中华鳖爱德华菌病病原菌的分离鉴定及致病因子研究

采用API 20E系列生化鉴定及16S rDNA和gyrB基因序列同源性分析方法,对从患病中华鳖(Trionyx sinen-sis)肝脏中分离到的一株细菌TL5m进行了鉴定,并通过人工感染试验,对该菌株进行了毒力检测;此外分别提取该TL5m株的主要致病因子外膜蛋白、脂多糖和胞外产物,对中华鳖进行毒力和免疫保护率试验。结果显示:菌株TL5m的API 20E鉴定编码为4544000,99.9%为迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda);其16SrDNA序列和gyrB基因序列(GenBank登录号分别:EF121756和GU563803)与迟钝爱德华氏菌的同源性最高(分别为94%和98%);菌株TL5m对中华鳖的半数致死量LD50为2.45×106 CFU/ind。药敏感结果显示菌株对磷霉素、菌必治、头孢孟多、头孢噻吩、壮观霉素高度敏感。外膜蛋白攻毒剂量60μg/ind和脂多糖攻毒剂量400μg/ind时,对中华鳖的致死率都为33.3%,胞外产物对中华鳖的LD50为31.73μg/ind;全菌灭活苗、胞外产物、外膜蛋白和脂多糖的免疫保护率分别为75%、62.5%、25%和87.5%。结果表明,发病中华鳖的病原菌为迟钝爱德华氏菌,其分泌的胞外产物对中华鳖具有较高毒力;提取的脂多糖对中华鳖遭受迟钝爱德华氏菌攻击具有较高免疫保护率。     

蟹源拟态弧菌胞外产物的细胞毒性和致病性初步研究

本试验对蟹源拟态弧菌(Vibrio mimicus)HX-4菌株胞外产物(extracellular productions，ECP)的细胞毒性和致病性进行了系统研究。采用微量板法检测胞外产物的细胞毒性，结果表明该菌胞外产物对HEp-2细胞具有较强的细胞毒性，病变细胞变圆，脱落；除100℃处理外，经56℃和胰酶处理后，胞外产物仍具有细胞毒性。通过动物实验测定了胞外产物的致病性，结果显示胞外产物对小鼠与中华绒螯蟹均有致死性．致死率均为100％。     

中华绒螯蟹的致病菌及抗菌药物的筛选

对河蟹育苗场各期蚤状幼体(Z1～Z5)、大眼幼体至Ⅴ期幼蟹进行了病原菌的分离采样。采用"细菌生化鉴定编码"对育苗期的中华绒螯蟹的致病菌进行鉴定,主要为溶藻弧菌(V.alginolyticus)、霍乱弧菌(V.cholerae)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、豚鼠气单胞菌(A.caviae)和梅氏弧菌(V.metschnikovii)。采用扩散法(K-B法)对上述菌株进行了药物敏感性试验,结果表明:上述各菌株对庆大霉素、氟哌酸、头孢哌酮、丙氟哌酸、氟嗪酸、复方新诺明、环丙沙星具有较高的敏感性,抑菌直径>16mm。同时选择氟哌酸和环丙沙星对荧光假单胞菌、溶藻弧菌进行了最小抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MBC)的测定。氟哌酸对荧光假单胞菌和溶藻弧菌的MIC分别为25μg/mL和0.78μg/mL;环丙沙星对荧光假单胞菌和溶藻弧菌的MIC分别为6.25μg/mL和0.025μg/mL。氟哌酸对荧光假单胞菌和溶藻弧菌的MBC均为6.25μg/mL;环丙沙星对荧光假单胞菌和溶藻弧菌的MBC分别为50μg/mL和0.1μg/mL。     

腐败假单胞菌人工感染河蟹的毒性试验及药物敏感性实验

介绍了从不同的养殖区内,采集河蟹病蟹样品。在濒死的蟹体内分离检出的菌株,经系统生化鉴定有１２株菌,被鉴定为假单胞菌属;腐败假单胞菌。为研究证明腐败假单胞菌对河蟹的致病性及其毒力的强度,用人工注射的方法进行试验观察。     

杂交鲍稚鲍"漫爬病"潜在病原菌胞外产物的分析及种类鉴定

从发病的杂交鲍(皱纹盘鲍×盘鲍)稚鲍中共分离27株菌株,并对其分泌胞外产物(包括酪蛋白酶、明胶酶、淀粉酶、脂肪酶、磷脂酶和溶血素)的能力进行了分析。试验结果表明,具有分泌胞外蛋白酶、明胶酶、淀粉酶、脂肪酶、磷脂酶和溶血素能力的菌株分别占总菌株数的81.5%(22/27)、74.1%(20/27)、18.5%(5/27)、0%(0/27)、11.1%(3/27)、29.6%(8/27)。其中,1#、14#菌株具有很强的产胞外蛋白酶能力,而明胶酶的最大分泌者为2#、7#、9#、17#菌株,淀粉酶的为11#、14#菌株,磷脂酶的为11#、15#菌株,溶血素的为菌株10#、21#。此外,10#、11#、15#菌株可同时分泌4种胞外产物,而12#、14#、18#、21#、23#、24#菌株可同时分泌3种胞外产物。综合考虑每一种胞外酶的潜在致病作用,以及菌株分泌多种胞外酶的能力,初步确认11株菌为潜在的致病菌:1#、2#、7#、9#、10#、11#、12#、14#、15#、17#、21#。用API条带法对它们进行了种类鉴定,11株菌中巴斯德氏菌和假单胞菌所占的比例分别为45.5%、27.3%。     

鱼源维氏气单胞菌的分离鉴定和药敏研究

正维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)隶属于弧菌科、气单胞菌属,具有高致死率,广泛存在于自然界水域、土壤和水生动物体中,是一种新型的人—畜—鱼共患病病原菌。该菌可引起鲤、鲫、鳗鲡、罗非鱼、鲟鱼和河蟹等多种水生动物发病,患病鱼多表现为出血和腹水;也有狐狸带菌的报道,还可感染人,引起腹泻、脑膜炎和败血症等。近几年,维氏气单胞菌在我国呈现零星散发,尚未出现大范围流行。由于维氏气单胞菌对人和多种水产动物具有较强感染性和致病力,故该菌对水产养殖业和人类健康具有一定危害性,需要警惕其     

罗非鱼冷藏过程细菌种群的变化

对养殖尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)0～10℃贮藏过程中感官、化学、微生物品质和细菌种群消长研究表明,初始样品挥发性盐基氮为(8.08±0.29)mg/(100g),菌落总数(CFU/g)的对数值为4.79±0.60;细菌种群复杂,种类繁多,分离到570株菌,其中80.5%为革兰氏阴性菌,13.6%为革兰氏阳性菌,优势菌是假单胞菌(Pseudomonas spp.)(36.5%)、肠杆菌科细菌(Enterobacteriaceae)(14.2%)和气单胞菌(Aeromonas spp.)(15.3%),同时检出了一定比例的不动杆菌和其他细菌。冷藏过程中肠杆菌科细菌、气单胞菌等生长受到抑制,细菌菌相组成逐渐变得单一,适应低温环境下革兰氏阴性菌比例不断增加,0℃、5℃、10℃贮藏至货架期终点时,阴性菌的比例分别达到86.4%、88.9%、100.0%;假单胞菌增殖显著,比例分别达到80.7%、68.1%、60.0%,可确认其为0～10℃贮藏罗非鱼的优势腐败菌。假单胞菌的种类变化趋势显示,优势顺序分别为荧光假单胞菌(P.uorescens)、恶臭假单胞菌(P.putida)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、产碱假单胞菌(P.alcaligenes),0℃、5℃、10℃贮藏至货架期终点时,假单胞菌中荧光假单胞菌分别占52.1%、53.1%、59.3%,可确认其为最优势种群。     

福州地区大黄鱼变形假单胞菌的分离与鉴定

为研究2013年春夏之际罗源湾海区网箱养殖大黄鱼(Pseudosciaena crocea)内脏出现白点症状的病原,从具有临床症状的大黄鱼内脏中分离到优势菌,经回接感染试验证实该菌为病原菌;分析该病原菌的形态特征、理化特性、分类地位及药物敏感性等特性,结合16S r DNA序列构建的进化树与假单胞菌属恶臭群中的变形假单胞菌同源性最高,在99%以上,并通过看家基因gyr B序列分析进一步验证该菌为变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida);该菌对强力霉素、诺氟沙星、恩诺沙星3种抗生素敏感,对奥氟沙星、左氟沙星、四环素3种抗生素中度敏感。     

广东汕尾患病黑稚鲍微生物胞外产物的分析

从广东汕尾一鲍鱼养殖厂的患病黑稚鲍中分离筛选到56株菌,并对之进行致病毒力因子(胞外酶及溶血作用)的分析.结果表明,在56株菌中有16株具有较强的分泌胞外蛋白酶、明胶酶、磷脂酶、脂肪酶和淀粉酶的能力,占总菌株数的28.6%;而有溶血现象的仅有6株,占总菌株数的10.7%,且溶血能力不强.其中,8株具有很强的产胞外蛋白酶的能力,3株具有很强的产胞外明胶酶的能力,21株具有产胞外磷脂酶的能力,5株具有产溶血素的能力.此外,同时可分泌4种以上胞外产物的菌株为22株,占39.3%;同时分泌6种胞外产物的菌株为3株.综合考虑每种胞外产物的潜在致病作用以及菌株分泌多种胞外产物的能力,初步确认16株菌为潜在的致病菌.     

固定化浓缩光合细菌对河蟹的促生长影响

根据昆山巴城地区以河蟹为主要养殖品种的特点,我们应用固定化浓缩光合细菌(PSB)对其进行了促生长试验。试验使用的菌种主要由红假单胞菌属的球形红假单胞菌和荚膜红假单胞菌组成,培养方法参照Weaver等(l975)的方法,扩大培养至菌体密度达5×l09个/毫升时收获,6000转/分离心,弃去上层清液,收获PSB浓缩菌体密度达5×l010个/毫升,作为试验用菌液。PSB的固定化采用吸附法,将离心后收集的l0倍浓度PSB浓缩液以硅藻土为吸附剂吸附在表面使其固定化。使用前将固定化浓缩PSB在营养液中活化24小时,使硅藻土内PSB的活性得到恢复和强化。试验分…     

养殖大黄鱼加工和冰藏过程中鲜度和细菌类型的变化

通过对养殖海水以及捕获、加工、流通和冰藏等整个供应链过程养殖大黄鱼的温度履历、感官、化学、微生物的品质监测,评估养殖海水、碎冰和加工过程中大黄鱼细菌卫生状况,分析其在整个过程鲜度和细菌相变化。结果表明,养殖海水和碎冰的菌落总数分别为4.99±0.41 lg cfu/g和3.90±0.32 lg cfu/g,大肠菌群数分别为30~450 MNP/100 g和低于30 MNP/100 g;新捕获养殖大黄鱼的菌落总数为3.82±0.38 lg cfu/g,假单胞菌数为3.13±0.58 lg cfu/g,嗜冷菌数为2.82±0.60 lg cfu/g,大肠菌群数为低于30 MPN/100 g;冰藏第18天时TVBN含量为28.62±0.51 mg/100 g,菌落总数、假单胞菌数、嗜冷菌数和大肠菌群数分别为6.24±0.06lg cfu/g、6.01±0.25 lg cfu/g、5.68±0.21 lg cfu/g和30 MPN/100 g。养殖海水和新捕获鱼中细菌种类繁多,革兰氏阴性菌分别占其总菌株数的64.9%和56.8%;革兰氏阳性菌分别占其总菌株数的27.0%和42.0%;优势菌群为黏性威克斯菌、腐败希瓦氏菌和假单胞菌属。加工结束后,假单胞菌(34.9%)、玫瑰小球菌(32.6%)和缺陷短波单胞菌(14.0%)成为主要菌群。冰藏第4天时仅分离出4种不同类型的细菌,腐败希瓦氏菌比例上升明显,冰藏第10天和第18天时,所占比例分别为63.5%和69.1%,是冷却链养殖大黄鱼产品的优势腐败菌。     

正常鱼体内条件致病菌种类的调查研究

1998 年4 - 6 月, 作者对安徽省六安地区某养殖场正常鱼体内条件致菌种类进行调查。结果共分离到83 株条件致病菌, 经初步鉴定归为8 个菌属, 其中气单胞菌数量最多, 占总菌株数的59-1 % , 且在各种鱼不同组织脏器中和不同水温条件下均能分离到。表明气单胞菌是该养殖场鱼体中存在的主要条件致病菌。其余各菌属所占比例依次为不动杆菌(13-3 % ) 、黄杆菌(10-8 % ) 、肠球菌(6-0 % ) 、假单胞菌(4-8 % ) 、爱德华氏菌(3-6% ) 、变形杆菌(1-2 % )和克雷伯氏菌(1-2 % ) 。药敏试验结果显示治疗该养殖场鱼类气单胞菌感染的首选药物为环丙沙星、丁胺卡那和氯霉素。此外, 池水细菌总数与水温不呈正相关。     

一株异养硝化菌AD-28氨氮去除特性研究

以异养硝化菌——嗜碱假单胞菌AD-28为试验对象,通过单因子试验测定好氧条件下碳源、碳氮比、温度、pH、溶解氧、初始氮质量浓度及盐度等不同因素对嗜碱假单胞菌AD-28生长及氨氮去除的影响。试验结果表明,适用于嗜碱假单胞菌AD-28生长和氨氮去除的最佳条件为:碳源柠檬酸钠、丁二酸钠、乙酸钠,碳氮比20,温度25～35℃,pH 6.0,转速120r/min;在最佳条件下,嗜碱假单胞菌AD-28对初始质量浓度为20～160mg/L的氨氮去除率在24h内达95%以上。嗜碱假单胞菌AD-28能直接以氨氮为底物进行高效的硝化作用,并能耐受较低的温度(15℃)和较高的盐度(NaCl质量浓度为50g/L),在调节养殖水体水质方面具有广阔的应用前景。     

五种中草药对河蟹腐败假单胞菌的抑菌作用

分别采用钢环法和试管法研制了大黄、乌梅、五倍子等五种中草药对河蟹腐败假单胞菌的抑菌和杀菌效果。结果表明，乌梅对该菌有一定的抑制作用，五种中草药在供试浓度范围内对该菌均均杀灭作用。     

养殖水体中水质净化菌的筛选和鉴定

通过富集培养的方法,从养殖水体和淤泥中筛选出4株优良的水质净化菌.各菌株经鉴定分别为假单胞菌属(Pseudomonas)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、黄色节杆菌(Arthrobacter flavescens)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus).它们对模拟养殖水体中高达5mg/L的氨态氮和亚硝态氮的降解率均能达到80%和90%以上,其中假单胞菌属还具有反硝化作用.     

肉桂醛纳米乳的制备及其抑菌效果研究

为评价肉桂醛纳米乳对水产动物致病菌的抑菌效果,以吐温-80为表面活性剂、乙醇为助表面活性剂、乙酸乙酯为油相,加蒸馏水按比例配制成空白纳米乳,加入肉桂醛制备得肉桂醛纳米乳,并评价了肉桂醛纳米乳的部分特性;探究肉桂醛纳米乳对迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、鳗败血假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica)4种常见水产动物致病菌的抑菌效果。结果显示,肉桂醛纳米乳中吐温-80、乙醇、乙酸乙酯、蒸馏水和肉桂醛质量比为10∶5∶11∶73∶1,空白纳米乳对肉桂醛的最大载药量为20.11 mg/m L,肉桂醛纳米乳为水包油型淡黄色澄清透明液体,粒径5~20 nm,平均粒径10.74 nm;与同浓度肉桂醛溶液相比,肉桂醛纳米乳具有更强的抑菌活性,在最大载药量时,对嗜水气单胞菌、鳗败血假单胞菌、迟缓爱德华氏菌、温和气单胞菌的抑菌强度分别提高了65.56%、46.99%、41.94%、26.91%。肉桂醛纳米乳对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、鳗败血假单胞菌、迟缓爱德华氏菌的最小抑菌浓度(MIC)分别0.31、0.51、0.72、1.00 mg/m L。研究表明,肉桂醛纳米乳在水产养殖中具有潜在的应用价值。     

BALB/c小鼠用于评价尼罗罗非鱼无乳链球菌毒力的研究

实验采用BALB/c小鼠作为实验动物,旨在建立尼罗罗非鱼无乳链球菌毒力测定的BALB/c小鼠模型。BALB/c小鼠经腹腔注射尼罗罗非鱼源无乳链球菌建立感染模型,比较了尼罗罗非鱼源无乳链球菌分别感染尼罗罗非鱼和小鼠的LD_(50)差异,分别测定了不同毒力尼罗罗非鱼无乳链球菌对尼罗罗非鱼和小鼠的毒力。结果显示,小鼠经腹腔注射无乳链球菌,在24 h内出现死亡现象,且对小鼠脑、肝脏、脾脏、肾脏等组织造成损伤。3次测定尼罗罗非鱼无乳链球菌TFJ0901对尼罗罗非鱼和小鼠LD_(50)分别为7.7×10~7、2.2×10~8、3.5×10~9 CFU/mL和405、361、419 CFU/只。将无乳链球菌TFJ0901和THN0901感染尼罗罗非鱼(1.0×10~7 CFU/mL)和小鼠(100 CFU/只),尼罗罗非鱼和小鼠存活率分别为100%、6.7%±5.8%和100%、0,其存活率都具有显著性差异。将无乳链球菌TFJ0901和TFJ-F感染尼罗罗非鱼(3.0×10~8 CFU/mL)和小鼠(2 500 CFU/只),尼罗罗非鱼的存活率分别为73.3%±11.5%和80.0%±10.0%,存活率差异不显著,小鼠存活率分别为13.3%±11.5%和100.0%,存活率具有显著性差异。研究表明,本实验成功建立了BALB/c小鼠作为尼罗罗非鱼源无乳链球菌毒力测定的稳定模型,测定不同毒力的尼罗罗非鱼源无乳链球菌对小鼠毒力与对尼罗罗非鱼毒力一致,且该模型能够区分尼罗罗非鱼模型难以区分的毒力相近的无乳链球菌。     

刺参养殖池塘中一株植物乳杆菌的分离及其生物学特性

2017年5月,从山东东营刺参(Apostichopus japonicus)养殖池塘底泥中分离获得49株乳酸菌。以刺参“腐皮综合征”的2株致病菌[灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)]为指示菌进行拮抗作用实验,获得1株具有显著抑菌活性的乳酸菌CLY-5,对该菌株进行了生理生化实验、16S rDNA序列分析、生长特性及其对刺参的安全性研究。结果显示,菌株CLY-5对灿烂弧菌和假交替单胞菌具有较好的抑制作用,且菌株的胞内产物与胞外产物均具有抑菌效果,抑菌圈分别为20 、23 mm和27 、38 mm,胞外产物的拮抗作用优于胞内产物。利用该菌对刺参进行高浓度浸浴测试其安全性,浓度为1×109、1×108和1×107 CFU/ml,实验期间刺参状态良好,无死亡现象。16S rDNA序列分析表明,CLY-5与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum NR117813.1)的相似性为100%,初步鉴定该菌株为植物乳杆菌。菌株CLY-5在30℃~44℃、pH 6~8范围内生长较快,20 h进入对数生长期,28~32 h达到生长高峰。筛选的植物乳杆菌具有良好的抑菌能力,且其生长特性适应刺参池塘的养殖环境,为刺参疾病的生态防控及乳酸菌资源的开发提供应用数据参考。     

一株条斑紫菜丝状体黄斑病致病菌病原学研究#br#

采集山东省日照市岚山区藻类养殖合作社某紫菜育苗场的患有黄斑病的条斑紫菜(Pyropia yezoensis)丝状体,经2216E、TSB和TCBS 3种培养基体外培养,筛选获得优势菌株PZ201809121102,通过革兰氏染色、电镜负染观察、16S rDNA鉴定、生理生化分析、药物敏感性等技术方法对菌株进行鉴定分析,并结合回归感染实验确认菌株PZ201809121102的致病能力。结果表明:1)分离纯化后的优势菌株PZ201809121102在2216E海水培养基上的菌落形态呈细小圆形、中间突起、表面光滑呈亮黄色、匍匐镶嵌生长、属革兰氏阴性菌、短杆状、细胞大小(0.5~1.0)μm×(1.5~5.0)μm,透射电镜下观察到该菌株孢外具有单端生鞭毛;2)16S rDNA测序分析表明,该菌在所建16S rDNA系统发育树中与假单胞菌属聚为一支,与浅黄假单胞菌(Pseudomonas luteola)同源性最高,为100%;3)生理生化显示,该菌株在6%NaCl胰胨水、10%NaCl胰胨水中均生长,氧化酶反应阳性,鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶反应阳性;3%NaCl ONPG反应阳性。能同化利用葡萄糖,不能利用蔗糖、乳糖、密二糖、山梨醇等多糖;4)进行回归感染实验时,用10³~10⁸CFU·mL^-1的PZ201809121102菌悬液浸泡感染健康条斑紫菜丝状体。在13 d时,10⁸CFU·mL^-1感染试验组的条斑紫菜丝状体出现大小不一的黄色斑点,与自然发病的丝状体黄斑病症状一致,且可再次分离得到与自然发病丝状体中相同优势分离株,证明PZ201809121102有致病性,是引发条斑紫菜丝状体黄斑病的一种病原,菌悬液浓度小于10⁸CFU·mL^-1的各试验组丝状体中无明显黄斑病患病症状。5)药敏实验结果显示,PZ201809121102对罗美沙星和氟罗沙星两种药物高度敏感,对头孢唑啉、头孢氨苄、头孢拉定不敏感。本研究发现了导致条斑紫菜育苗期丝状体黄斑病的一株浅黄假单胞菌(P.luteola),可丰富对紫菜丝状体黄斑病的认识,以为今后对条斑紫菜育苗期丝状体黄斑病的防治提供参考。     

冷藏大黄鱼货架期预测模型的建立和评价

建立和验证了用于预测冷藏养殖大黄鱼(Pseudosciaena crocea)鲜度和剩余货架期的特定腐败菌生长动力学模型。感官、VBN评价和微生物生长动态分析表明,大黄鱼在0℃、5℃、10℃时有氧贮藏的特定腐败菌假单胞菌(Pseudomonasspp.)在感官货架期终点菌数NS(CFU.g-1)的对数(lgNS)平均值为6.48±0.14。将获得的假单胞菌在0℃、5℃、10℃的生长实验值用于建立生长动力学模型,结果显示,最大菌数Nmax(CFU.g-1)受贮藏温度的影响不大,在3种温度下lgNmax为7.18±0.031。温度对最大比生长速率(μmax)和延滞时间(Lag)的影响,采用Belehradek方程描述,呈现良好线性关系,R2分别为0.991和0.996。获得0~10℃有氧贮藏大黄鱼的剩余货架期(SL)预测模型为:SL=1/(0.093 8T+0.086)2-(7.18-lgN0)/[2.718×(0.009 6T+0.082 8)2]×ln-ln(6.48-lgN0)/(7.18-lgN0)-1(T为贮藏温度,N0为初始假单胞菌数)。用大黄鱼贮藏在3℃和8℃的货架期实测值验证建立的模型,预测值和实测值的相对误差分别为-8.89%和-6.59%,显示建立的模型可以快速可靠地实时预测0~10℃有氧贮藏大黄鱼的鲜度和剩余货架期。