鸡传染性支气管炎病毒M41株毒种鉴定

用SPF鸡胚繁殖,收获的病毒定义为原代毒,即E0代,在10日龄的SPF鸡胚中连续传12代,对E1、E5、E9和E12代病毒液分别进行病毒含量(EID50)测定、毒力实验、特异性实验、免疫原性实验、保存期实验。结果表明,在12代内,不同代次M41株病毒的上述特性没有发生改变,仍然保持该毒株生物学特性。毒种保存期研究表明,-20℃条件下冻干种毒保存3年,-70℃湿毒保存≤1年,病毒效价没有明显改变。研究建立了M41株病毒毒种标准和种子批(原始种子库、基础种子库和工作种子库),为下一步灭活疫苗的研究和生产打下基础。     

鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白基因的克隆及序列测定

根据IBV病毒的已报道基因序列设计了用于扩增鸡传染性支气管炎病毒M41株S1基因和T株核衣壳蛋白基因(N)的引物。经RT-PCR得到了预期大小的扩增产物；将目的条带纯化并回收以后，克隆到pMD18-T质粒载体中，对插入片段进行序列测定。并与已发表的IBV S1、N基因序列进行了比较和分析，表明具有高度同源性。证明我们克隆了IBV S1和N结构蛋白基因。     

5株鸡传染性支气管炎病毒M基因克隆及序列分析

利用RT-PCR技术成功扩增出5株鸡传染性支气管炎病毒（IBV）分离株M基因全长cDNA,并将其克隆到pGEM-T Easy载体上,获得M基因的重组质粒。序列分析表明,5株IBV分离株间的M基因核苷酸同源性为89.0%～100.0%,与参考毒株核苷酸同源性为85.7%～99.3%;在M蛋白遗传进化树中,5株IBV分离株分居3个群;分离毒株M蛋白的α-螺旋结构主要分布在N端前100个氨基酸残基的肽段区,其他的部分主要是β-折叠和无规则卷曲结构,表明IBV分离株M蛋白在基因序列和二级结构上相对保守。     

一株鸡传染性支气管炎病毒地方分离株膜蛋白基因的遗传变异分析

对从山西省分离到的1株IBV(IBVSX16)的膜蛋白基因片段进行序列测定及分析,结果发现,IBVSX16株膜蛋白基因含有一个长681 bp的ORF,编码226个氨基酸残基组成的多肽,与疫苗株H120和中国分离株LX4推导的氨基酸序列比对发现,存在基因突变现象,未发现缺失和插入现象,变异主要发生在2～17位.系统进化关系显示19株IBV毒株分属于5个群.IBVSX16株位于第II群,中国IBV分离毒株主要集中在第Ⅲ群和第Ⅳ群,具有较明显的地理区域性,可见IBV分离株在基因进化关系上形成了自己较为独立的进化群.     

鸡传染性支气管炎TJ9602毒株S1基因的序列分析

将RT－PCR法扩增的IBV TJ9602毒株S1基因，连接到pDM18-T载体上，克隆后进行核酸序列分析，证实TJ9602毒株S1基因与Genebank中发表的国外毒株H120和M41的同源性较低，分别为81．1％和80％，与国内JX9901毒株的同源性达到91．3％，初步证实国内存在IBV新毒株。     

鸡传染性支气管炎病毒地方-分离株S1基因克隆和基因型鉴定

利用ＩＢＶ全长Ｓ１基因特异性引物,以纯化的３个标准株Ｍ４１、Ｈ５２、Ｔ和６个地方分离株（ＱＤ、ＺＺ、ＧＺ、ＧＪ、ＤＬ和ＹＣ）的基因组ＲＮＡ为模板,用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出预期大小约１．７３ｋｂｃＤＮＡ片段,经ＢＡＭＨＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切插入到质粒ｐＵＣ１８中,并在大肠杆菌ＪＭ８３中实现了克隆。对６个分离株的Ｓ１基因ＰＣＲ产物进行ＨａｅⅢＲＦＬＰ分析,表明ＱＤ、ＴＪ属于Ｍ４１基因型,ＺＺ和ＧＺ与Ｔ基因     

鸡传染性支气管炎腺胃病变型分离株H95免疫原基因的克隆与鉴定

用反转聚合酶链反应，从纯化的腺胃病变型鸡传染性支气管炎分离株病毒基因组ＲＮＡ扩增出约１．７ｋｂ的ＩＢＶ Ｓ１基因。将该扩增产物于ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨ Ｉ位点克隆到ｐＵＣ１８质粒载体中，对重组质粒载体进行酶切分析，得到与Ｓ１基因预期大小一致的插入片断。     

鸡传染性支气管炎病毒W株膜蛋白基因的分子特征

【目的】研究鸡传染性支气管炎病毒(IBV)W株膜蛋白基因的分子特征。【方法】根据GenBank中已发表的鸡传染性支气管炎病毒M基因序列,设计并合成1对特异性引物,利用RT-PCR技术成功扩增了IBV河南地方分离毒株W株M基因全长片段,然后进行克隆、测序,并与GenBank中发表的11株国内外参考毒株进行比较分析。【结果】获得的W株M基因全长为681 bp,编码M蛋白226个氨基酸残基,其N端的前60 nt为前导序列,近N端含有2个潜在的N-糖基化位点;3个跨膜区域分别位于21~37,45~68,74~94 aa处,在171~176,183~193 aa处有2个潜在的抗原位点,且M蛋白上有9个高度保守的半胱氨酸;与参考毒株相比,IBV-W株M基因的核苷酸同源性为88.2%~92.7%,推导的氨基酸同源性为91.1%~95.6%;M蛋白的突变主要发生在前16位氨基酸,其中第2位缺失1个氨基酸,第3~6位连续插入4个氨基酸,第8~9位缺失2个氨基酸,第14~16位的3个氨基酸发生连续突变,其他位点的氨基酸变异为点突变,M蛋白核苷酸序列的变异主要表现为静默突变,亲水区较疏水区更易变易;在系统发生进化树中,W株与BJ株处于同一个小的分支上,亲缘关系较近,而与其他参考株的亲缘关系较远。【结论】推测W株可能是一个新的变异株。     

30株鸡传染性支气管炎病毒标准株与分离株S1基因的克隆及序列分析

利用IBVS1基因特异性引物对30株IBV毒株进行RT-PCR扩增,产物经纯化后进行测序,并利用DNAstar MegAlign软件分析S1基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列。结果表明,广西分离株GXIB/02与Mass41、Conn、Ark、PA、Del、JMK、H52参考株的核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性均较低,与美国80年代分离的毒株MW34、hotle、cal15、AustT株的序列同源性也很低。这一结果与血清学试验结果相吻合,说明广西分离株GXIB/02与当今流行的标准株以及过去流行的毒株都不相同,是一个新的变异株,由此推断广西已有不同血清型IBV毒株存在,可能导致新的变异株流行。     

我国鸡传染性支气管炎病毒地方分离株的形态观察和S1基因的RT-PCR扩增

参照已发表的IBVBeaudette株全基因组序列 ,自行设计合成了 3条引物 (youl 、you2 -、youM ) ,引物you1 和you2 -在S1基因两侧 ,跨幅约 16 10bp ,引物you2 -和youM 在S1基因的 3’端 ,跨幅约 5 30bp。用这两对引物对 5个IBV地方分离株 (HN2 ,HN4,JX1,SC2和SC1)进行RT -PCR ,均成功地扩增出相应大小的目的片段。病毒在电镜下观察可见到形态多变的冠状病毒粒子     

鸡传染性支气管炎病毒N基因的克隆及序列分析

根据GenBank上已公布的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N基因序列经多重比较设计一对特异性引物扩增大庆分离株DQ1株的N基因,RT-PCR产物经纯化回收后,克隆到pMD18-T载体上,转化大肠杆菌TG1感受态细胞,筛选出阳性质粒进行序列测定,经与已发表的IBV N基因序列进行序列比较与分析,表明DQ1株的N基因与现有疫苗株存在一定差异.     

鸡传染性支气管炎病毒浙江分离株RFLP基因分型

为了查清浙江省目前流行的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的基因型,我们收集了5个不同疫区的IBV（肾病变型J、W、X、N;腺胃病变型ZJ971）和参考株H₁₂₀,分别对其S1基因cDNA进行HaeⅢ、StyⅠ、PstⅠ、Ksp632Ⅰ的RFLP分析。结果表明IBV-J、W、X、N株的RFLP基因类型相同,但与古老的肾病变型代表株（即T株、Gray株、Holte株）、国内外报道的肾病变型毒株及呼吸型H₁₂₀株均不同,是一种新的RFLP基因类型;IBV-ZJ971株的基因型与H₁₂₀相同。     

鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体的研制与鉴定

用经蔗糖密度梯度离心纯化的鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ，Ｍ４１）作为抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，通过常规淋巴细胞发校瘤技术产生杂交瘤细胞，经ＥＬＩＳＡ筛选，获得了４株能分泌特异性抗ＩＢＶ单克隆抗体的细胞系，分别命名为４ＡＣ、４ＡＦ１、６ＤＨ及２ＤＨ１０。４株单抗的亚类都属于ＩｇＧ２ｂ，在Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ试验中，４ＡＦ１、６ＤＨ６２株单抗牧场卉性地识别ＩＢＶ的核衣壳蛋白（Ｎ）；经ＥＬＩ     

鸡传染性支气管炎病毒血凝性的研究

用中国和澳大利亚分离的Ａ型魏氏梭菌培养液、Ⅰ型卵磷酯酶Ｃ和胰酶处理鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ），制备的血凝抗原能凝集鸡红细胞，为鸡传染性支气管炎的诊断提供了方法。对鸡传染性支气管炎Ｍ（４１）、Ｈ（１２０）、Ｈ（５２）、Ｇｒａｙ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、Ｔ、ＧＩＢＶ等７个毒株进行了血凝性的比较，以Ｈ（１２０）毒株血凝价最高，其次是Ｍ（４１）、ＧＩＢＶ、Ｇｒａｙ，而Ｈ（５２）、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、Ｔ等毒株血凝性低或无血凝性。作者还对影响鸡传染性支气管炎病毒血凝试验的各种因素进行了研究。     

鸡传染性支气管炎病毒H52毒株S基因的克隆及序列分析

将含有鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H52毒株的尿囊液浓缩,用TRIzol 试剂抽提病毒RNA作为反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的模板,参照已发表的IBV-Beaudette 株S基因序列,设计并合成一对特异性引物,扩增得到长度约3.6 kb 的S基因片段,利用引物设计中EcoR I和BamH I 酶切位点插入到克隆载体pBlueScript SK 的多克隆位点中,转化感受态E.coli DH5α.经酶切分析和PCR等方法鉴定,筛选出阳性克隆,进行核苷酸序列测定,证实获得了S 基因的全长序列.利用DNAstar等分析软件与GenBank中其它IBV毒株的核苷酸及其推导的氨基酸进行序列同源性比较分析,结果表明,H52毒株与已报道的核苷酸的同源性在83.45%～99.71%之间,氨基酸的同源性在82.10%～99.26%之间.     

鸡传染性支气管炎病毒HN99株N基因的克隆与序列分析

根据GenBank中已发表的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N基因序列,设计并合成1对特异性引物,用RT-PCR方法扩增IBVHN99株的N基因,并将其克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌Top10,提取pMD18-T-N重组质粒,进行酶切和PCR鉴定,并对阳性质粒进行测序,将测序结果与H52,Ark99,BJ等参考毒株进行序列分析。结果表明,N基因全长为1230bp,编码1条409个氨基酸组成的多肽;其核苷酸与H52,Ark99和BJ等毒株的同源性为88.4%~90.7%,氨基酸同源性为91.7%~94.4%;HN99株与H52,Ark99和BJ等其他各毒株的亲缘关系均较远,是1株新的IBV变异株。