苜草素对小鼠巨噬细胞RAW264.7β-防御素基因表达的影响

本实验采用LPS刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞0、6、9、12、18、24 h,观察不同种类(mouse beta defensins,mBDs)mRNA表达水平的影响;采用含有0.2、0.4、0.6、1.0 mg/mL 苜草素的细胞培养液处理RAW264.7细胞,观察其对RAW264.7细胞mBDs的mRNA表达水平的影响.结果表明:mBD-4的表达不受LPS影响,mBD-2和mBD-3的表达受到LPS诱导时间的影响;含苜草素的细胞培养液可使mBDs的表达上调,0.2mg/mL效果最明显.苜草素可以使RAW264.7细胞mBDs的表达升高,这可能是苜草素参与免疫调节,提高动物机体免疫力的机制之一.     

玉屏风散对小鼠β防御素-2基因表达的影响

研究玉屏风散益气固表、提高机体对环境病因抵抗力的机理。实验组6只小鼠以玉屏风散水煎液灌胃10 d,对照组6只小鼠给予同体积生理盐水,处死动物后提取肺组织总RNA,通过实时荧光定量PCR测定小鼠在灌服玉屏风散水煎液后β防御素-2基因表达水平。结果实验组小鼠β防御素-2基因的相对表达量是对照组的9.327倍。表明玉屏风散增强机体抵抗力与其可上调β防御素-2基因的表达从而提高机体非特异性免疫力有关。     

哺乳动物β-防御素研究进展

防御素是广泛分布于动植物界的一类富含半胱氨酸的内源性阳离子抗菌肽,它在先天性免疫系统宿主防御机制中起着重要的作用。笔者从哺乳动物β-防御素的组成分布入手,对β-防御素的分子结构与染色体定位、基因表达调控、生物学作用及应用前景等最新研究作一全面综述。     

禽类β-防御素的研究进展

本文对禽类β-防御素的分子结构、组织分布、抗菌作用以及基因工程研究进展进行了综述。     

猪源β-防御素2和3的研究进展

防御素是一类阳离子抗菌肽,广泛存在于动物和植物体内。猪源β-防御素2和β-防御素3能抵抗猪体内病原微生物,并能调节机体免疫功能,对生殖发育也有一定的生理作用。猪源β-防御素2能促进仔猪生长,对猪红细胞毒性低,能在毕赤酵母中高效表达,其转基因猪也具有较好的抗病性能。因此,猪防御素具有潜在的应用价值。本文就猪源β-防御素2和β-防御素3在体内的表达分布和调控因素、参与调节的信号通路、在生殖发育和畜牧养殖方面的新功能及应用潜力进行综述。     

重组鸭β-防御素-2对肉鸭生长性能的影响

试验旨在研究鸭β-防御素-2制剂对肉鸭生长性能的影响.将试验雏鸭分为5组,每组4个重复,每重复50只鸭.A组为基础饲粮(不合任何抗生素);B组为基础饲粮+抗生素;C组为基础饲粮+重组鸭β-防御素-2制剂(300 g/t);D组为基础饲粮+重组鸭β-防御素-2制剂(450g/t);E组为基础饲粮+重组鸭β-防御素-2制剂(600g/t).结果表明:50日龄肉鸭末质量,C组比A和B组分别高4.09％和3.10％,均具有显著差异.日均增质量,C组比A和B组分别高4.17％和3.25％,差异均显著.日均采食量,E组比D组高6.49％,差异显著.料重比,C组比A、B和E组分别低3.05％、3.05％和5.71％,差异显著;D组比A、B和E组分别低3.91％、3.91％和6.54％,差异显著.结果表明:重组鸭β-防御素-2制剂对肉鸭生长性能均有正面效果,但添加不同剂量的效果有差异.     

鼠李糖乳酸杆菌LG_A对鸡小肠上皮细胞β-防御素-9基因表达的影响

本研究旨在研究益生性鼠李糖乳酸杆菌LGA对体外培养的鸡小肠上皮细胞β-防御素-9 (AvBD9)表达的调节作用.选用鼠李糖乳酸杆菌LGA对体外培养的鸡小肠上皮细胞进行剂量依赖性及时间依赖性刺激实验,利用实时荧光定量PCR(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)从mRNA水平研究刺激后上皮细胞AvBD9基因表达水平的差异.结果表明,不同浓度(2×105、2×106、2×107 cfu· mL-1)鼠李糖乳酸杆菌LGA均能上调AvBD9mRNA的表达,且在不同细菌浓度之间AvBD9 mRNA的表达存在差异.热灭活鼠李糖乳杆菌LGA亦能上调AvBD9基因表达,且上调值显著高于活菌(P＜0.05).鼠李糖乳杆菌LGA刺激上皮细胞后AvBD9表达存在时间依赖关系,12 h时AvBD9的表达达到峰值.Western blot检测结果显示,鼠李糖乳杆菌LGA刺激后的上皮细胞培养上清中存在AvBD9蛋白表达,表明AvBD9蛋白可以分泌到细胞外而发挥其生物学功能.益生性鼠李糖乳酸杆菌LGA与鸡肠道上皮细胞的相互作用过程中,鼠李糖乳酸杆菌LGA能够促进上皮细胞抗菌肽β-防御素-9的表达.本研究结果提示益生性乳杆菌可能通过促进肠道上皮抗菌肽的表达而发挥其益生作用.     

β-防御素研究进展

β-防御素是近年来发现的一类广泛存在于动物体内具有广谱抗微生物活性的阳离子多肽。它具有抗细菌、真菌、螺旋体和部分带囊膜病毒及杀伤肿瘤细胞等多功能效应,在解决细菌耐药、抗病毒、调动机体的免疫功能及抗肿瘤方面有重要作用,并且一般不产生耐药性,因而其已成为当前学术界中一个引人关注的研究热点。文章就β-防御素的分子结构、生物学活性、作用机理、应用等方面做一综述。     

绵羊β-防御素的研究进展

β-防御素是由上皮细胞产生的富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽,具有广谱抗微生物活性,可代替抗生素应用于畜牧生产实践中,保障畜产品的生物安全。文章对绵羊β-防御素的分布、结构、生物学功能以及体外表达等最新研究进展作一综述,旨在供研究者参考。     

猪β防御素-1的研究进展

猪β防御素-1 (porcine β-defensin 1,PBD-1)是广泛分布于猪消化道、呼吸道、肝肾等多种组织细胞内的一类活性多肽,在猪防御系统中有着重要的作用,大量研究结果证明PBD-1具有独特的作用机制,几乎无耐药性, 已引起各国研究者的日益重视。目前对PBD-1科研工作在不断深入,可以相信PBD-1将在动物养殖、疾病预防和提高畜产品品质方面发挥重要作用。作者就PBD-1的分布、分子结构、抗菌作用机制和基因表达调控研究进展作一综述。     

猴头菇多糖对MDRV感染RAW264.7细胞TLR3/TRIF诱导表达及病毒复制的影响

试验旨在探究猴头菇多糖（HEP）预处理RAW264.7细胞对番鸭呼肠孤病毒（MDRV）复制的影响及其机制,从Toll样受体3/β干扰素TIR结构域衔接蛋白（TLR3/TRIF）信号通路解析HEP在调节MDRV所致的雏番鸭机体免疫抑制中的作用机制并提供体外试验参考。试验设空白对照组（BCG）、病毒感染对照组（VCG）、HEP对照组（HCG）和HEP预防病毒感染组（HPG）,RAW264.7细胞在MDRV感染12和24 h后,通过Western blotting检测各组细胞中TLR3、TRIF和肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）的蛋白表达量;病毒感染24 h后,用ELISA法检测各组细胞培养液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-10（IL-10）、IL-6、IL-1β、干扰素-β（IFN-β）的含量。TCID₅₀检测结果表明,MDRV病毒的TCID₅₀为10^3.46。病毒感染后12 h,细胞未出现明显变化;病毒感染后24 h,细胞变圆;病毒感染后36 h,细胞大量死亡。MDRV在RAW264.7细胞中的复制结果显示,在感染病毒12~24 h内,σNS的表达量呈现上升趋势;在24~36 h,σNS的表达量维持在较高水平。Western blotting结果显示,与空白对照组相比,VCG组细胞TLR3、TRIF和TRAF6蛋白的表达量在感染后12和24 h均显著升高（P<0.05）,HCG组TRIF蛋白的表达量均显著升高（P<0.05）;与感染组相比,HPG组的σNS、TLR3、TRIF和TRAF6蛋白表达量在病毒感染12和24 h均显著降低（P<0.05）。ELISA检测结果显示,与空白对照组相比,VCG组细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-β的含量均显著升高（P<0.05）;与感染组相比,HPG组细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β含量均显著降低（P<0.05）,IFN-β的含量显著升高（P<0.05）。结果表明,HEP可调节MDRV感染诱导RAW264.7细胞TLR3信号转导通路活化,抑制TLR3信号转导通路下游产物TNF-α、IL-10、IL-6和IL-1β的过度表达,同时上调IFN-β的表达,从而抑制MDRV在RAW264.7细胞中的复制。     

9种豆科牧草总黄酮和总皂苷积累规律的研究

黄酮和皂苷不仅是植物中重要的防御性次生代谢产物,而且具有显著的药理和生理活性,对于植物的抗性研究和工业化应用具有重要意义。对鹰嘴紫云英(Astragalus cicer L.)、红豆草(Onobrychis viciaefolia Scop)、百脉根(Lotus corniculatus L.)、小冠花(Coronilla varia L.)、黄花草木樨(Melilotus officinalis(L.)Desr.)和苜蓿(Medicago L.)多种豆科牧草中总黄酮和总皂苷的周年积累规律和分布特点进行研究,以期为豆科牧草建立科学的牧刈制度和合理应用提供理论依据。结果表明:总黄酮和总皂苷在不同属间和品种间的动态变化各不相同;在不同组织中的分布也不同,在整个生育时期,均为叶片中的含量多于茎秆中的。前5种豆科牧草的总黄酮含量显著高于苜蓿,是提取总黄酮的优质材料;红豆草、鹰嘴紫云英、黄花草木樨及苜蓿的总皂苷含量均高于小冠花和百脉根,是提取皂苷产品的优质材料。     

西番莲多糖提取物对猪圆环病毒2型感染RAW264.7细胞氧化应激的影响

为研究西番莲多糖提取物（Passiflora edulis polysaccharide extract,PEPE）对猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）感染RAW264.7细胞氧化应激相关因子的影响,本试验探讨了PEPE对氧化应激的调节作用。在96孔细胞培养板中每孔加入100 μL浓度为1×10⁶个/mL的RAW264.7细胞,分别设细胞对照组、PEPE组（25、50、100、200、400、800和1 600 μg/mL）,分别于培养箱培养24和48 h,用MTT法检测细胞活性,筛选PEPE的药物安全浓度范围。试验分为以下6个组：细胞对照组、病毒组、PEPE高（400 μg/mL）、中（200 μg/mL）、低（100 μg/mL）剂量组及维生素C组,其中细胞对照组加入含10% FBS的DMEM培养液,其余组加入PCV2病毒液,孵育2 h后在PEPE组加入对应浓度的PEPE溶液,VC组加入配制好的VC溶液,细胞对照组和病毒组加入含10% FBS的DMEM培养液,培养48 h,同样用MTT法检测细胞活性,以研究PEPE对PCV2感染RAW264.7细胞活性的影响。按照上述6个试验组分组,处理同上,将细胞培养12 h,收集样品用于检测氧化应激相关因子水平。用Griess法和DCFH-DA荧光探针分别检测RAW264.7细胞上清中NO含量和细胞内活性氧（ROS）水平、OPT荧光法检测细胞内还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量,化学发光法检测细胞内黄嘌呤氧化酶（XOD）、髓过氧化物酶（MPO）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活力。结果显示,PEPE对RAW264.7细胞的安全浓度范围为25~400 μg/mL。PCV2感染RAW264.7细胞后,细胞活性显著降低（P<0.05）,而不同浓度PEPE处理组均能提高细胞活性。RAW264.7细胞被PCV2感染后,细胞分泌NO、ROS水平,GSSG含量及XOD、MPO和iNOS活性显著升高（P<0.05）,感染细胞GSH含量显著降低（P<0.05）;PEPE作用于PCV2感染的RAW264.7细胞,显著降低感染细胞NO、ROS水平、GSSG含量及XOD、MPO和iNOS活性（P<0.05）,100 μg/mL PEPE处理组细胞GSH水平显著升高（P<0.05）。本试验结果表明,PEPE能提高PCV2感染RAW264.7细胞的抗氧化能力,有利于缓解病毒感染所致氧化应激。     

辣蓼黄酮乙酸乙酯部分对PRV体外诱导RAW264.7细胞分泌炎性因子的影响

探讨辣蓼黄酮乙酸乙酯部分（ethyl acetate of flavonoids from Polygonum hydropiper L.,FEA）对猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）体外诱导RAW264.7细胞分泌炎性因子的影响。正式试验前将不同浓度的FEA作用于RAW264.7细胞,通过CCK-8检测细胞体外增殖活性,筛选FEA对RAW264.7细胞的安全浓度范围。正式试验分为空白对照组、PRV阳性对照组、芦丁对照组、5个FEA药物组,除空白对照组外,其余各组细胞加入PRV共孵育1.5 h后,再加入芦丁或不同浓度的FEA,分别培养4、8、12、24 h,CCK-8法检测FEA对病毒感染的RAW264.7细胞活性,筛选出3个FEA药物组（高、中、低剂量FEA）,再通过ELISA法检测各时间点细胞培养液上清中炎症相关因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、MCP-1和IFN-γ的分泌水平,以确定FEA体外调节炎症反应的最适时间及药物浓度。结果显示：①FEA对RAW264.7细胞的安全浓度为12.5~200 μg/mL;②25~100 μg/mL FEA能显著提高PRV感染的RAW264.7细胞体外增殖活性;③PRV感染RAW264.7细胞后促进细胞炎症因子的分泌,用FEA处理8~12 h后,在一定程度上降低了TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1的分泌水平（P<0.05）,升高了IFN-γ分泌水平（P<0.05）,调节了IL-10分泌水平,且FEA处理8 h抗炎效果最好。结果表明,FEA能调节病毒感染细胞分泌炎性因子的水平,提示其具有体外抗炎作用。该结果可为进一步研究FEA抗病毒分子机制提供参考依据。     

BCG诱导RAW264.7细胞脂肪酸氧化对细胞自噬和促炎因子表达的调控作用

旨在探究脂肪酸氧化（fatty acid oxidation,FAO）对BCG介导的RAW264.7细胞自噬和促炎因子表达的调控作用。用BODIPY染色和游离脂肪酸定量试剂盒检测BCG感染后RAW264.7细胞中脂滴聚集情况以及脂肪酸含量;Western blot检测BCG感染对肉毒碱棕榈酰基转移酶1A （CPT-1A）表达的影响;Etomoxir （100 μmol·L^-1）预处理细胞2 h后,BCG感染细胞6 h,检测RAW264.7细胞中BCG存留量,并用Western blot方法检测自噬相关蛋白（Beclin1、LC3-II）和溶酶体蛋白（Rab7）的表达情况;用免疫荧光方法和mRFP-GFP-LC3荧光双标腺病毒分别检测自噬小体聚集和自噬流;荧光定量PCR和ELISA分别检测促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达情况以及在细胞培养上清中的含量。结果显示,BCG感染促进RAW264.7细胞中脂滴聚集和CPT-1A的表达,而游离脂肪酸含量降低;Etomoxir预处理抑制了细胞中BCG存活,并上调了Beclin1、LC3-II和Rab7表达,且细胞中出现大量自噬小体聚集,自噬流增强,却抑制了促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达与分泌。综上表明,抑制FAO可促进BCG感染诱导的RAW264.7细胞自噬,并抑制BCG感染引起的炎症反应。     

硫酸化党参多糖对H2O2致RAW264.7细胞损伤和小鼠急性酒精损伤的保护作用

本试验旨在比较党参多糖(CP)与硫酸化党参多糖(SCP)对H₂O₂诱导RAW264.7细胞急性损伤及小鼠急性酒精损伤的保护作用。采用H₂O₂诱导RAW264.7细胞急性损伤,检测不同浓度CP与SCP对RAW264.7细胞生长、吞噬功能及IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ水平的影响。随后体内建立小鼠急性酒精损伤模型,将90只4周龄雄性昆明小鼠随机均分为9组：正常对照组(B)、模型对照组(MO)、维生素C对照组(VC)、3个剂量的CP(CPL、CPM、CPH)与SCP(SCPL、SCPM、SCPH)组。检测各组对急性酒精损伤小鼠生长情况、血液生理指标、脏器指数、血清IL-2、IL-4、IL-10及IFN-γ水平的影响。结果显示,H₂O₂诱导RAW264.7细胞急性损伤后,与MO组相比,CP和SCP组细胞贴壁数量增加,细胞密度增大,37 ℃作用30、60、90 min后均能显著提高细胞吞噬能力(P < 0.05),且SCP各组促进细胞增殖及吞噬作用优于CP各组。CP和SCP均能显著促进细胞分泌IL-2、IFN-γ(P < 0.05),抑制IL-4的分泌(P < 0.05),SCP各组对IL-4的抑制作用优于CP,其中SCPL组对IL-4的抑制效果最佳。小鼠急性酒精损伤模型中,与MO组相比,CP和SCP能显著改善小鼠血液生理指标(P < 0.05),使血液中WBC和HGB恢复至正常水平,其中SCPL组效果最佳。CP和SCP还能改善小鼠血生化指标,显著提高血清中TC、LDH含量(P < 0.05),降低TG含量(P < 0.05)。CP和SCP组较MO组小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平显著升高(P < 0.05),IL-4水平显著降低(P < 0.05),其中SCP各组对IL-4的抑制作用最佳。综上所述,SCP可显著提高H₂O₂诱导RAW264.7细胞急性损伤后细胞吞噬能力,促进细胞分泌IL-2、IFN-γ水平,抑制IL-4分泌;改善酒精诱导的急性损伤小鼠的血液生理指标、血清生化指标和免疫因子,具有一定的保护作用,且SCP在一定条件下效果优于CP。     

TLRs介导的信号通路在马链球菌感染RAW264.7细胞中的作用

为探究Toll样受体(TLRs)介导的信号通路在马链球菌马亚种(S.equi)感染小鼠巨噬细胞RAW264.7中的作用,收集S.equi感染后不同时间点的RAW264.7细胞,提取总RNA并反转录成cDNA,利用实时荧光定量PCR技术检测细胞Toll样受体1、2、6(TLR1、TLR2、TLR6)、接头蛋白骨髓分化蛋白88(MyD88)及细胞因子IL-1、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-αmRNA的表达情况。结果显示,S.equi感染RAW264.7细胞后6h时,TLR1、TLR2、TLR6与MyD88mRNA水平均较对照组没有显著差异(P>0.05);感染后12h时,TLR1、TLR2和TLR6mRNA表达量未出现明显上升(P>0.05),而MyD88mRNA水平极显著升高(P<0.01);感染后24h时,TLR1、TLR2和TLR6mRNA表达水平出现极显著升高(P<0.01),MyD88mRNA表达没有显著变化(P>0.05),且IL-10和IL-12mRNA水平与对照组相比极显著升高(P<0.01),IL-1、IL-6和TNF-αmRNA水平均极显著下降(P<0.01)。结果表明,TLRs介导的信号通路参与S.equi感染RAW264.7细胞的免疫应答反应。     

牛磺鹅去氧胆酸对小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞凋亡的影响

为了探讨牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）对小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7的抗凋亡作用,试验采用二苯胺法及实时荧光定量PCR技术分别检测了针对RAW264.7细胞凋亡百分率及凋亡抑制蛋白CIAP-1、CIAP-2和XIAP的mRNA表达影响。结果显示,剂量为0.05、0.10和10 μg/mL TCDCA可以极显著地对抗地塞米松（DEX）诱导的RAW264.7细胞系凋亡（P < 0.01）。1 μg/mL TCDCA对正常RAW264.7细胞系CIAP-1和XIAP表达有显著的促进作用（P < 0.05）;10 μg/mL TCDCA对正常RAW264.7细胞系CIAP-1、CIAP-2和 XIAP表达均具有显著的促进作用（P < 0.05）。TCDCA给药后对DEX诱导的RAW264.7细胞系CIAP-1、CIAP-2和 XIAP表达均具有极显著的促进作用（P < 0.01）,但不同给药剂量的TCDCA作用有所差异。以上研究结果表明,TCDCA具有对抗DEX诱导的小鼠巨噬细胞系RAW264.7凋亡作用,且与上调凋亡抑制蛋白mRNA表达有关。     

辣蓼黄酮对脂多糖诱导下RAW264.7细胞活性氧及炎性因子分泌的影响

采用酶解-超声偶联法提取辣蓼全草中的总黄酮,并经过萃取分离结合大孔树脂纯化富集获得辣蓼乙酸乙酯部分黄酮(FEA)与辣蓼正丁醇部分黄酮(FNB),并通过MTT法测定药物安全浓度。采用不同剂量的FEA与FNB作用于脂多糖(LPS)刺激所诱导的RAW264.7细胞炎症体外模型,测定细胞内活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)及炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10水平。结果表明,FEA与FNB能明显减少LPS诱导的ROS释放量;不同浓度的FEA与FNB可以抑制LPS诱导的RAW264.7细胞分泌NO水平的升高。FEA与FNB均能减少LPS刺激所诱导的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8释放,FEA能促进抗炎因子IL-10的生成。说明一定浓度的FEA和FNB具有显著的抗炎效果,且其抗炎作用的产生可能与抗氧化途径有关。     

RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因真核表达载体构建及生物信息学分析

为深入研究Ras同源基因家族成员A（Ras homolog gene family,member A,Rhoa）和环氧合酶2（cyclooxygenase 2,Ptgs2）分子在布鲁菌逃逸机体免疫中发挥的作用,试验对RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因进行扩增与克隆,构建真核表达载体并预测生物信息学功能。根据GenBank数据库中公布的RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因CDS区序列（登录号：JN971019.1和NM_011198）设计引物,提取RAW264.7细胞总RNA并反转录为cDNA,经RT-PCR扩增Rhoa和Ptgs2片段并测序,将纯化的Rhoa和Ptgs2片段分别与线性化pcDNA3.1质粒相连接,对重组质粒进行测序分析和双酶切鉴定后,利用Lipofectamine^TM 2000转染293T细胞,经实时荧光定量PCR和Western blotting验证Rhoa和Ptgs2基因的表达情况,并应用生物信息学软件对Rhoa和Ptgs2基因进行预测分析。结果显示,试验成功构建了RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因的真核表达质粒;实时荧光定量PCR检测均在转录水平上表达;Western blotting可见Ptgs2蛋白在70 ku处有一明显条带,而Rhoa蛋白未出现条带。生物信息学预测显示,Rhoa和Ptgs2基因核苷酸序列相似性较高,在不同物种之间较为保守;Rhoa不具有信号肽,为不稳定蛋白,而Ptgs2在第17-18位氨基酸处存在信号肽,为稳定蛋白;Rhoa和Ptgs2蛋白分别有12和53个潜在的磷酸化位点;二级结构、三级结构均以无规则卷曲为主。本研究成功构建了RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因的真核表达载体,均在转录水平上表达,并分析了其生物学功能,为后续开展RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因在布鲁菌免疫机制方面的研究提供了工具。