核酸适配体比色法检测恩诺沙星

(目的)研究检测恩诺沙星的胶体金核酸适配体比色法,(方法)将恩诺沙星核酸适配体与胶体金结合后形成胶体金适配体复合物,然后加入恩诺沙星靶标分子,由于核酸适配体与靶标的高效特异性结合,核酸适配体与胶体金解离.最后加入NaCl后,胶体金由红变兰.(结果)胶体金比色检测体系中,NaCl的最佳浓度为1M,核酸适配体的最佳浓度为2μM.对恩诺沙星的比色检测限为15ng/mL.(结论)基于胶体金和核酸适配体的比色法可用于恩诺沙星的快速筛选.     

奶牛结合珠蛋白核酸适配体的筛选及鉴定

核酸适配体作为一种优于单克隆抗体的新型识别分子,具有更高的分辨率,能识别配体间一个基团的细微差别,且所需的结合活性位点更小。本研究利用指数级富集配体进化技术(SELEX)筛选特异性结合于奶牛结合珠蛋白(HP)的DNA适配体,并对筛取的适配体进行特性分析。体外构建全长80bp中间含40bp随机序列的单链DNA(ssDNA)文库,通过对循环次数、退火温度及引物比例的优化,建立了适合的筛选体系;以超滤离心管为介质,HP蛋白为靶标,对随机ssDNA文库进行反复的SELEX筛选,从单链DNA文库中筛选能特异性结合HP蛋白的核酸适配体;利用DNAMAN和RNAstructure软件对获得核酸适配体进行一级结构和二级结构分析。结果表明,经过体外8轮筛选,随机ssDNA文库与HP蛋白的结合率由1.86%上升到31.35%,特异性核酸达到最大富集;经克隆和测序,获得了能与HP蛋白特异性结合的5个家族的DNA适配体,同源性均达70%以上,RNAstructure分析其二级结构主要以茎环结构为主,表明ssDNA形成不同的茎环结构可能是适配体与HP蛋白特异性作用的结构基础。初步建立HP蛋白核酸适配体库,筛选到与HP蛋白特异性结合的核酸适配体,为制备以HP为检测靶标的奶牛隐性乳腺炎检测试剂盒奠定基础。     

胶体金核酸适配体比色法检测氨苄西林钠的研究

为了研究检测氨苄西林钠的胶体金核酸适配体比色法,试验采用纳米金为载体,将核酸适配体与其结合后形成胶体金适配体复合物,然后加入靶标分子,由于核酸适配体与靶标的高效特异性结合,核酸适配体与胶体金解离,加入Na Cl后胶体金由红色变为蓝色。结果表明:胶体金比色检测体系中,Na Cl的最佳浓度为1 mol/L,核酸适配体的最佳浓度为2μmol/L。对氨苄西林钠的比色检测限为3.12 ng/mL。说明基于胶体金和核酸适配体的比色法灵敏度较高,可用于氨苄西林钠的快速筛选。     

适配体药物的研究现状及其在传染病防制领域的应用前景

指数富集的配体进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)是通过设计并合成一个含大量随机寡核苷酸文库,从中筛选出与靶分子特异结合的寡核苷酸,并结合体外PCR扩增技术,使其得到指数级富集,经多个循环分离得到亲和力和特异性最高的寡核苷酸结合序列.筛选出的寡核苷酸片段被称为适配体(Aptamer).适配体的概念最早是由Tuerk提出来的,适配子与其靶本子结合过程类似抗原抗体反应,凡是涉及抗体的领域几乎都可用适配体代替[1].近年来,随着SELEX相关技术的不断发展,适配体作为治疗药物已被广泛应用于生物医学的很多领域[2],如心血管疾病治疗、肿瘤的显像和治疗、靶向药物的输送和释放、艾滋病治疗等,本文就适配体治疗药物的特点、研究现状及其在传染病的防治领域的应用前景作一综述.     

猫细小病毒适配体的筛选与鉴定

为筛选猫细小病毒(FPV)特异性核酸适配体,本研究利用体外指数富集的配体系统进化技术(SELEX),从80 nt的单链DNA随机文库中筛选出与FPV高亲和力、高特异性结合的核酸适配体。对FPV适配体共进行14轮筛选,采用dot blot鉴定,确定其中的Apt27和Apt52为候选适配体。MTT试验表明,Apt27和Apt52对CRFK细胞(猫肾细胞)无毒性作用。利用酶联寡核苷酸法(ELONA)测定Apt27和Apt52的解离常数,结果显示分别为18.3249±7.1723 nmol/L和24.7882±10.0067 nmol/L。同时采用dot blot、间接免疫荧光试验(IFA)方法检测Apt27和Apt52对不同病毒的结合情况,结果显示其对猫杯状病毒、猫疱疹病毒的结合力弱,而对FPV的结合能力较强。预测二者二级结构可见,Apt27和Apt52均具有环状、发卡状结构,其中茎环结构可能为适配体特异性识别FPV的基本结构。本研究首次筛选到特异性识别FPV的适配体序列,为FPV的检测与治疗制剂的开发提供了新思路。     

兔出血症病毒特异性核酸适配体的筛选

为筛选出兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)衣壳蛋白VP60特异性核酸适配体,建立新型的兔出血症(rabbit hemorrhagic disease,RHD)检测方法,本研究构建了一个长80 nt的随机寡核苷酸文库。以固定在PVDF膜上的VP60为靶分子,使用消减SELEX技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)进行20轮的筛选,以生物素标记的次级文库作为"一抗",以辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素作为"二抗",对文库进行Western blot鉴定,结果表明第20轮文库存在可特异性的识别VP60的核酸序列。随机选取第20轮文库的46条序列克隆、测序,得到20个高度同源序列,同时对46个适配体再次鉴定,最终得到3个特异性识别VP60的适配体。     

基于氧化石墨烯-SELEX技术对氟苯尼考核酸适配体的筛选及其结构分析

氟苯尼考(FFC)具有胚胎毒性,在食用动物组织中残留会严重危害消费者的健康与安全。为建立快速检测动物性食品中FFC残留的方法奠定基础,本研究根据引物设计原则,设计了上下游引物,根据引物序列构建长度为80 bp的随机单链寡核苷酸(ssDNA)文库,其3'端和5'端为固定的20 bp引物结合位点,中间为40 bp的随机序列。通过氧化石墨烯-富集配体系统进化技术(GO-SELEX)筛选,即将经过预处理的ssDNA文库与等摩尔量的FFC及氧化石墨烯(GO)沉淀共孵育。通过GO的π-π共轭键吸附未结合靶标FFC的ssDNA,已结合靶标的ssDNA(FFC-ssDNA)则留在上清液中,通过离心获得FFC-ssDNA复合物。将每一轮筛选的FFC-ssDNA复合物经离心、抽提、醇沉淀回收所得到的ssDNA做为模板进行PCR扩增,通过链霉亲和素将PCR产物的双链DNA(dsDNA)彻底裂解为单链,作为次级ssDNA文库进入下一轮筛选。每一轮的筛选均计算一次回收率,当回收率变化趋于稳定时,引入反筛选物氯霉素(CAP)、甲砜霉素(TAP),以去除与FFC特异性结合较差的ssDNA。当回收率达到饱和,筛选停止。最终,根据回收率的计算结果共进行了12轮核酸适配体的筛选,其中有10轮为正筛选,第7轮和第11轮为反筛选。PCR结果显示,经12轮筛选均得到了所需要的目的 ssDNA片段。对第9轮和第12轮的筛选产物克隆并测序,共得到46条不同的核酸适配体序列。经对46条核苷酸序列的二级结构、自由能(△G)预测和亲缘性分析,最终得到A1、A26、A27、A31、B18、B28、B30、B37共8条候选核酸适配体。通过测定8条候选适配体的解离常数(Kd值)分析其与FFC的亲和性。结果显示,8条候选适配体的Kd值在11.811 nmol/L～54.097 nmol/L;利用相同浓度的FFC、CAP、TAP对其中亲和性较高的A26和B18进行特异性试验,结果表明两条核酸适配体均可以与FFC特异性结合,且B18与FFC的特异性结合作用更强,可作为FFC的特异性核酸适配体。本研究首次对FFC的核酸适配体进行SELEX筛选,为建立快速检测动物性食品中FFC残留方法奠定基础。     

液相适配体芯片在食源性致病菌检测中的应用

食源性致病菌是引起食物中毒的重要因素,对食源性致病菌的快速和高通量检测是防止和诊断细菌性食物中毒的有效手段。液相芯片检测技术具有需样本量少、高通量等特点。经典液相芯片技术是以有机荧光染料编码的聚苯乙烯微球为载体,新型液相芯片技术是以物理学、光学等编码的基质为载体,通过制备不同配体功能化的载体,实现对同一液相环境中多种靶细菌的同时检测。适配体是一类相比蛋白类抗体特异性高、筛选获得快、化学稳定性强的核酸配体。论文针对核酸适配体分析鉴及以适配体为基础的新型液相芯片技术在食源性致病菌检测中的应用进行了综述。     

鲤春病毒血症病毒核酸适配体的筛选及分析

核酸适配体(Aptamer)是一类单链短DNA或RNA片段,具有一定的空间结构,对特定靶分子具有亲和力。本研究采用指数富集配体系统进化技术(SELEX),首次筛选出针对鲤春病毒血症病毒(SVCV)的核酸适配体A2和A15,经过荧光PCR、凝胶阻滞和病毒中和实验,证明了其对SVCV具有结合力和抑制作用,在该病的检测和防治方面具有良好的前景。     

核酸适配体比色法在抗生素残留快速检测中的应用

传统的抗生素残留快速检测方法主要是以抗体为核心试剂的免疫学方法,免疫学检测方法灵敏度好、操作简单快速.但是,抗体的获得需要多次免疫动物或(和)细胞培养,制备周期一般比较长,实验成本相对也较高.另外,抗体长期储存可能会影响效价.核酸适配体是从随机序列中筛选出来的一段单链寡聚核酸,适配体与靶分子之间的分子识别与抗体极为相似,但适配体比抗体具有更高的特异性,在常温下较稳定,不像抗体那样随着温度的变化容易降解.本文对基于核酸适配体的胶体金比色法在抗生素残留快速检测中的应用做一介绍.