木质素合成酶COMT基因的PCR扩增条件优化

以2×CTAB法从欧美杨107号嫩叶提取的基因组DNA为试材,建立了木质素合成酶COMT基因的PCR扩增体系。通过对PCR反应的影响因子——模板DNA用量、dNTP浓度、DNA聚合酶量、引物浓度和退火温度进行优化,最终建立了扩增COMT的PCR优化体系为:在20μL的反应体系中,dNTP为2.5 pmol,引物各为5 pmol,模板为5 ng,Red TaqTMDNA聚合酶1.25 U,退火温度为51℃,可以扩增出清晰的扩增带。     

适于PCR-RFLP分析的吊兰DNA提取

为了提取适合于PCR-RFLP分析的高质量的吊兰DNA,采用改良CTAB法提取了南阳市常见的宽叶吊兰、金边吊兰、金心吊兰的基因组DNA.通过测D_(260nm)/D_(280nm)检测了所得DNA的纯度及浓度.以所得3种吊兰DNA为模板,以植物中常用的通用引物trnH-trnK扩增了3种吊兰叶绿体中的基因及基因间隔区,并把所扩增的PCR产物用限制性内切酶Sau3A Ⅰ进行了酶切.结果表明,用该方法获得的吊兰DNA纯度高,D_(260nm)/D_(280nm)多在1.7～1.9之间,且电泳条带清晰,无拖尾,无降解,用作模板能扩增出目标产物,适合于吊兰的PCR-RFLP分析.     

枣属ITS及psbA-trnH序列PCR反应体系的优化与验证

为了建立和优化枣属植物核rDNA的ITS及cpDNA的psbA-trnH序列PCR反应体系,采用正交试验和单因子试验方法,对影响PCR扩增体系中的DNA模板、退火温度2个重要因子进行了比较分析。结果表明:枣属50μL反应体系中,DNA模板量为50～200 ng时,不同的DNA模板量对PCR反应体系影响不大;退火温度对PCR反应影响较为明显,最佳退火温度为52℃,扩增时psbA-trnH片段要求的退火温度较ITS序列更为严格。     

6种链霉菌基因组DNA提取方法比较

采用优化SDS、SDS、优化CTAB、CTAB、液氮研磨、微波法分别提取委内瑞拉链霉菌基因组DNA,比较6种方法的差异,选出最佳提取方法分别提取S.fradiae,S.venezuelae,S.ambofa-ciens,S.glaucescens,S.coelicolor基因组DNA,并利用16S rDNA的通用引物扩增相应的目的基因。结果表明:6种方法制备的基因组DNA以优化SDS法和微波法为上选,后者的纯度高但量很少。优化SDS法是6种提取方法中最可靠的DNA提取方法,DNA量大,纯度高,可靠,可作为PCR反应的模板进行16S rDNA基因有效扩增。     

兜兰ITS-PCR反应体系的建立及优化

为优化兜兰ITS-PCR反应体系,以兜兰属植物为试材,用改进的CTAB法提取总DNA,并采用单因子试验设计,对影响兜兰DNA ITS-PCR扩增反应的主要因素即Taq DNA聚合酶的用量、Mg2-浓度、dNTP浓度、引物退火温度、模板DNA用量和引物浓度等进行优化研究,建立兜兰最佳ITS扩增反应体系.结果表明:最佳反应体系为25 μL体系中,添加10×PCR buffer 2.5 μL、Taq DNA酶1.25U、Mg2+ 1.5mmol/L、dNTP 0.15 mmol/L、引物0.6μmol/L和模板DNA 40 ng,反应程序为94℃预变性4 min,1个循环;94℃变性30 s,54℃退火45 s,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸7 min后终止反应,4℃保存.利用此反应体系可得到预期大小的ITS基因片段.     

EPSPS基因的克隆及油用亚麻表达载体的构建

以抗草甘膦油菜基因组DNA为模板,PCR扩增抗草甘膦油菜的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因,构建植物表达载体pBI121-EPSPS,并导入农杆菌进行检测.结果表明:扩增获得EPSPS基因全长1 377bp,共编码459个氨基酸.测序结果表明,其与美国Monsanto公司获得的专利(US5633435)中已知的CDS序列完全一致,表明成功构建了EPSPS植物表达载体,并将其导入农杆菌菌株LBA4404中.     

蝴蝶兰SRAP反应体系的建立与优化

以蝴蝶兰嫩叶提取的DNA为材料,蝴蝶兰SRAP反应体系中的重要参数Mg2＋、Taq酶、模板DNA及随机引物,建立了一套适合蝴蝶兰基因扩增的SRAP反应体系：25μL的反应体系中Mg2＋浓度为2.0mmol/L,Taq酶1.0U,DNA模板40ng,上下游引物0.8mmol/L。该体系扩增条带清晰,重复性好,有望在蝴蝶兰属植物的遗传育种研究中运用。     

植物乳杆菌中胆盐水解酶结构基因的克隆与序列分析

胆盐水解酶主要是微生物在生长和繁殖过程中所产生的代谢产物;具有降低胆固醇的功能.克隆植物乳杆菌中的胆盐水解酶基因并对其序列进行分析.从植物乳杆菌中提取基因组DNA作为模板.根据Genbank上胆盐水解酶全长基因序列(EU477374)设计一对特异性引物,采用PCR扩增技术得到植物乳杆菌中胆盐水解酶基因并对其进行测序.结...     

棕榈科植物DNA的提取及SRAP引物筛选

采用CTAB法提取棕榈科植物基因组DNA,选用4个棕榈科植物DNA作模板,对100个SRAP引物组合进行筛选,以条带清晰多态性丰富为引物筛选原则,最后共筛选出14个组合作为棕榈科植物SRAP分子标记的核心引物,为后续SRAP分析提供依据。同时还对SRAP-PCR扩增程序进行优化,在不影响扩增效果的前提下,节约了大量实验时间。     

色素辣椒InDel-PCR反应体系优化及引物筛选

为建立和优化色素辣椒的InDel标记PCR反应体系,筛选多态性良好且重复性高的引物,为InDel分子标记在色素辣椒辅助育种、品种纯度鉴定及遗传多样性分析等提供可靠的技术支持.采用正交试验、单因素试验方法,对影响扩增体系中的模板DNA用量、引物浓度、2×Taq PCR Mix添加量等参数进行3因素4水平的正交试验比较分析,对循环数进行单因素试验优化分析.结果表明,对InDel-PCR体系扩增结果的影响程度中引物浓度最大,其次是模板DNA用量,而2×Taq PCR Mix添加量的影响不大.根据检测结果,出于成本和模板DNA用量的考虑,确定最佳InDel-PCR反应体系(10μL):模板DNA用量为35 ng、引物浓度为0.5μmol/L、2×Taq PCR Mix添加量为5μL.扩增程序:94℃预变性3 min;94℃变性30 s,退火30 s,72℃变性60 s,35个循环;72℃变性5 min;扩增产物在4℃保存.从240对InDel通用引物中最终筛选出14对适用于色素辣椒InDel-PCR候选引物.InDel标记是基于PCR的分子技术,选择适宜的引物及模板DNA浓度对扩增出清晰、稳定的条带很重要,优化后的10μL InDel-PCR反应体系及扩增程序,成功筛选出14条多态性较高的InDel引物,为后续的色素辣椒分子标记研究提供了可靠技术依据.     

"夏光"、"早夏16"甘蓝杂交种DNA指纹图谱的构建

用SDS法提取甘蓝(Brassica oleraceavar.capitata)杂交种“夏光”、“早夏16”及其各自亲本的基因组DNA,通过SSR、RAPD两种分子标记方法构建其DNA指纹图谱用于纯度鉴定。利用30对甘蓝SSR引物和50个适用于甘蓝的RAPD引物,以各杂交种及其亲本的基因组DNA为模板组合进行筛选,结果显示:多数SSR引物对两组合扩增带型一致,未能建立SSR指纹图谱;通过RAPD标记方法筛选出能鉴定两杂交种纯度的引物分别为S15、S42、S147和S42、S78、S88,其中引物S42对两组合均能扩增出特异的RAPD指纹图谱,并将RAPD指纹图谱转变为相应的数字指纹。     

均匀设计优化杨属的SRAP—PCR反应体系

采用均匀设计方法,对影响杨属SRAP-PCR体系的MgCl2、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶和模板浓度等因素分别进行了U16(45)和U12(35)两轮优化,建立了适用于杨属的SRAP-PCR反应体系。在25μL反应体系中,MgCl23.5mmol/L、dNTPs0.20mmol/L、引物0.44μmol/L、TaqDNA聚合酶1.50U、模板浓度28ng/L为最适条件。在此基础上又对退火温度进行了摸索,结果发现,扩增结果对退火温度变化不敏感。最后运用优化体系对杨属3派10个种共16个单株的DNA进行扩增验证,结果获得的DNA条带清晰,多态性比较丰富。说明这一优化的SRAP-PCR反应体系可用于杨属不同种间亲缘关系、系统进化和遗传多样性等方面的研究。     

思茅松毛虫2龄幼虫肠道好氧细菌的筛选及毒力测定

[目的]筛选思茅松毛虫（Dendrolimu.kikuchii Matsumura）2龄幼虫肠道好氧细菌并测定其毒力。[方法]将思茅松毛虫2龄幼虫中肠样品倍比稀释后涂布平板分离菌株,共分离得到5株好氧细菌。以细菌基因组DNA为模板,用细菌16S rDNA通用引物（27f和1492r）对模板扩增,并用4种限制性内切酶Hae Ⅲ和Hind Ⅲ、HinfⅠ和TaqⅠ对PCR扩增产物进行ARDRA多态性分析。[结果]聚类图谱分析发现,5株好氧细菌在95%的相似水平上聚成2个不同分类操作单元（OTU）,表明思茅松毛虫2龄幼虫肠道内好氧细菌的遗传多样性水平偏低。室内毒力试验表明,肠道细菌杀虫死亡高峰期在4～10d,菌株4杀虫效果最佳,12d时校正死亡率达到53.57%。[结论]为防治思茅松毛虫提供了参考。     

胡萝卜SRAP反应体系的优化

通过对胡萝pSRAP反应体系中Mg^2＋浓度、dNTPs浓度、引物浓度以及模板DNA浓度的优化,结果表明,在20μL反应体系中,DNA模板最适浓度为3．00ng／mL,Mg^2＋最适浓度为2．25mmoL／L,引物最适浓度为o．30μmoL／L,dNTPs最适浓度为0．20mmoL／L。     

拮抗链霉菌AFLP分析技术体系的研究

1材料与方法 1．1菌株供试拮抗链霉菌共10个菌株,均由该课题组分离自京郊菜田土壤和天然次生林土壤（表1）。     

拮抗链霉菌AFLP分析技术体系的研究(英文)

[Objective] The aim of this study was to investigate the preparation method and amplification system of antagonistic streptomyces DNA templates based on AFLP assays, and also provide a basis for the application of AFLP technology in the analysis of streptomyces or even actinomyces. [Method] The DNAs were extracted by the modified CTAB method and amplified by the Pst Ⅰ/Mse Ⅰ AFLP kit and its reaction system. The amplified products were analyzed by the denatured polyacrylamide gel electrophoresis. [Result] The genomic DNAs of ten antagonistic strains of Streptomyces were extracted and tested. The result of 0.8% agarose gel electrophoresis showed that the major DNA bands were clear without degradation and RNA residue, with the fragment sizes ranging from 37.64 to 40.86 Kb. By ultraviolet spectrophotometry, the OD260/OD280 values varying from 1.625 to 1.833 were obtained. Furthermore, the agarose gel electrophoresis of DNA products digested by Pst Ⅰ/Mse Ⅰ presented the dispersed fluorescent long band, which indicated that the enzymatic hydrolysis was fully carried out. The amplified bands of DNA templates by the screened three pairs of primers were clear with rich polymorphism. [Conclusion] The preparation method and amplification system of DNA template established in this study can be used in the AFLP analysis of Streptomyces.     

椰子SSR分子标记筛选

[目的]筛选可用的SSR分子标记,加快椰子分子辅助育种进程。[方法]采用改良CTAB法提取椰子基因组DNA,以基因组DNA为模板,对36对SSR引物进行筛选,以条带清晰、多态性丰富为引物筛选原则。[结果]共筛选出7对具有多态性的引物,其中2对多态性较丰富,可用于后续SSR分子标记分析。[结论]该研究为开展椰子种质资源遗传多样性系统分析提供了SSR引物。     

山西瘦肉型猪(SD-Ⅲ系)基因组DNA的AFLP和RAPD检测研究

用AFLP和RAPD两种分子标记对山西瘦肉型猪(SD Ⅲ系)进行纯度检测,旨在为评价该猪种的遗传稳定性提供相关参数,并对这两种方法应用于遗传距离、相似系数的估测进行了比较。AFLP实验用8条引物,对SD Ⅲ系14头猪进行了基因组DNA分析,共获得101个AFLP标记,单引物获得的标记数在3～15之间,群体相似系数为0 928(0 892～0 978);遗传距离为0 072(0 108～0 022)。RAPD实验用14条随机引物,共获得124个RAPD标记,单引物获得的标记数在4～11之间,群体相似系数为0 944(0 901～0 987);遗传距离为0 056(0 099～0 013)。结果表明:1AFLP和RAPD适宜于基因组DNA检测,但AFLP优于RAPD,2SD Ⅲ系猪纯度较高。     

姬松茸(Agaricus blazei Murrill.)gpd启动子的克隆及其序列分析

[目的]对姬松茸中分离的gpd启动子片段进行序列分析。[方法]根据报道的gpd启动子序列设计合成1对引物,以姬松茸基因组DNA为模板,采用PCR扩增法克隆得到了2条DNA特异性片段,并利用启动子信号扫描和启动子预测程序对2条序列的片段启动子区和转录结合位点进行分析。[结果]测序结果表明,2条序列分别为372bp和614bp,分别命名为J-gpd 1和J-gpd2,GenBank登陆号分别为：EU220746和EU220747;J-gpd 1有3个,J-gpd 2有4个核心启动子区;2条序列不仅具有基本启动子作用元件CAATBOX和TATABOX外,还具有多个重要作用元件,如CGCGBOX、GATABOX、ASF-motif、W-BOX、TGACGT-motif和GTGA motif等。利用TFSEARCH ver．1．3分析表明,2条序列还舍有多个转录因子结合位点,包括GCR1、ADR1、HSF、ABF1和RAP1等。[结论]研究推测,2条序列所启动的基因具有较高的多样性和准确性。