柔嫩艾美耳球虫Sir2基因的注释、克隆与原核表达

沉默信息调节因子2(Sir2)在染色质沉默、基因调控、代谢调节和调节细胞寿命等一系列细胞生物活动过程中起重要作用,近年来被作为抗病原微生物药物靶标成为了研究的热点.本研究应用生物信息学和比较基因组学技术注释获得了柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)Sir2的基因序列,以注释的基因序列设计引物,以E.tenella第2代裂殖子cDNA文库为模板,利用PCR扩增获得了EtSir2ORF基因序列;并构建pET43a-EtSir2重组表达载体,进行原核表达.结果显示,EtSir2ORF全长为909 bp,编码一段全长为302个氨基酸的多肽片段,该融合蛋白分子质量约为99 ku,与预期分子质量一致.     

柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白EtRON2基因的克隆及序列分析

预测并克隆柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2 (EtRON2)基因,分析其结构特点及与顶复门其他虫属间的差异.本研究利用生物信息学和比较基因组学技术注释拼接得到柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)棒状体颈部蛋白2(EtRON2)的基因序列,用RT-PCR方法扩增出Etron2全长ORF；以E.tenella 子...     

不同免疫策略对鸡球虫病的免疫效果

球虫病(Coccidiosis)是由艾美耳属(Eimeria)的单细胞寄生原虫引起的严重危害养禽业发展的重要疾病之一,遍及世界各地,其中柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)是最常见的病原.据报道(1992),全世界每年由鸡球虫病造成的经济损失高达20亿美元.但药物防治和球虫活苗的使用又存在诸多问题,迫使人们寻找新的免疫预防方法.本研究应用DNA重组技术克隆了λMzp5-7基因,同时构建原核和真核表达载体并表达,利用原核表达的融合蛋白和真核重组质粒免疫动物,观察不同的免疫策略诱导的免疫反应,为球虫病的防治研究奠定基础.     

柔嫩艾美耳球虫Cytbc1基因的克隆、序列分析及重组表达

为研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)细胞色素bc 1复合物(cytochrome bc1,Cytbc1)的生化特性,本研究对其基因进行了克隆和原核表达。根据EupathDB已公布的E.tenella Houghton株Cytbc1基因序列(Contig ID:ETH 00007855)设计特异性引物,运用RT-PCR方法扩增EtCytbc1基因序列,并将其克隆到表达载体pCold43a中,构建重组质粒pCold43a-EtCytbc1,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞E.coli Rosetta(DE3),并进行IPTG诱导表达。结果表明,EtCytbc1的ORF序列(687bp),编码228个氨基酸;重组菌pCold43a-EtCytbc1能成功诱导表达,pCold43a表达部分可溶性蛋白,表达产物纯化后可用于酶生化特性分析。柔嫩艾美耳球虫Cytbc1基因的成功克隆表达为该酶的功能研究奠定了基础。     

鸡柔嫩艾美耳球虫3-1E真核重组表达质粒的构建及其免疫保护性分析

为构建鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)重组真核表达质粒并检测其免疫保护性,本实验将E.tenella表面抗原基因3-1E(E)与鸡IFN-γ、IL-2基因分别串联在真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核重组表达质粒pcDNA-E-IFNγ、pcDNA-E-IL2,同时构建对照质粒pcDNA-E、pcDNA-IFNγ、pcDNA-IL2.经酶切鉴定得到预期大小目的片段,测序结果与预期序列一致.将构建的重组质粒免疫鸡只,经western blot检测表明该重组质粒在鸡体内可以正常表达;对感染鸡只的免疫保护效果显示,pcDNA-E-IFNγ、pcDNA-E-IL2组抗球虫指数(ACI)分别为181.04、187.30,具有高效的抗球虫效果,为将其进一步研制成为具有实用价值的抗球虫疫苗奠定了基础.     

柔嫩艾美耳球虫G6-PI基因的克隆、序列分析与原核表达

为研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase,G6-PI)的生化特性,本研究对其基因进行了克隆和原核表达。根据NCBI已公布的E.tenella Houghton株G6-PI的基因序列(GI:298161921)设计特异性引物,运用RT-PCR方法扩增EtG6-PI基因序列,并将其克隆到表达载体pColdI、pCold43a中,构建重组质粒pColdIEtG6-PI、pCold43a-EtG6-PI,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞E.coli Rosetta(DE3),并进行IPTG诱导表达。结果表明,E.tenella G6-PI的ORF序列(1650 bp),编码550个氨基酸;重组菌pColdI-EtG6-PI、pCold43a-EtG6-PI均能成功诱导表达,其中pCold43a-EtG6-PI表达部分可溶性蛋白,表达产物纯化后可用于酶生化特性分析。柔嫩艾美耳球虫G6-PI基因的成功克隆表达为该酶的功能研究奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫SO7-IL-2重组酵母蛋白的表达及其免疫效果评价

为了研究鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella) SO7重组酵母蛋白的表达及其免疫保护效果,试验用E.tenella的保护性抗原基因SO7与鸡IL-2基因串联在毕赤酵母表达载体pPICZαA中进行表达,用Western-blot检测表达是否成功。分别以重组酵母全菌体破碎蛋白和诱导表达纯化的重组酵母蛋白免疫鸡只,并以1×10~4个/只柔嫩艾美耳球虫卵囊进行攻虫,观察免疫保护效果。结果表明:诱导后的重组酵母全菌蛋白pPICZαA-SO7-IL2成功表达;两种蛋白抗球虫指数(ACI)分别为175.48,174.35,说明pPICZαA-SO7-IL2对感染鸡只具有较高的抗球虫效果。     

柔嫩艾美耳球虫杨凌株3-1E基因的克隆、表达与蛋白结构预测

应用PCR技术,从柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)孢子化卵囊子孢子cDNA表达文库中扩增得到鸡E.tenella杨凌株(YL)子孢子表面抗原3-1E基因。序列分析表明,E.tenella YL 3-1E基因的开放阅读框(ORF)为513个碱基,编码170个氨基酸,与报道的E.tenella甘肃株(GS)3-1E基因相似性为99.8%,两者推导的氨基酸序列相似性为99.4%;而与文献报道的堆型艾美耳球虫(E.acervulina)美国株(US)3-1E基因序列的相似性为98.8%,推导的氨基酸序列相似性为98.8%。利用生物信息学和分子生物学软件对3-1E基因编码的蛋白进行结构预测,结果表明,该蛋白为结构松散的球状蛋白。将3-1E基因亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,构建pGEX-3-1E重组质粒并在大肠杆菌BL21中进行表达,表达产物经SDS-PAGE分析,表明成功地表达出了分子量为44.7 ku的融合蛋白。该研究为球虫基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫Serpin基因真核表达载体的构建及其瞬时表达

为了解柔嫩艾美耳球虫(E.tenella) Serpin基因的生物学特性,本研究采用PCR技术扩增去除信号肽后的Serpin基因,得到1 204 bp的特异性片段,并构建重组表达质粒pVAX1-Serpin,将其瞬时转染HeLa细胞.间接免疫荧光检测表明Serpin基因在HeLa细胞中得到了表达,western blot显示表达蛋白分子量约为47 ku,具有较好的反应原性.该研究结果为E.tenella Serpin核酸疫苗的研究奠定了基础.     

柔嫩艾美耳球虫MAGL基因的克隆及表达

酰基甘油酯酶(MAGL)是将酰基甘油分解为甘油和游离脂肪酸的丝氨酸水解酶家族成员之一,在酯代谢中起着关键酶的作用,是研制抗鸡球虫药物的重要靶标。本研究利用生物信息学技术预测拼接了柔嫩艾美耳球虫MAGL基因序列,以第二代裂殖子总RNA为模板,通过RTPCR技术获得Etmagl基因。将Etmagl与pCold-43a载体连接,构建pCold-43a-Etmagl重组载体,并在大肠杆菌BL21中获得可溶性蛋白,经亲和层析获得纯化的重组蛋白。结果显示,扩增的Etmagl序列ORF长1 752 bp,编码584个氨基酸,与预测序列相似度为99%,与弓形虫MAGL相似度好(55%);IPTG诱导后融合蛋白高效表达,大小约为114 ku,经免疫印迹鉴定为目的蛋白。本研究成功利用大肠埃希菌原核表达体系重组表达并纯化了柔嫩艾美耳球虫酰基甘油脂肪酶,为建立以MAGL为靶标的抗球虫药物筛选模型奠定了基础。