羊痘病毒P32蛋白编码基因的克隆及表达

为获得山羊痘病毒膜蛋白重组P32抗原，根据其基因序列设计合成了1对特异性引物，对CaPVP32基因进行了PCR扩增，产物大小约为969bp；产物回收纯化后，将其克隆至pBAD／Thio—TOPO载体中，转化TOP10大肠埃希氏菌感受态细胞，与已报道的多株CaPVP32基因序列的同源性高达99％；相应地，氨基酸序列同源性为98％。经测序筛选出阳性克隆，该重组菌株经L—arabinose诱导，可稳定、高效地表达CaPVP32抗原。表达蛋白为融合蛋白，分子质量约51．53ku．     

山羊痘病毒P32基因重组表达载体的构建及原核表达

以含山羊痘病毒贵州LD株P32基因的质粒pMD18-T-P32/LD为模板,应用PCR方法扩增P32基因,将该基因片段克隆至原核表达载体pET-28a,构建了重组表达载体pET-28a-P32/LD,转化大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示,有分子量约为35.5 ku的融合蛋白获得表达,与预期结果相符;Western-Blotting证实该表达蛋白具有免疫学活性。P32蛋白的成功表达为山羊痘基因工程疫苗的研制及诊断方法的建立奠定了基础。     

山羊痘病毒P32基因在杆状病毒中的表达

采用PCR亚克隆了山羊痘病毒P32基因片段,将其插入杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ中,构建了重组质粒pFastBac-P32;再将该质粒转化DH10 Bac感受态细菌,进行体内重组,然后经三重抗性及蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-P32;将Bacmid-P32转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒;最后用SDS-PAGE和Western-blotting对P32基因的表达进行检测.结果表明,P32基因在重组杆状病毒中获得表达,且表达产物可以被多抗所识别.     

羊痘病毒P32基因的截短表达与鉴定

根据GenBank上发表的羊痘病毒(CPV)P32基因序列,设计并合成一对引物,PCR扩增出837bp基因片段并克隆到pMD18-T载体中,酶切鉴定并测序。将P32基因定向克隆到pET32a表达载体中,酶切及测序鉴定正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。采用镍离子亲和树脂在变性条件下对蛋白进行纯化,Western blot证明该重组蛋白具有良好的反应原性。     

羊痘病毒P32蛋白基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

应用PCR方法扩增羊痘病毒特异性蛋白P32蛋白的基因,将其克隆至pMD18-T载体,测定核酸序列后将P32基因克隆至Bac-to-BacR杆状病毒表达系统中转移载体pFastBacl和pFastBacHTa,进而转化人含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,获得两种携带P32基因的重组转染质粒:Bacmid-Bacl-P32,Bacmid-BacHT-P32,经PCR试验鉴定,获得的这两种重组转染质粒是携带P32基因的杆状病毒表达载体,可分别用于转染Sf-9昆虫细胞以获得单一重组P32蛋白和六聚组氨酸融合体重组P32蛋白.     

山羊痘病毒P32基因真核表达载体的构建及表达

从重组克隆栽体pMD18-P32中扩增出山羊痘病毒P32基因,与毕赤酵母分泌性表达载体pPICgK相连接,构建重组表达载体pPIC9K-P32.重组质粒pPIC9K-P32用SaIⅠ线性化后,与毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115混合后电转化,使重组表达载体与酵母染色体发生同源重组.采用G418抗性梯度筛选法得到高拷贝重组菌株,甲醇诱导目的基因表达.SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,用酵母成功表达出了31 000的重组蛋白,该蛋白具有生物学活性,能被山羊痘阳性血清识别.     

云南山羊痘流行毒株P32基因的克隆与表达

山羊痘是由山羊痘病毒引起的一种严重的、高度接触传染的动物疾病,被国际兽疫局(OIE)列为A类动物传染病.临床上以体温升高、全身性或局部性皮肤痘疹及内脏病变(特别是肺)乃至死亡为特征.山羊痘病毒(GTPV)属痘病毒科脊索动物亚科羊痘病毒属的成员,该属其他成员还有绵羊痘病毒(SPPV)、疙瘩皮肤病病毒(LSDV).P32抗原是一种结构蛋白抗原,包含有一个主要的抗原决定簇,存在于所有的羊痘病毒属的3个成员中.针对山羊痘病毒与副痘病毒属存在免疫交叉反应,缺乏有效的鉴别诊断试剂盒,本研究克隆表达出羊痘病毒属特异的P32蛋白,为进一步研制抗体及抗原检测试剂盒奠定前期工作基础.     

山羊痘病毒P32蛋白的原核表达及其免疫原性研究

为表达山羊痘病毒P32蛋白并研究其免疫原性,构建了含有P32基因的重组表达质粒p ET-P32,诱导表达和纯化了P32蛋白;分别运用SDS-PAGE和Western blot,对该蛋白进行了分析和生物活性鉴定;用分析鉴定后的P32蛋白免疫BALB/c小鼠,然后采集小鼠血清,用间接ELISA进行抗体检测;用小鼠脾淋巴细胞增殖试验,检测该蛋白对机体的细胞免疫活性。结果显示:表达纯化的含有GST标签的P32重组蛋白,大小约39k Da;Western blot显示P32重组蛋白具有较好的特异性;间接ELISA抗体检测和小鼠脾淋巴细胞增殖试验表明P32重组蛋白具有良好的免疫原性。本试验结果为深入研究P32蛋白的生物学功能以及对山羊痘的诊断与防治奠定了基础。     

山羊痘病毒P32蛋白在毕赤酵母中的表达与鉴定

为了获得具有生物安全性高的体外表达蛋白,以含山羊痘病毒贵州LD株P32基因的质粒pMD18-T-P32/LD为模板,应用PCR方法扩增P32基因不同片段,将基因片段克隆至毕赤酵母菌表达载体pPICZαA中,构建了重组表达载体,转化感受态毕赤酵母菌X-33中并诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示,有分子量约为64 ku的融合蛋白获得表达,与预期结果相符;Western-blot证实该表达蛋白具有免疫学活性。     

羊泰勒虫主要表面蛋白P32基因的克隆及真核表达载体的构建

提取羊泰勒虫裂殖子总RNA,用特异性引物扩增出其主要表面蛋白P32基因,并成功地将该基因纯化后克隆到pGEM-T Easy 载体上,经PCR 和EcoRⅠ酶切鉴定均为阳性的重组质粒进行了测序和分析.随后将该基因从克隆载体上双酶切,与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9K-MPSP-P32,转化大肠埃希菌JM109,经测序证实,基因序列完全正确.     

布鲁氏菌P39基因的克隆、原核表达及其糖基化修饰

为探究糖基化修饰对布鲁氏菌P39蛋白免疫原性的影响,本试验对布鲁氏菌P39蛋白进行了表达和纯化,并对表达的蛋白进行了甘露六糖修饰。参照GenBank公布的布鲁氏菌P39基因序列设计引物,从布鲁氏菌16M基因组中克隆P39基因片段并连接至pMD19-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,提取阳性菌株质粒进行酶切等鉴定,鉴定正确后构建重组质粒pGEX-6P-1-P39,对重组蛋白进行诱异表达与条件优化。利用SDS-PAGE和Western blotting对诱导表达的目的蛋白进行分析,将鉴定正确的蛋白经GST亲和层析柱纯化。通过EDC/NHS法对纯化的P39蛋白进行甘露六糖修饰,研究甘露六糖修饰后目的蛋白对巨噬细胞吞噬的影响。结果显示,本试验成功克隆了片段大小为1 206 bp的目的基因,构建了pGEX-6P-1-P39原核表达载体,在大肠杆菌中成功表达了P39蛋白,该蛋白主要以可溶性形式存在。Western blotting结果显示,在约65 ku处有特异性条带。纯化后获得目的蛋白大小为43 ku,成功对目的蛋白P39进行了糖基化修饰,得到修饰产物与蛋白的摩尔比为2.3∶1。此外,糖基化修饰可显著提前蛋白激活小鼠巨噬细胞的吞噬作用时间。本试验结果可为研究甘露六糖修饰影响P39蛋白免疫原性的机制提供参考。     

猪IL-18基因原核表达载体的构建及表达

以含新兴猪IL-18基因的真核质粒pcDNA3.1-pIL18为模板,扩增出新兴猪IL-18基因,将其定向克隆至原核表达载体pET32c和pET41c的SacⅠ和KpnⅠ位点,构建了原核表达载体pET32c-pIL18和pET41c-pIL18。经酶切和PCR鉴定,表明所构建的重组质粒为特异性新兴猪IL-18基因原核表达质粒。将该重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)细胞,筛选的阳性菌落经SDS-PAGE分析及Western-blotting分析,表明成功构建了表达重组猪IL-18的大肠埃希菌基因工程菌株。蛋白的可溶性分析表明,重组蛋白呈不可溶表达,在菌体内以不溶性的包涵体形式存在。     

牛皮蝇Hypodermin B 基因的克隆及原核表达载体构建

参照牛皮蝇Hypodermin B(HB)基因的核苷酸序列,设计一对引物,以牛皮蝇总RNA为模板利用RT—PCR扩增牛皮蝇HB基因,并对扩增基因进行克隆测序。序列分析表明,克隆的牛皮蝇HA基因与GenBank中已经登录的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97．2％和99．3％。同时,将该基因与原核表达载体．PGEX-4T-1连接,构建并获得阳性重组表达载体。     

羊痘病毒P32蛋白的研究进展

P32蛋白是所有羊痘病毒具有的结构蛋白之一,含有重要的免疫原性决定簇。P32蛋白既是致病的关键因素,也是激发机体产生抗体并产生保护性免疫的主要成分。作者就羊痘病毒P32蛋白的基因组结构、抗原表位及P32蛋白应用于羊痘病毒诊断和免疫方面的研究进展作一综述。     

猪前胸腺素的分子克隆与原核表达初步研究

应用RT-PCR技术从猪肾脏中扩增到猪前胸腺素基因,测序结果表明,猪前胸腺素完整开放阅读框(ORF)共333 bp,编码109 aa,与已公布的2个猪前胸腺素基因核苷酸同源性均为99.4%.构建了重组质粒pET-32-mProTα,并转化大肠杆菌(E.coli)Rosetta 2(DE3).SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示,表达产物约占菌体总蛋白的40%,相对分子质量约为12.07 ku.MTT法试验证实,表达产物初步纯化、透析复性后,可明显增强淋巴细胞的增殖.     

人SOD基因的克隆与原核表达

超氧化物歧化酶(SOD)是机体内超氧自由基的天然清除剂,在抗衰老、抗辐射、抗逆境,消炎、抑制肿瘤和癌症,以及自身免疫疾病的治疗方面有很重要的作用。我国目前主要从血液中提取SOD,有关重组人SOD的研究较少。文章通过RT-PCR方法克隆得到人SOD基因,并成功构建其原核表达载体pET-16b-SOD,为通过基因重组技术生产人SOD创造了条件。     

鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的克隆及其原核表达

根据鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的gB基因序列和表达栽体pBV221的多克隆位点，设计了1对引物。以ILTV疫苗株基因组为模板，应用PCR扩增出gB基因片段，然后将其定向克隆于原棱表达载体pBV221中，构建了重组质粒pBV-gB。重组质粒转化到受体菌DH5α中，得到阳性重组菌株DH5α(pBV-gB)。该菌株在温控诱导下，SDS-PAGE电泳可见表达的特异蛋白。ELISA检测证明．表达的蛋白具有较好的反应原性。