重复间的变异系数为0.30%—1.67%,远低于qRT-PCR的3.14%—12.72%,更加可靠;利用ddPCR对231份普通小麦品种的Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3位点上LMW-GS基因拷贝检测后分析发现,大多数小麦品种在3个位点上的拷贝数为4,所占频率分别为51.95%、32.03%和28.57%,Glu-3位点总拷贝数变异范围为10—21,变异系数为16.12%。【结论】Acc1内参系统具有良好的稳定性和重复性,可以用作小麦Glu-3位点和其他目的基因拷贝数检测的内参;qRT-PCR和ddPCR均可用于小麦基因拷贝数的检测,但后者更稳定、可靠,且操作简单、检测通量高。     

牛肌肉生长抑制素基因敲除打靶载体的构建

【目的】构建两套用于牛肌肉生长抑制素（myostation,MSTN）基因敲除的置换型打靶载体。【方法】设计并合成含有限制性内切酶酶切位点的引物,利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）以牛耳皮肤组织基因组DNA为模板分别扩增出两套打靶载体的同源短臂和长臂,再分别插入到两套打靶专用基础载体pMCS-PLP和PⅢ中,构建两套用于牛MSTN基因敲除的置换型打靶载体pPLP-MSTN和PⅢ-MSTN。【结果】经过PCR、T载体连接和DNA测序,证实载体pPLP-MSTN包含2.8 kb同源短臂和4.0 kb同源长臂,载体PⅢ-MSTN包含1.3 kb同源短臂和6.8 kb同源长臂;经过限制性内切酶酶切鉴定,证实两套载体的同源臂分别正确插入到基础载体内。【结论】两套牛MSTN基因敲除打靶载体pPLP-MSTN和PⅢ-MSTN构建成功,载体pPLP-MSTN为不含负筛选标记的传统基因敲除打靶载体,载体PⅢ-MSTN为不含负筛选标记的荧光蛋白启动子捕获打靶载体。     

二斑叶螨cDNA文库的构建及鉴定

为研究二斑叶螨发育相关基因的功能,利用TRIzol试剂提取二斑叶螨总RNA,通过SMART技术构建cDNA文库.利用SMART IVTM Oligonucleotide和CDSIII/3忆PCR Primer为引物,在反转录酶作用下,合成cDNA第1链,利用LD-PCR方法合成cDNA第2链。合成的双链cDNA经酶切回收后,再连接pDNR-LIB载体,转化大肠杆菌感受态细胞Trans5琢,检验库容量和重组效率,并采用PCR方法检测插入cDNA片段的大小.结果表明,构建的二斑叶螨cDNA文库的库容量为3.54C6 CFU/mL,重组效率达95.8%,插入片段长度在0.3~2.0 kb之间。构建的二斑叶螨cDNA文库质量良好袁能够为进一步研究二斑叶螨基因的功能奠定基础。     

龙麦19 Gli-A1/Glu-A3位点近等基因系低分子麦谷蛋白亚基(LGW-GS)鉴定

为了鉴定小麦品种龙麦19(L-19,2*,7+9,2+12)和一对L-19的Gli-A1位点醇溶蛋白近等基因系L-19-626(2*,7+9,5+10)与L-19-613(2*,7+9,5+10)中与Gli-A1位点紧密连锁的Glu-A3位点低分子麦谷蛋白亚基(LMW-GS),利用一套Glu-A3位点特异低分子麦谷蛋白亚基STS标记对L-19、L-19-613、L-19-626及L-19/L-19-626的F2个体进行PCR扩增。结果表明:在具有醇溶蛋白Gli-A1m的个体中(L-19-626类型),Glu-A3e反应均为阳性,在不具有醇溶蛋白Gli-A1m的个体中(L-19和L-19-613类型),Glu-A3c反应均为阳性。说明编码L-19-626醇溶蛋白的Gli-A1 m基因与编码LMW-GS的Glu-A3e基因紧密连锁,编码L-19和L-19-613的Gli-A1位点醇溶蛋白基因(未命名)与编码LMW-GS的Glu-A3c基因紧密连锁。因此,L-19-626与L-19-613近等基因系品质间的差别很可能是由其LMW-GS Glu-A3e与Glu-A3c基因间的差异引起的。     

阿拉拉特小麦高分子量谷蛋白新基因1Gy的克隆及序列分析

利用y-型高分子量谷蛋白亚基的特异引物,对阿拉拉特小麦(PI427305)的基因组DNA进行PCR扩增,得到大小为2.2 kb的目的条带,将该条带回收纯化并克隆到pMD18-T载体中,经梯度亚克隆测序拼接,得到编码区的全序列为2 202 bp(GenBank登录号:HM131806),共编码732个氨基酸。它与1Gy7*序列的同源性高达99%,而且氨基酸序列结构与大多数y-型亚基相同,推断该基因为1Gy。1Gy的分子量比1Gy7*稍小,迁移率比1Gy7*慢。与小麦属其他基因组编码的y-型亚基相比,其在靠近C端的重复区多了一个半胱氨酸残基。利用在线PSIPRED对其二级结构预测结果显示,其重复区主要是无规则卷曲结构。这些结构都可能使得1Gy对小麦加工品质产生正面影响。     

人工合成小麦RSP的LMW-GS基因克隆

 RSP是用抗穗发芽的节节麦与圆锥小麦合成的人工六倍体小麦Triticum turgidum-Aegilops tauschii），其抗穗发芽特性在维持小麦面粉加工品质方面有着潜在的重要价值。为了了解其低分子量谷蛋白这一对小麦加工品质有直接重要影响的蛋白组分情况，本研究采用PCR法从合成小麦RSP中克隆得到3个低分子量谷蛋白亚基（LMW-GSs）基因，命名为LMWRSP-1、LMWRSP-2和LMWRSP-3。基因序列GenBank登录号分别为AY676681、AY676682和AY676683。其中，LMWRSP-1和LMWRSP3的编码区长度分别为825 bp和915 bp，可分别编码274和304个氨基酸。LMWRSP-2由于在编码区内有1个提前终止密码子，推测为不编码成熟蛋白的假基因。与已知LMW-GS基因进行比较发现，LMWRSP-1与Glu-A3位点基因的相似性最高，LMWRSP-3与Glu-D3位点的基因相似性最高。