利用差异显示技术克隆辣椒抗疫病相关DNA序列的研究

用辣椒疫霉菌对八叶期的辣椒品种茄门和93-100-17-1-0进行诱导处理,提取接种前后的总RNA,利用mRNA差异显示技术,结合植物抗病基因保守结构域,DDRT-PCR的一端引物为oligo(dT)15A、oligo(dT)15G、oligo(dT)15C,另一端为来源于不同抗病基因同源序列的简并引物B1、C1、D1,其扩增产物在6%聚丙烯酰胺凝胶上得到两个差异表达的带。回收差异片段并克隆到T-载体上测序,经BLAST检索,发现为两个新的序列,GenBank登录号为AY497910、AY497911。     

冬枣两个ACC氧化酶基因的cDNA克隆及其表达模式

 根据植物ACC氧化酶（ACO）家族的氨基酸和核苷酸保守区序列设计简并引物,采用3′RACE技术从半红期冬枣果实中分离了两个ACO同源基因片段,随后通过PCR技术进一步获得了两个包含完整开放阅读框（ORF）及3′端非编码区（UTR）序列的ACO基因的cDNA,即ZjACO1和ZjACO2。两个基因序列在GenBank中的登录号为EU216549和EU216550,其大小分别为1 115 bp和1 105 bp,编码蛋白大小分别为319个和321个氨基酸。ZjACO1和ZjACO2在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分别为79.4%和84.0%。Northern杂交结果表明,这两个基因在冬枣叶片中不表达,而在不同发育阶段果实中的表达具有明显差异。     

莲藕GBSS基因cDNA全长的克隆与序列分析

采用RT-PCR结合RACE技术,扩增得到全长为2265bp的莲藕＂美人红＂品种的GBSS基因的cDNA序列（GenBank登录号EU938541）,其中开放阅读框（ORF）长为1848bp,共编码615个氨基酸。用DNAman软件比对,莲藕GBSS基因cDNA与金鱼草（AJ006293）、马铃薯（EU403426）、大豆（EF153101）、水稻（EU735072）Wx基因cDNA序列的同源性分别达61.2%、59.6%、64.2%、50.6%。对该基因编码的氨基酸序列进行Blastp分析发现,该序列与金鱼草的序列同源性最高,达到77%,与马铃薯、甘薯的同源性达到75%,与豆科植物的同源性在70%～75%,与禾本科植物的同源性在65%～70%。     

中国杏自交不亲和花粉特异SFB基因的鉴定与序列分析

利用花粉SFB基因的同源扩增结合内切酶酶切的方法,在9个中国杏品种中首次克隆了6个花粉SFB基因,对应花柱S-RNase基因序号将其分别命名为Par-SFB8、Par-SFB9、Par-SFB11、Par-SFB17、Par-SFB23和Par-SFB26,在GenBank上的登录号分别为EU652883、EU935588、EU652884、EU652885、EU652886和EU652887。序列分析表明杏的花粉SFB基因具有蔷薇科李属植物SFB基因的典型结构特征;其内含子位于5′端非翻译区,长度90 ~ 108 bp,核苷酸序列的同源性为63.9% ~ 93.3%。氨基酸序列的同源性比较表明,杏花粉SFB基因的种内同源性为73.7% ~ 85.3%;与李属其他植物花粉SFB基因的种间同源性为75.2% ~ 97.7%。利用特异PCR扩增进一步确定了杏的S9、S11、S17和S26单元型花柱S-RNase与花粉SFB基因间距离,表明花柱S-RNase与花粉SFB基因紧密连锁;同时组织特异性表达分析确定SFB基因在花粉组织中特异表达。以上结果说明获得的SFB基因为杏的花粉候选S基因。     

几个抗疫病性不同的辣椒材料抗病基因同源序列的分离与比较

 根据已克隆抗病基因的保守序列设计简并引物, 对9 个不同抗、感疫病的辣椒种质材料基因组DNA 进行抗病基因同源性序列的特异PCR 扩增, 经序列测定和同源性分析发现14 个抗病基因同源性序列(RGAs) 与辣椒抗疫病作用相关, 其中B 引物扩增的8 个RGAs 与烟草抗花叶病基因N 、拟南芥抗丁香假单菌基因RPS2 和亚麻抗锈病基因L6 的同源性较高, 属于广谱(细菌、病毒、真菌) 抗病基因同源序列; C 引物扩增的6 个RGAs 与番茄抗叶霉病基因Cf2 和Cf9 有较高的同源性, 与抗疫病作用密切相关。研究还发现, 高感疫病的辣椒基因组中也存在抗疫病相关RGAs , 这与已报道的辣椒抗疫病微效QTLs 位点则来于感病亲本基因组的研究结论一致。     

辣椒高赖氨酸蛋白基因Cflr全长cDNA的克隆及其组织表达特征

为了在茄科植物中寻找新的高赖氨酸蛋白基因,以辣椒栽培种‘江蔬7号'的成熟花粉为材料,根据马铃薯和番茄中高赖氨酸蛋白基因的保守序列设计引物,通过RT-PCR技术扩增到一条长390 bp的cDNA片段,继而应用RACE技术克隆了一个辣椒高赖氨酸蛋白基因的全长cDNA,命名为Cflr（GenBank登录号：EU367999）。Cflr基因cDNA全长920 bp,5＇端有84 bp的非翻译区,3＇端具有完整的polyA尾,包含一个编码223个氨基酸的完整开放阅读框。Cflr基因与马铃薯和番茄高赖氨酸蛋白基因cDNA序列的同源性为50%～60%,氨基酸序列的同源性为40%～50%。该基因所编码的蛋白质中赖氨酸含量为21.2%,苏氨酸含量为10.3%,是目前已知赖氨酸含量最高的天然蛋白。半定量RT-PCR结果表明,Cflr基因在辣椒未成熟花药、成熟花粉、花瓣、茎、叶片和根中均有表达,在成熟花粉和花瓣中的表达丰度最高,在叶片中表达量明显减少,而在未成熟花药、茎和根中的表达量极少。     

切花月季Rh-DREB1基因的克隆及其在乙烯和失水胁迫下的表达

以切花月季Rosa hybrida 'Samantha'为试材,通过简并引物和RACE方法从花瓣中获得了两个逆境诱导转录因子DREB家族基因全长.推定的氨基酸序列分析表明,这两个基因都具有DREB1转录因子的典型特征,因而分别命名为Rh-DREB1A和Rh-DREBIB,GenBank登录号分别为EU784069和EU784070.Rh-DREB1A和Rh-DREB1B分别包含一个编码222和231个氨基酸序列的开放阅读框.半定量RT-PCR分析结果表明,Rh-DREB1A和Rh-DREB1B在月季花瓣中能够被失水胁迫强烈诱导,但是不受乙烯诱导.由所得结果推测,这两个转录因子参与了失水胁迫诱导的信号转导途径.     

柑橘酸性转化酶基因片段的克隆

分析植物液泡和细胞壁转化酶基因的保守区序列，分别设计一对PCR引物，以柑橘基因组DNA为模板，采用PCR方法分别扩增出长约740 bp和530 bp的DNA片段，分别克隆入pBS－T 和pMD18－T载体，进行测序，结果表明，获得柑橘酸性转化酶基因家族的两个成员，成员A和B基因片段分别长742 bp和524 bp。其序列已在GenBank中登记（登记号分别为AF014925和AF314197）。在GenBank中进行同源性检索，结果表明，成员A编码的氨基酸与植物液泡酸性转化酶的氨基酸同源性较高，与拟南芥的最高，达76％，而成员B编码的氨基酸与植物细胞壁酸性转化酶的氨基酸同源性较高，与豌豆的最高，达71％。两成员核苷酸和氨基酸序列同源性分别为55％ 和50％，推测酸性转化酶基因成员A 和B编码的蛋白分别定位于液泡和细胞壁。     

马铃薯花青素转录激活基因stwd40的克隆与表达分析

根据GenBank中报道的茄属植物矮牵牛花青素wd40类转录激活基因an11及番茄wd40基因113964R的mRNA序列的保守区结构,设计简并引物,从紫色马铃薯皮中克隆了马铃薯wd40类转录激活基因的保守片段,再利用RACE技术分别获得了该基因的3′端和5′端。序列分析表明,该基因核苷酸序列为1292bp,具有完整的编码框,推导其编码362个氨基酸,命名为stwd40。推测的氨基酸序列与GenBank数据库中大量物种的花青素转录激活蛋白wd40有较高的同源性,其中与矮牵牛花青素转录调控基因an11的相似性达86%。RT-PCR表达分析显示stwd40在紫色马铃薯叶、茎、皮、肉及根中都有表达,其中在茎中的表达量最高,肉中表达量最低;其在白色马铃薯的叶、皮和肉中也有表达,推测该基因为组成型表达。     

白菜β-1,3 - 葡聚糖酶基因cDNA的克隆及序列分析

 以白菜抗霜霉病品种‘雪克青’cDNA 为模板, 采用RT2PCR 技术, 获得了1032 bp 的β- 1,3- 葡聚糖酶基因的cDNA 序列。序列分析表明, 克隆的β- 1,3 - 葡聚糖酶基因cDNA 序列编码343 个氨基酸, 与芜菁bg1 基因具有98 %的同源性, 与拟南芥bg2 基因具有84%的同源性。在GenBank 中登录号为AY395720 。     

β- 氨基丁酸诱导甜( 辣) 椒抗疫病作用的研究

 报道了用β- 氨基丁酸( DL-β-aminon-butyric acid, BABA) 喷雾处理辣椒叶片和茎后的诱导抗疫病作用。研究证明: 高浓度BABA ( 1 000 g/mL) 对离体辣椒疫霉病菌无抗菌活性, 用其喷雾处理辣椒的茎叶所诱导的抗疫病作用可完全控制其危害; 用BABA 诱导处理后3 d 接种辣椒疫霉病菌, 辣椒植株开始表达出较高的诱导抗性, 这种抗病作用可持续20 d 以上, 并表现出与数量抗病性相似的特性。     

表油菜素内酯诱导南瓜幼苗抗疫病研究

采用叶面喷施的方法，研究了24-表油菜素内酯(24-Epibrassinolide,EBR)对南瓜疫病的诱抗作用及其生理机制。结果表明，EBR处理降低了南瓜幼苗疫病病情指数，最高降幅达29.0 %；喷施EBR使南瓜叶片中H2O2含量增加，丙二醛（MDA）含量下降，过氧化氢酶（CAT）活性增强，过氧化物酶（POD）活性先缓慢下降然后升高；接种疫霉菌后，EBR使H2O2和MDA含量缓慢增加，但EBRP处理与CP处理相比，MDA含量显著降低，CAT活性显著提高，POD活性显著降低；喷施EBR明显促进南瓜幼苗生长，即使在接种疫霉菌后，植株的长势也强于CP处理。表明EBR通过调节植物体内氧的代谢平衡，增强南瓜对疫病的抗性。     

辣椒疫霉菌单个孢子囊快速分离及复壮技术研究

通过研究马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)和PDA含药选择性培养基(PDAPR)对辣椒疫霉菌单个孢子囊分离的影响,筛选出最佳进行单个孢子囊分离的培养基;利用一对抗、感品种作为寄主,通过常规抗病性鉴定技术,对陕西辣椒疫霉菌复壮前后的致病力进行了测定。结果表明:最佳进行辣椒疫霉菌单个孢子囊分离的培养基是PDA含药选择性培养基,其分离率高达95%,其中污染率只有15.8%;复壮前后菌株对感病品种的致病力有明显的差异,复壮后菌株的致病力比于复壮前提高27.2%,且与刚分离后菌株的致病力相当,说明通过复壮能够恢复辣椒疫霉菌菌株的致病力。     

68%金雷多米尔·锰锌水分散粒剂对辣椒疫病田间防治效果的研究

68％金雷多米尔-锰锌WG是辣椒疫病较为理想的防治药剂。于辣椒疫病发病前或初期极少数病株出现开始施药,施药次数以施药三次为宜,每次施药间隔期为7～10d(视气候条件和发病情况而定),使用剂量为100g～120g/667m2(a.i.为1020g/hm2)。每667m2喷施药液60kg时,其对辣椒疫病的防效为80.38％～85.44％,辣椒增产率为17.76％～27.12％。施药方法采用常规喷雾法,将药液均匀喷施于辣椒植株靠近地面的茎基部。     

辣椒疫霉菌拮抗木霉的筛选及抑菌机制研究

利用生长势和生长抑制率法从61株木霉菌株中筛选出辣椒疫霉拮抗菌株TR39,并对其抑菌机制进行了研究。结果表明:TR39对辣椒疫霉的抑制机制有重寄生和竞争作用,体外可以产生几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和纤维素酶等细胞壁降解酶;TR39还对11种其它病原真菌具有较强的抑制作用。     

离体筛选抗疫病辣椒变异体研究

以辣椒自交系B17、B25为试材，用子叶外植体诱导愈伤组织，以辣椒疫病病原菌粗毒素作为选择剂，筛选抗疫病辣椒变异体植株。结果表明，辣椒疫病病原菌粗毒素对辣椒子叶愈伤组织的诱导、不定芽的分化具有抑制作用，且随着粗毒素浓度的增加抑制作用增强，获得的抗性愈伤组织变异系对辣椒疫病病原菌粗毒素具有稳定抗性。     

大蒜粗提物挥发性成分分析及其对辣椒疫病的控制作用

采用室内毒力测定与田间防效试验研究大蒜粗提物对辣椒疫病菌的抑制作用及对病害的控制效果。结果表明，大 蒜不同部位粗提物均对辣椒疫病菌有很好的抑制作用，浓度越高抑制作用越强，特别是鳞茎粗提物，在150.0 mg·mL^-1 浓 度下，对辣椒疫病菌生长抑制率达100.00%。随着培养时间的延长，各粗提物对辣椒疫病菌的抑制作用下降。盆栽试验结果 表明，不同浓度大蒜各部位粗提物对辣椒疫病均有一定的控制效果，大蒜鳞茎粗提物浓度为150.0 mg·mL^-1 时，防效可达 59.38%。GC-MS 测定结果表明，大蒜根、茎叶和鳞茎粗提物中分别有20、19 和23 种挥发性物质，均以有机硫化物为主， 占总挥发性物质的90% 以上，但其组成成分和含量有明显差别。向培养基中加入硫醚类有机硫化物纯品，对辣椒疫病菌的 生长均有明显抑制作用，其中100 mg·L^-1 二烯丙基三硫醚对辣椒疫病菌的抑制效果最好，达60.55%。与大蒜轮作或混栽可 有效降低辣椒疫病的病情指数，防效分别达59.81% 和62.09%。这些结果说明大蒜挥发性物质在辣椒疫病的绿色防控上有很 好的应用前景。     

8种生物杀菌剂对南瓜疫病菌的室内毒力测定

采用菌丝生长速率法和孢子萌发法进行了8种生物杀菌剂对南瓜疫病菌(Phytophthora capsici)的毒力测定。结果表明,供试8种生物杀菌剂对南瓜疫病菌菌丝生长和孢子萌发均具有一定的抑制效果,其中1%申嗪霉素悬乳剂对南瓜疫病菌菌丝生长的抑制作用最强,2%宁南霉素次之,5%井冈霉素水剂最弱。     

辣椒疫霉菌对不同辣椒品种抗病性相关酶活性的影响

对优质抗辣椒疫病品种海丰Zt-277、特大汤椒二号F1和感辣椒疫病品种天骄2号进行辣椒疫霉菌接种,测定了辣椒叶片中与抗病性相关的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)的活性和丙二醛(MDA)的含量变化,结果表明,接种与未接种相比,抗病品种叶片中SOD,POD活性提高幅度要低于感病品种,MDA的含量提高幅度要高于感病品种.但不论辣椒疲霉菌接种与否,抗病品种辣椒叶片中SOD、POD活性高于感病品种;感病品种辣椒叶片中MDA含量高于抗病品种.