酵母SAMDC基因表达载体构建以及农杆菌介导转化番茄的研究

SAMDC(腺苷甲硫氨酸脱羧酶)是参与植物多胺合成的一个关键酶.通过GenBank上已经发表的序列,设计两对引物,分别以酵母基因组DNA和番茄基因组DNA为模板克隆出SAMDC基因和E8启动子.构建了以CaMV35S和E8为启动子的两个SAMDC基因植物表达载体,酶切分子鉴定后,经农杆菌介导以叶盘法转入番茄中,获得了转基因植株.经PCR检测和X-Gluc组织化学染色检测,目的基因已经成功转入番茄中.为研究多胺在番茄中代谢活性以及SAMDC基因对番茄抗逆性和番茄果色的影响提供了研究基础.     

番茄ISSR-PCR反应体系的优化与验证

研究番茄ISSR-PCR反应体系中主要因子TaqDNA聚合酶、dNTP、引物和DNA模板的浓度及各引物的退火温度对扩增结果的影响,建立番茄ISSR- PCR反应的优化体系,为ISSR 技术在番茄分子辅助育种应用提供参考。实验确定番茄ISSR-PCR 20 μL反应体系为：2.0 μL 10×PCR缓冲液,0.3 μmol/L引物,50 ng模板DNA,0.5 mmol/LdNTP,2 U TaqDNA聚合酶,各引物最佳退火温度有所不同。     

植物高渗转基因新技术的初步建立

以番茄愈伤组织和水稻愈伤组织为转化受体,以pBG和pB1121为外源DNA,以蔗糖和甘露醇为渗透剂,对植物高渗转基因技术进行了研究．结果表明：高渗转化后愈伤组织GUS基因瞬问表达率为38．9％,经抗性筛选,获得番茄和水稻Basta抗性愈伤组织,番茄Basta抗性愈伤组织经分化培养后,共得到29个Basta抗性芽,证明植物高渗转基因技术得到初步建立。     

分子标记技术在番茄抗性育种中的应用

介绍了DNA分子标记的各种类型,RFLP、RAPD、SSR、AFLP和SNP标记是植物遗传作图最常用的,介绍了各种类型的使用范围以及优点和缺点。综述了近年来DNA分子标记技术在番茄抗性育种中的应用,包括耐冷性,耐盐性,抗病性,抗虫害等方面的应用,并就今后番茄分子育种主要研究方向进行了讨论。     

番茄AFLP技术体系的优化与建立

以番茄为材料,通过对扩增长度多态性(AFLP)反应体系中的几个关键参数进行优化,建立了适合于番茄的AFLP分子标记体系。结果表明,用于反应的DNA采用CTAB法提取较好,酶切的基因组DNA以100 ng为宜,酶切-连接采用一步法,37℃条件下进行,反应时间为10 h,预扩增产物的稀释倍数以30倍为宜,采用优化好的体系,29对引物组合在两份供试材料均可扩增出稳定清晰的带纹60～100条。本研究为番茄的分子标记克隆及抗病育种的辅助选择提供了有力工具。     

番茄SSR-PCR反应体系的优化

为了确定番茄的SSR-PCR的最佳反应体系,采用2×Taq PCR Master Mix,对Taq酶、Mg2+、dNTPs进行综合考虑,探究其对番茄SSR-PCR反应体系的影响,并优化出最佳的反应体系。结果表明:引物用量对结果影响最大,其次是DNA用量,Master Mix用量对结果影响最小。最佳反应体系为:模板(50ng·μL-1)DNA2μL,Master Mix 9μL,引物3μL。     

基于转录组分析的SlCMT4基因敲除对番茄花器官的影响

[目的]DNA甲基化是由DNA甲基转移酶催化的重要表观遗传修饰,DNA甲基转移酶在植物发育、转录控制和代谢途径调控中具有重要作用。本研究旨在明确DNA甲基转移酶基因SlCMT4调控番茄花器官形成和发育的表观遗传机制。[方法]本研究以经典番茄栽培品种Ailsa Craig(AC++)为背景材料,采用CRISPR-Cas9基因编辑技术,获得SlCMT4突变株系。我们提取番茄花器官RNA,进行转录组测序,根据差异基因进行基因功能及代谢通路分析。[结果]研究了SlCMT4基因在野生型（AC++）和突变体番茄（Nr和Rin）不同果实发育阶段的表达模式,发现该基因在番茄成熟突变体Nr和Rin果实中的表达水平显著高于野生型番茄,表明SlCMT4基因的表达可能受激素乙烯信号和成熟相关转录因子RIN的负调控。SlCMT4基因敲除导致番茄花器官出现多种表型,包括雄蕊卷曲、雌蕊变粗变短等。我们在突变株系（CR-08）的花器官样品中鉴定了1398个差异表达基因（DEG）,其中512个上调,886个下调。差异表达基因的KEGG分析结果表明,大多数差异表达基因被归类为以下5条功能代谢通路：植物激素信号转导、苯丙烷...     

梨属植物RAPD反应体系的建立与优化

以鸭梨、杜梨为材料,对梨属植物DNA的提取及RAPD反应体系进行了系统优化,建立了梨属植物最佳反应体系及参数。结果表明,适当提高抗氧化、抗酚类物质的浓度(2%β-巯基乙醇,2%PVP-40,20 mmol/LNa2S2O5),提取的基因组DNA纯度较高;反应体系中含有Mg2+2.0 mmol/L,dNTPs浓度200μmol/L,引物0.4μmol/L,模板DNA 1.6 ng/μL,Taq DNA聚合酶0.06 U/μL,可成功用于梨属植物RAPD扩增。说明改良的CTAB法能成功用于梨属植物DNA提取,建立的最佳反应体系可用于梨属植物RAPD扩增。     

江苏省及其他地区番茄黄化曲叶病毒的分子鉴定及序列分析

正番茄黄化曲叶病(Tomato yellow leaf curl disease,TYLCD)是一种严重威胁番茄农业生产的病害,该病是由番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)引发,通常感病的番茄植株表现为顶部叶片皱缩、黄化、卷曲,严重的植株矮化、停止生长等[1-2]。番茄黄化曲叶病毒是双生病毒,在植物病毒中是具有孪生颗粒形态的单链环状DNA(Single     

几个番茄品种AFLP指纹图谱的建立

应用优化的AFLP技术体系,构建了7份番茄黄化曲叶病毒病抗病材料和1份感病材料的指纹图谱。根据所得到的DNA指纹图谱数据,进行亲缘关系和遗传多样性分析。从64对引物中筛选出扩增效果稳定、多态性好的5对引物组合,分别对8份材料的基因组DNA进行扩增,共扩增出清晰的条带149条．其中62条带具有多态性,多态性位点百分率为41．6％。这一结果表明供试抗感黄化曲叶病毒病番茄材料在DNA水平上酶切位点的分布存在一定的差异。供试材料间的遗传相似系数的变化范围为0．83—0．95。以遗传相似系数0．89为阈值,进行UPGMA聚类分析,将8份番茄材料分成1个复合组和3个独立组。以上结果在DNA水平上为番茄抗黄化曲叶病毒病育种的亲本选配提供了参考依据。     

利用转基因番茄表达血管内皮生长因子的研究

【目的】应用基因工程技术,获得表达血管内皮生长因子（VEGF）的转基因番茄植株,为以番茄作为生物反应器生产药用蛋白奠定基础。【方法】利用植物偏好的密码子改造合成VEGF基因全长,构建植物表达载体p1390RVEGF,通过农杆菌菌株EHA105介导将其T-DNA区转入到番茄细胞中,再生后获得转基因番茄植株,对其进行分子和蛋白水平检测。【结果】成功构建了植物整株表达载体p1390R-VEGF,建立了高频的番茄再生培养体系;PCR检测、Southern blot和Western blot检测结果表明,VEGF基因已经转入番茄中,并成功得到了表达。【结论】得到了转基因番茄植株和果实,且VEGF蛋白有良好的抗原性。     

四川番茄黄化曲叶病病原分子鉴定及变异分析

 【目的】明确引起四川番茄黄化曲叶病（Tomato yellow leaf curl disease,TYLCD）的病原。【方法】对采自四川攀枝花市田间表现矮化、黄化和曲叶症状的番茄植株SC64-67,通过PCR、克隆及测序等技术获得病毒及卫星DNA的全基因组序列,并对序列进行变异分析。【结果】利用双生病毒简并引物PA/PB从4个样品中均扩增得到约500 bp的片段,随机选择SC65进行DNA-A全基因组扩增和序列测定,该DNA分子全长为2 732 nts,系统进化分析表明,其与已报道的中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV）来自云南元谋的菜豆分离物（TYLCCNV-Bean-YM）的核苷酸序列相似性最高,为96.0%。检测发现,所有分离物均伴随有卫星DNAβ分子。全序列测定表明SC65 DNAβ全长1 338 nts,与分离自云南楚雄番茄上的TYLCCNV-Y25伴随的卫星DNAβ亲缘关系最近,核苷酸序列相似性为77.5%。【结论】研究表明四川番茄黄化曲叶病样品均受到TYLCCNV/DNAβ病害复合体的侵染,但其病毒DNA-A和卫星DNAβ分子来源于TYLCCNV的不同分离物。     

安徽淮北番茄曲叶病的病原鉴定初报

采用分子手段鉴定了安徽淮北番茄曲叶病的病原.从安徽淮北番茄温室采集番茄叶片样本,用CTAB法从番茄叶片中提取总DNA.利用简并引物PA、PB进行PCR扩增,从大部分样本中扩增出双生病毒500 bp特异性条带.将扩增片段克隆并测序,该片段序列全长541 bp,与我国报道的番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)各个分离物序列相似性均很高,达到95.9%～99.4%,可以初步明确侵染安徽淮北番茄的双生病毒为番茄黄化曲叶病毒(TYLCV).安徽淮北TYLCV 500 bp片段序列与山东TYLCV相似性最高,达99.4%,而且从构建的系统关系树也可以看出,安徽淮北TYLCV与山东TYLCV的亲缘关系最近,推测安徽淮北番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)可能来源于山东.     

番茄白粉菌的PCR分子检测

根据番茄白粉菌核糖体DNA的ITS(internal transcribed spacer)序列的特异性,设计2对引物OidF1/R1、OidF2/R2,对番茄白粉菌进行了PCR特异性扩增试验。结果表明:2对引物都可以从番茄白粉菌基因组DNA中扩增出350 bp左右的特异性扩增产物,并具有专一性,只在白粉菌和接种感病组织DNA中有扩增条带,而番茄早疫病菌、叶霉菌以及健康组织DNA中均无特异性扩增片段;引物具有高度的灵敏度,可以检测含有1 ng的番茄白粉菌DNA。由此证明,该方法可快速、准确和灵敏地鉴定和检测番茄白粉病的发生。     

一种适于番茄RAPD分析的DNA快速提取方法

笔者通过比较快速提取方法和常规方法提取的DNA的质量和RAPD扩增结果,建立了一种适合番茄RAPD分析的快速,简单,成本低的DNA提取方法。该方法的材料不用液氮和Rnase消化处理。     

高质量加工番茄基因组DNA提取方法的改进

加工番茄在生长过程中会富积大量的多糖、蛋白质和其他次生代谢物质,采用文献报道的方法不易提取(高质量的)DNA或提取的DNA溶液容易降解.采用改进的CTAB法,提取加工番茄幼嫩叶片和老叶片的基因组DNA,经紫外分光光度计和凝胶电泳检验,提取到的DNA纯度高、完整性好,PCR扩增能得到明显的多态性谱带,可直接用于后续相关试...     

4种杀虫剂对番茄叶片GSH-ASA抗氧化系统的影响

为揭示杀虫剂对番茄叶片谷胱甘肽-抗坏血酸(GSH-ASA)氧化还原系统的影响,以粉番一号番茄为试验材料,采用田间试验方法,设定噻虫嗪、毒死蜱、苏云金杆菌、氯虫苯甲酰胺4种不同类型杀虫剂处理,以清水处理为对照,并针对处理后的番茄叶片组织内GR酶活性、GSH含量、ASA含量、GSH/GSSG、ASA/DHA在一段时间内的变化进行检测与分析。结果表明:4种杀虫剂处理后,番茄植株体内GSH-ASA抗氧化系统中的各物质含量及GR酶活性与对照植株之间均存在显著性差异,其中苏云金杆菌、毒死蜱和氯虫苯甲酰胺处理12h后植株组织内GR酶活性分别为0.185U/(g·min)、0.162U/(g·min)、0.162U/(g·min),而噻虫嗪处理在24h时植株组织内GR酶活性达最大值0.155U/(g·min)。尤其是在6~24h变化最显著,随着时间的延长,差异减小,在杀虫剂处理后168h基本恢复到对照水平,说明杀虫剂处理后,番茄植株体通过谷胱甘肽-抗坏血酸氧化还原系统对外源杀虫剂处理做出响应,但是植株对不同杀虫剂的响应有所不同,相对而言,在常用剂量的4种杀虫剂中,苏云金杆菌处理对番茄叶片抗氧化系统的影响作用最小。     

4个番茄品种及其亲本指纹图谱的构建

采用改良的CTAB法提取番茄4个品种及7份品种亲本的基因组DNA,通过AFLP-PCR分子标记方法进行DNA指纹分析,构建亲本及品种的指纹图谱.从20对引物中筛选出9对重复性好,多态性丰富的AFLP引物来构建番茄指纹图谱,7份亲本材料扩增的多态性位点从10～27条不等,平均每份材料17.56条,多态性位点比例为41.2...     

基于锁式探针的番茄溃疡病菌实时荧光PCR快速检测

【目的】从口岸进境番茄种子中检测番茄溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis,CMM）,一直以来都受检测周期的限制,快速、特异地从种子中检测该病原细菌需要新的方法。研究在锁式探针扩增方式上,选择连接酶依赖的PCR扩增方式,并结合实时荧光PCR技术,旨在建立番茄溃疡病菌基于锁式探针技术的实时荧光PCR快速检测方法,为口岸番茄种子快速检疫提供技术支持。【方法】根据番茄溃疡病菌的一段特异基因Pat-1序列,设计锁式探针的T1和T2臂,使之与CMM的特异性片段碱基序列互补,再按照锁式探针的设计原则设计锁式探针和扩增引物以及荧光探针。试验时,先将锁式探针与CMM以及参照菌株的DNA模板在DNA连接酶作用下分别进行环化连接,再用核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ消化未环化的线性锁式探针,最后以环化的锁式探针为模板,在扩增引物的作用下进行实时荧光PCR试验。建立CMM基于锁式探针技术的实时荧光PCR检测方法,分别比较该方法的特异性和灵敏度与常规PCR方法的差异,并用该方法对收集的来自日本、韩国和中国台湾的番茄种子以及国内采集的共45份样品进行检测。【结果】基于锁式探针技术的实时荧光PCR检测方法能够从供试的菌株中特异性地检出CMM,在供试的10种菌株中,只有靶标细菌能被特异性地检测到阳性,空白对照和其他参试菌株均没有荧光信号的增加,检测为阴性。比较该检测方法与常规PCR方法,其特异性和常规PCR方法一致。该检测方法检测灵敏度高,DNA最低浓度检测为50 fg•μL-1,而常规PCR方法检测DNA最低浓度为5 pg•μL-1,灵敏度高于常规PCR两个数量级。对收集的样品进行检测,结果显示,45份样品中共有5份样品CMM检测结果为阳性,分别是日本的番茄种子样品2份（编号Jap1214、Jap1102）,永泰采集的样品2份（编号为Yongt1001、Yongt1002）和闽清采集的样品1份（编号为Minq1001）。【结论】建立的基于锁式探针技术的荧光PCR方法具有高度的特异性和灵敏度,应用该检测方法对收集的进境番茄种子进行检测,可以直接从番茄种子中检测到CMM,该方法适合口岸番茄种子CMM的快速检测,有较好的口岸检疫实际应用价值。