农杆菌介导的优良玉米自交系遗传转化体系的建立

以杂交育种中广泛使用的优良玉米自交系340,4112为材料，用带有质粒pGBIL04(actin.Bt.35S.bar)的根癌农杆菌LBA4404转化其幼胚及其初始愈伤组织，经PPT抗性筛选后分化再生植株，PCR分子检测初步证明Bt基因已整合到再生植株基因组中，转化率为1.68%-4.44%。本实验利用转化受体的抗性筛选频率对转化体系进行了优化，结果表明：比较适宜的感染液浓度为OD600=0.5；预培养有利于幼胚转化，预培养时间以刚刚诱导出新鲜稳定的初始愈伤为宜。适当降低共培养温度到22℃可以提高农杆菌介导的玉米遗传转化的筛选频率和PCR阳性率。     

农杆菌介导法将Bt杀虫蛋白基因导入玉米自交系的研究

利用β-葡萄糖苷酸酶(gus)基因的瞬时表达和稳定表达对农杆菌转化玉米愈伤组织的条件进行优化,通过用带有Bt抗虫基因和bar抗除草剂基因的根癌农杆菌LBA4404(ACT)转化玉米自交系7922、H99和P2的胚性愈伤组织,获得了抗性愈伤组织,并分化出植株,PCR检测初步证明Bt杀虫蛋白基因已整合到玉米再生植株中。     

根癌农杆菌介导转化抗虫基因获得转基因烟草

将抗虫ＰＩ基因构建到ｐＩＧ１２１Ｈｍ质粒的Ｔ－ＤＮＡ上，利用农杆菌ＬＢＡ４４０４介导转化烟草，获再生植株。经ＧＵＳ检测和Ｄｏｔ ｂｌｏｔ分析，证实外源基因已插入植物细胞基因组中，再生植株的转化率为６４．３％。     

根癌农杆菌介导转化抗虫基因获得转基因烟草

将抗虫ＰＩ基因构建到ｐＩＧ１２１Ｈｍ质粒的Ｔ－ＤＮＡ上，利用农杆菌ＬＢＡ４４０４介导转化烟草，获再生植株．经ＧＵＳ检测和Ｄｏｔｂｌｏｔ分析，证实外源基因已插入植物细胞基因组中，再生植株的转化率为６４．３％．     

大豆铁蛋白基因GmFerritin在玉米中的遗传转化

使用In-Fusion试剂盒构建表达载体pCUB-Zein::ferritin-35s::bar,以玉米自交系齐319茎尖分生组织为受体,采用农杆菌介导法,将玉米胚乳特异启动子基因15 kDβ-Zein驱动的大豆铁蛋白ferritin基因转入玉米,共筛选出272株除草剂(草铵膦)抗性植株,其中108株PCR检测呈阳性,转化率达3.6%,初步判断Zein::ferritin基因已转入玉米基因组中。     

农杆菌介导甜高梁转Bt cry1Ah的研究

[目的]建立一套高效、稳定的甜高梁农杆菌遗传转化体系,并在甜高梁中验证来源于苏云金芽胞杆菌新型杀虫基因cry1Ah表达产物的杀虫活性.[方法]以甜高粱幼穗愈伤组织为转化受体,通过农杆菌介导法将密码子优化过的Bt cry1Ah导入2个甜高梁品种"BABUSH"和"MN-3025"中.对获得的再生植株进行 PCR检测、RT-PCR分析及除草剂抗性、目的蛋白表达水平和抗虫性鉴定分析.[结果]对336块幼穗愈伤组织块进行了农杆菌侵染,经双丙氨膦(Bialaphos)梯度筛选后共获得66株再生植株,PCR鉴定在8个转化事件中有22株为阳性植株,平均转化率为2.38%.RT-PCR检测结果表明,cry1Ah在T.甜高梁转基因植株中能够正常转录.Western blotting分析和ELISA定量测定显示,有5株可检测到Bt蛋白,但Bt蛋白含量差异较大,最高可达165.69ng·g-1叶片鲜重(FW),最低的仅为1.93 ng·g,-1叶片鲜重(FW),平均为87.50 ng·g-1FW.饲虫试验表明,有2株转基因甜高粱植株对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)表现为抗性.[结论]利用建立的以甜高粱幼穗为外植体的农杆菌遗传转化体系,可获得具有玉米螟抗性的转基因甜高粱植株,其后代遗传稳定性还有待于进一步的研究.     

抗虫、抗除草剂转基因玉米的获得及遗传研究

利用PIG基因枪，将cryLA(b)基因和bar基因，采用共转化法导入玉米自交系的幼胚中，经PPT筛选，获得抗性愈伤组织并再生植株。除草剂抗性检测、点杂交和Southern杂交分析表明，在多数转基因植株中cryLA(b)基因和bar基因共整合，且呈孟德尔单位点显性基因连锁遗传。Northern杂交及ELISA检测表明，cryIA(b)基因在转录和翻译水平进行也有效的表达。部分转基因植株表现出明显的抗虫活性。     

普通不结球白菜抗虫转基因植株的获得

以普通不结球白菜品种“中脚黑叶”和“矮脚黑叶”种子无菌苗的子叶为外植体材料,在附加２ｍｇ／Ｌ ＣＰＰＵ、０．１ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ和７．５ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ３的稍作修改的ＭＳ培养基上诱导不定芽,子叶（柄和子叶切段诱导不定芽频率分别为３２．５２％、４．３５％和４．７９％、１１．５５％。应用农杆菌介导法将含有豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（ＣｐＴＩ）和新霉素磷酸转移酶基因（ＮＰＴⅡ）的重组质粒导入普通不结球白菜,获得具有卡那霉素抗性的再生植株。具有卡那霉素抗性的当代转基因植株（Ｔ０）及其自交后代（Ｔ１）植株经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分子检测,确认抗虫基因已整合到受体植株的基因组中,并通过有性生殖遗传给后代。体外生物学测定结果,显示抗虫性在转基因植株自交后代植株中得到表达。     

根癌农杆菌对结球白菜的转化

为了给外源有用基因导入结球白菜并高效稳定地表达提供依据，以结球白菜的子叶－子叶柄为外植体，采用农杆菌共培养法把外源基因C58／pV11导入结球白菜，在选择最优的转化条件－根癌农杆菌侵染外植体15min，农杆菌培养和共培养时在培养基中均加入AS，培养基pH为5．2，共培养3d的条件下，获得转基因植株，其中抗性植株的抗草丁膦试验，转基因植株DNA的PCR及PCR－Southern斑点杂交鉴定等结果表明，50％的抗性植株的基因组中有外源基因的整合。     

花粉管通道法将Bt毒蛋白基因导入优良玉米自交系

以杂交育种中广泛使用的优良玉米自交系为材料，用花粉管通道法介导质粒pGBIL04(actin.Bt.35S.bar）DNA的转化，经对T0代1403株植株Basta抗性筛选和PCR分子鉴定，共获得5株PCR阳性植株，分别为授粉后8，12，14，18h导入所得，总的平均转化率为0.36%。结果表明：只要掌握好导入时机，在玉米上用花粉管通道法转基因是完全可行的。     

转Bt基因抗虫红麻福红952后代的分子杂交验证

利用花粉管通道法将抗虫质粒DNA导入受体红麻品种福红952,在受体品种中获得Bt抗虫目的基因的表达.分别用PCR和Southern杂交技术,对所转化的红麻转基因4个世代的株系进行分子验证,结果表明：4个世代中都检测到B t抗虫目的基因片段,说明外源基因已经整合到红麻的基因组中并获得了稳定遗传.     

转Bt基因抗虫红麻福红952后代的分子杂交验证

利用花粉管通道法将抗虫质粒DNA导入受体红麻品种福红952,在受体品种中获得Bt抗虫目的基因的表达.分别用PCR和Southern杂交技术,对所转化的红麻转基因4个世代的株系进行分子验证,结果表明:4个世代中都检测到B t抗虫目的基因片段,说明外源基因已经整合到红麻的基因组中并获得了稳定遗传.     

分子技术对表达GFP转基因胚胎的再检测

把经脂质体包埋的含CD59基因的重组质粒pEGFP-CD59注进小鼠睾丸组织和小鼠的输精管中,分别过1个月和7d与经过超排处理的母鼠交配,在胚胎发育的不同发育时期冲出胚胎于荧光显微镜下观察,显出荧光的转基因小鼠胚胎经PCR和Southern杂交检测确认,转基因小鼠胚胎阳性率为11%(3/27).表明GFP基因不能完全准确地反映转基因的情况,需要用PCR结合Southern杂交方法对表达绿色荧光蛋白转基因胚胎进行再检测.     

南方水稻黑条矮缩病毒的新的自然寄主

2010年,由南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)引起的新水稻矮缩病在湖南省大面积爆发.为确定南方水稻黑条矮缩病毒的自然寄主范围,采集湖南省永州零陵、邵阳隆回、郴州宜章等地发病田块及附近的禾本科作物及杂草,提取RNA后,用自行设计的专利引物对,对其进行RT-PCR检测,发现高粱、野燕麦、牛筋草是新的SRBSDV自然寄主.     

光滑鳖甲抗冻蛋白基因(AP-AFP060116)表达规律的研究

研究以克隆的光滑鳖甲抗冻蛋白基因(AP-AFP060116,Apafp)为目的基因,采用半定量RT-PCR技术,首次探讨了该基因在不同低温处理下的表达规律.半定量RT-PCR实验结果表明光滑鳖甲成虫经历长时间冷驯化后,体内Apafp基因的表达水平增高.计算半定量RT-PCR产物电泳图像的灰度值,结果显示在低温处理的第5 d,昆虫体内Apafp基因的表达水平与对照组相比差异显著(P＜0.05).快速冷驯化实验结果显示,处理组与对照组昆虫体内Apafp基因的表达水平没有明显的差异.同时使用Southern blot技术证明光滑鳖甲抗冻蛋白基因家族的存在.     

加速南方农业发展迎接新世纪粮食挑战

分析了建国以来中国粮食生产发展的特点 ,以及中国南方农区在今后粮食增产中的潜力、作用和地位 ,提出开发南方粮食生产潜力保证满足下世纪前期中国粮食消费需求的战略思考 ,并就如何开发南方粮食生产潜力提出了建议。     

南方丘陵区土地整理的误区及对策探析

通过剖析当前南方丘陵区土地整理普遍存在单纯追求增加耕地数量、固定的整理模式和高品位规划设计、后续效益与市场经济脱节,缺少产业支撑的误区。结合南方丘陵区土地整理的效益目标,提出土地整理应针对南方丘陵区特有的土地生态经济系统,根据其特殊的交通、地质、地形地貌和耕作制度,从提高耕地质量、加强生态环境保护、提高项目后续效益入手,因地制宜进行规划设计。     

2010年湖北省水稻南方黑条矮缩病的流行调查与研究

通过田间考察、白背飞虱监测、室内分子鉴定等方法调查研究2010年湖北省水稻南方黑条矮缩病的流行概况,掌握了湖北省水稻南方黑条矮缩病毒病发生的面积、发生程度、水稻品种感病性、介体昆虫种群动态等情况。研究结果显示,水稻南方黑条矮缩病在湖北省长江沿线的荆州、孝感、咸宁、黄石、鄂州、黄冈等地的水稻种植区普遍发生,水稻品种普遍感病,该病毒病已随介体昆虫白背飞虱从南方水稻种植区传播至处于长江流域的中部水稻种植区,并有进一步向长江以北扩散的趋势。     

抗菌肽CEMA的改造与人工合成

抗菌肽是一类广泛存在的小分子抗菌多肽物质.从目前所鉴定的抗菌肽来看,大多在体外有很强的抑菌作用,部分在体内也有很好的抑菌效果.CEMA是一种有抑菌活性的阳离子抗菌多肽,但由于对植物细胞的毒害作用,其在植物抗病基因工程中的应用受到很大的限制.为了在不降低其强抑菌活性的同时,降低对植物细胞的毒害作用,对CEMA进行了改造.编码小分子量蛋白的基因的获得,大多采用人工合成的方法.合成两条长链部分互补引物,经Klenow酶延伸补平是获得目的基因的重要方法之一.该文介绍了一种在此方法基础上的PCR扩增技术,并对两种方法进行了比较.     

PCR检测转基因大豆

［目的］定性检测转基因大豆。［方法］以非转基因大豆和CP4-EPSPS转基因大豆为材料,以大豆内源基因Lectin和外源基因5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因（CP4-EPSPS）为检测的目的片段,建立PCR反应体系。采用改进CTAB法提取大豆基因组DNA,并对所提DNA进行PCR扩增和电泳检测,确定转基因大豆的PCR检测限。［结果］改进CTAB法提取的大豆基因组DNA电泳条带清晰完整,转基因大豆和非转基因大豆基因组DNA均可扩增出约409 bp的条带即Lectin基因,而只在转基因大豆中检测出CP4-EPSPS特异性片段;当转基因大豆的含量为100%～0.2%时,均可扩增出特异性条带。［结论］该研究建立了转基因大豆的PCR检测方法。