一株鸭坦布苏病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

2010年我国爆发了使蛋鸭产蛋量急剧下降、由一种鸭黄病毒引起的疾病,通过对来自山东某发病鸭场的病料进行分离,得到实验室分离株Du/CH/LSD/110128。对其进行全基因组序列测定分析,确定该株病毒全基因组含有一个开放阅读框,编码一个由3 426个氨基酸组成的多聚蛋白。将试验测得株Du/CH/LSD/110128株与黄热病毒(Yellow fever virus)、登革热病毒(Dengue virus)、伊利乌斯脑炎病毒(Ilheus virus)、西尼罗病毒(West Nilevirus)、巴格扎病毒(Bagaza virus)和其他一些已公布序列的坦布苏病毒进行核酸同源性比较和遗传进化树分析,发现Du/CH/LSD/110128株与巴格扎病毒亲缘关系较近但介于病毒种的水平上,与其他株坦布苏病毒核酸同源性在87%以上,可以确定Du/CH/LSD/110128株属于新型鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus)。     

种番鸭源禽坦布苏病毒分离鉴定及基因组序列分析

种番鸭是否感染禽坦布苏病毒颇受国内学者关注。本研究于国内外首次自表现产蛋下降的种番鸭卵巢中分离获得1株病毒（命名为WYZLJ-1359株）,经RT-PCR方法鉴定为禽坦布苏病毒。经比较分析该病毒与我国其他禽源分离株全基因组序列表明,种番鸭源分离株WYZLJ-1359主要分子特征未出现变异,与2010年以来我国分离的其他禽源分离毒株的核苷酸序列同源性均在98.4％以上,且亲缘关系非常近,遗传距离均在1.8％以下,远低于与2000年以前分离的坦布苏病毒分离株之间的遗传距离。以上结果表明,我国禽坦布苏病毒感染的宿主在不断增加,但病毒在不同品种家禽的传播过程中遗传较为稳定,基因组未出现基因的缺失或插入等变异现象。     

鹅源坦布苏病毒SHYG株的分离与鉴定

【目的】分离鹅源坦布苏病毒,并研究其对雏鹅的致病性。【方法】用RT-PCR方法对江苏省3个鹅场送检的产蛋期病鹅样品进行检测;对坦布苏病毒核酸阳性的样品进行病毒分离,测定分离病毒的生物学特性和E蛋白基因序列。【结果】这些样品中坦布苏病毒呈阳性;从病料中分离鉴定一株病毒,命名为SHYG。E蛋白基因序列同源性比对显示其与中国鸭源坦布苏病毒同源性达到99.3%;生物学特性研究表明该病毒可致Vero细胞病变,对小鼠无致病性,接种2周龄雏鹅出现精神沉郁、腹泻、神经症状甚至死亡;组织学变化可见肝脏淤血、胆小管扩张、脂肪变性;肺淤血、炎性渗出及含铁血黄素沉着,脾脏网状内皮细胞空泡化,肾出血,脑充血、胶质细胞增生。【结论】坦布苏病毒SHYG株对雏鹅有较强的致病性。     

抗鸭坦布苏病毒NS5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

【目的】制备抗鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)NS5蛋白的单克隆抗体。【方法】将实验室保存的PET28a-NS5载体转化入Rosetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,利用纯化的鸭坦布苏病毒NS5蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,应用淋巴瘤细胞杂交技术结合有限稀释法制备单抗,并对单抗的特异性、反应性及其抗原表位和亚类进行鉴定。【结果】筛选获得2株稳定分泌针对DTMUV的NS5蛋白单抗的杂交瘤细胞,分别命名为A4D1和B4B8。此2株杂交瘤细胞诱导BALB/c小鼠的抗体效价均可达到1∶64 000。间接ELISA、Western blot和间接免疫荧光(IFA)检测结果表明,所获细胞分泌的抗体能与DTMUV及纯化的NS5蛋白发生特异性反应。经鉴定2株单抗的亚类均为IgG1型,通过叠加ELISA方法,初步判定2株单抗识别不同的抗原表位。【结论】成功获得了抗鸭坦布苏病毒NS5蛋白的单克隆抗体,为研究NS5蛋白的功能奠定了基础。     

鸭坦布苏病毒LH株E蛋白基因的克隆与结构

采用分子克隆技术对鸭坦布苏病毒(DTMUV)E蛋白基因进行克隆,同时运用多种生物学软件对该基因进行结构和生物学功能预测和分析.结果表明,本试验成功克隆了DTMUV LH株E蛋白基因,该基因包含一个1 500 bp的开放阅读框,编码500个氨基酸.遗传进化树分析表明,该蛋白与我国其他省份分离株的同源性很高.该蛋白的分子质量为54.3 ku,等电点为7.63,不存在信号肽序列,含有17个糖基化位点,有13个丝氨酸、4个络氨酸和8个苏氨酸的磷酸化位点.该蛋白存在跨膜区域,为亲水性蛋白.抗原位点分析表明,该蛋白有21个抗原肽段.本试验结果为E蛋白的生物学功能和致病机理的研究奠定重要的分子理论基础.     

鸭坦布苏病毒江门株的分离鉴定及其E基因系统进化分析

从2011年江门新会区某养鸭场产蛋下降鸭群中分离出1株鸭坦布苏病毒,命名为JM株。经RT-PCR检测、透射电镜形态学观察及动物回归试验,证明该病毒是引起该场蛋鸭群产蛋下降的病原。对该病毒E基因进行序列对比、进化分析后发现,JM株与我国华东地区最早发生的鸭坦布苏病毒亲缘关系最近,核苷酸相似性达99.1%以上,表明该病毒可能来自华东地区。     

鸭坦布苏病毒贵州株分离鉴定及其E基因生物信息学分析

从贵州三穗县某鸭场的病鸭病料中分离出1株坦布苏病毒(tembusu virus, TMUV),经鉴定将其命名为TMUV-GZ。为了解该分离株的生物学特性及其E基因的分子特点,测定TMUV-GZ株的半数胚致死量(ELD₅₀),将病毒接种至不同宿主细胞,观察其适应性与增殖能力;对E基因克隆测序并进行序列分析,对其编码的蛋白质进行生物信息学分析。结果表明：TMUV-GZ株能导致鸡胚和鸭胚死亡,该分离株无血凝性,在鸭胚上的ELD₅₀为10^-2.63·(0.2 mL)^-1;该分离株能在Vero细胞、BHK-21细胞和DF-1细胞上增殖,对BHK-21细胞适应性最好。该分离株的E基因与泰国分离株DK/TH/CU-99核苷酸同源性最高,为98.3%;一级结构预测E蛋白的理论等电点为5.01,不稳定系数为39.5,为稳定蛋白质;二级结构预测该蛋白质以α-螺旋、β-折叠、β-转角较多,为亲水性蛋白质,可能存在10个优势抗原表位、2个跨膜区、3个结构域,无信号肽;三级结构预测该蛋白质模型结构与其他黄病毒E蛋白实验结构之...     

鸡源坦布苏病毒（SN01株）的分离与鉴定

采用SPF鸡胚与vero细胞传代接种法,从江苏某蛋鸡场临床表现为产蛋下降、卵泡萎缩、全身多器官出血为主要特征的发病鸡肝脏、卵巢病料组织中分离一株病毒。该分离毒不能凝集鸡和鹅红细胞, 并对乙醚、氯仿敏感;病毒核酸为RNA;PCR结果排除了分离毒为禽流感病毒、新城疫病毒、产蛋下降综合征病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒;用坦布苏病毒特异引物扩增为阳性, 序列测定与分析结果显示分离毒与GenBank上登录和实验室保存的坦布苏病毒E基因序列同源性在99%以上。上述结果表明分离毒（SN01）可能是一种新的坦布苏病毒,属于黄病毒科坦布苏病毒属,暂称为鸡源坦布苏病毒。     

鸭坦布苏病毒E蛋白包被抗原间接ELISA方法的建立

以鸭坦布苏病毒E蛋白的主要优势抗原表位区E1蛋白作为包被抗原,建立检测鸭坦布苏病毒中和抗体效价的间接ELISA方法。优化后确定最佳的抗原包被浓度为1.548mg·L-1,血清的最佳稀释度为1∶100,酶标二抗的稀释度为1∶6 000。特异性表明,用建立的ELISA方法对禽流感、新城疫病毒、1型鸭肝炎病毒、胰腺型鸭甲肝病毒、禽霍乱和鸭疫里默氏杆菌的阳性血清进行检测,均未发生交叉反应;批内和批间重复试验的平均变异系数都小于10%;敏感性达1∶3 200。该方法与以全病毒为包被抗原的间接ELISA检测结果相关性达到95.1%。利用该方法对237份来自福建省开产麻鸭的血清样品进行检测表明,其血清阳性率达77.9%,表明福建省开产麻鸭感染鸭坦布苏病毒阳性率很高。本试验建立的间接ELISA检测方法具有特异性强,重复性好,敏感性高,为鸭坦布苏病毒抗体检测提供了简单快捷的检测方法。     

鹅坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅰ的原核表达及免疫原性鉴定

【目的】明确鹅坦布苏病毒（GTUMV）E蛋白结构域I的原核表达及免疫原性,为进一步研究GTMUV E蛋白结构的生物学特性、免疫学功能等奠定基础。【方法】通过人工合成方法获得GTMUV E蛋白结构域I的编码基因（EI基因）,并与携带GST标签的p GEX-4t-1载体连接,转入大肠杆菌后经诱导表达获得融合蛋白,并以Western blotting鉴定融合蛋白是否有免疫原性。【结果】合成获得的E1基因片段为411 bp,将其插入p GEX-4t-1载体可构建重组表达质粒p GEX-4t-1-EI。阳性重组菌经1 mmol/L IPTG诱导5 h后,融合蛋白的表达量达最高峰,且以包涵体形式存在,分子量约41.0 k Da。Western blotting鉴定结果显示,融合蛋白与GST标签抗体和E蛋白阳性血清均可发生特异性反应,检测到预期的目的条带。【结论】GTMUV E蛋白结构域I可在大肠杆菌中成功诱导表达,且获得的融合蛋白具有良好的免疫原性,可用于GTMUV血清学检测试剂盒的研发。     

半番鸭源鸭1型甲肝病毒亚型的分离鉴定及其VP1基因分析

自胰腺泛黄的雏半番鸭中分离获得1株病毒(命名为FJ1605株),经RT-PCR检测为鸭1型甲肝病毒,通过鸭胚中和试验发现该株病毒可被鸭1型甲肝病毒亚型(DHAV-1a)高免血清特异性中和,确定该株病毒为鸭1型甲肝病毒亚型。对该株病毒VP1基因进行分子特征分析,发现其核苷酸大小为714bp,与GenBank登录的DHAV-1a同源性为98.1%~99.7%,与DHAV-1FJ1220毒株同源性最高达99.7%;而与鸭2型甲肝病毒(DHAV-2)、鸭3型甲肝病毒(DHAV-3)VP1基因的核苷酸同源性仅分别为65.7%和68.3%左右。基于VP1基因的遗传进化分析表明,FJ1605分离株属鸭1型甲肝病毒亚型谱系。以该株病毒对7日龄雏半番鸭进行人工感染试验,可完全复制出同于临床病例的病变。以上结果显示,雏半番鸭也可感染DHAV-1a,且表现为胰腺泛黄。     

2株鸭源肠球菌的生物学特性的观察

对2株鸭源肠球菌临床分离株和1株粪肠球菌参考菌株的形态特征、培养特性、生理生化特性、对药物的敏感性等生物学特性进行了初步研究。结果表明,3个被检菌株在光学显微镜下呈球形、革兰氏阳性染色和链状排列方式,能在10℃、45℃和6.5%NaCl肉汤等条件下生长,能耐热60℃30min,其特性均符合肠球菌属的特征,各菌株生化反应特性均与粪肠球菌特性基本一致,3个菌株均可鉴定为粪肠球菌。药敏试验结果表明,3个菌株均对青霉素、万古霉素、庆大霉素、红霉素和氯霉素敏感而对四环素耐药。     

雏番鸭胰腺型鸭1型甲肝病毒分离鉴定及VP1基因分析

采集自胰腺发黄或出血的雏番鸭病料经RT-PCR检测为鸭1型甲肝病毒阳性后,接种11日龄非免疫番鸭胚获得一株病毒(命名为MPZJ1206)。该株病毒在不同温度下均不凝集鸡、鸭和绵羊红细胞;鸭胚中和试验表明蚀斑纯化毒可被经典的鸭1型甲肝病毒高免血清特异性所中和。该株病毒对7日龄雏番鸭的致死率为38.5%,病死鸭剖检病变与临床发病鸭相同,且从病死鸭脏器中回收分离到的病毒经鉴定仍为鸭1型甲肝病毒。应用鸭1型甲肝病毒VP1基因特异性引物从该株病毒克隆获得的714bp的基因片段,与经典鸭1型甲肝病毒分离株Du/CH/LGD/111239VP1基因的同源性最高,为99.1%,经遗传进化分析表明该株病毒属鸭1型甲肝病毒谱系。以上结果表明,雏番鸭胰腺炎是由鸭1型甲肝病毒感染所致,这一新病型明显不同于经典的鸭1型甲肝病毒感染引起的肝脏出血,鉴于此,建议将本试验分离株命名为胰腺型鸭1型甲肝病毒。     

江西部分地区种鸭坦布苏病毒病及鸭瘟免疫状况调查与分析

[目的]调查江西省部分地区规模化种鸭场鸭坦布苏病毒病和鸭瘟免疫状况.[方法]2020—2021年从江西省的11个规模化种鸭场采集血清样品1233份,应用酶联免疫吸附试验测定鸭坦布苏病毒病和鸭瘟的抗体水平.[结果]鸭坦布苏病毒病抗体的总阳性率为61.1％,阳性率最高的为E场(80.4％),11个种鸭场中有8个场的阳性率未达到国家合格率标准.鸭瘟抗体的总阳性率为80.5％,抗体阳性率较高的为I场(90.8％)和H场(88.8％),11个种鸭场中有2个场的鸭瘟抗体阳性率未达到国家合格率标准.不同季度调查结果显示第四季度鸭坦布苏病毒病和鸭瘟的抗体阳性率最高,第一季度的鸭坦布苏病毒病和鸭瘟抗体阳性率均未达到国家合格率标准.[结论]江西省部分地区规模化种鸭场的鸭坦布苏病毒病和鸭瘟免疫水平不容乐观.尤其是鸭坦布苏病毒病免疫水平较低,建议当地种鸭场加强鸭坦布苏病毒病和鸭瘟的免疫,定期监测抗体水平,优化免疫程序,以提高整个鸭群的保护力.     

绵羊痘病毒新疆株的分离及结构蛋白P32基因序列分析

[目的]对绵羊痘病毒当地流行毒株的分离和其结构蛋白P32基因的克隆和序列进行分析,明确引起新疆本地绵羊流行痘病的病毒种类,掌握当前流行毒株的变异情况,为绵羊痘的预防控制及将来研制高效安全疫苗提供科学依据.[方法]将两例疑似患有羊痘的绵羊肺脏组织病料接种于MDBK细胞进行病毒分离,细胞病变组织经处理后通过电子显微镜观察分离病毒.以分离病毒基因组DNA为模板,通过PCR扩增绵羊痘病毒结构蛋白P32基因,并对目的基因进行克隆和基因序列和蛋白生物信息学分析.[结果]两例病料组织接种MDBK细胞后均产生明显的细胞病变,电子显微镜观察可见到约200 nm大小、椭圆形有囊膜的典型痘病毒粒子.对两株病毒表面膜结构蛋白P32基因PCR扩增均可获得与预期大小一致的约972 bp片段,氨基酸序列分析表明分离毒株SPV/Miquang/2013和SPV/Kuche/2013病毒P32基因与绵羊痘病毒参考株同源性分别达96.9;～99.4;和97.5;～100;,生物信息学分析发现SPV/Miquang/2013株P32蛋白有两个关键氨基酸位点发生变异,即第78位谷氨酸突变为赖氨酸,第293位异亮氨酸突变为苏氨酸.[结论]从疑似病例中分离到两株病毒,通过电镜观察及P32基因扩增测序,与其他羊痘病毒比对后鉴定分离毒株为绵羊痘病毒,分别命名为SPV/Miquan/2013和SPV/Kuche/2013.SPV/Miquan/2013的P32蛋白同其他绵羊痘病毒的两个氨基酸位点发生明显突变.     

一个豇豆上的番茄黄化曲叶病毒分离物的分子鉴定及其基因组全序列

2008年秋,在上海郊区大棚栽培的豇豆上发现一种叶片褪绿和黄化病害症状。通过PCR从感病的植株叶片中扩增出番茄黄化曲叶病毒的全序列。序列比较及系统进化分析表明,这种病毒是菜豆金色黄花叶病毒属成员之一的TomatoYellwLeafCurlVirMs—Israel（TYLCV-IL）。基因组是由2781个核苷酸组成的环状单链DNA,具有典型的旧世界单组分菜豆金色黄花叶病毒属病毒的特征,有6个开放阅读框,V2和V1（外壳蛋白基因）在病毒链上,而C3、C2、C1和C4在互补链上。这是国内番茄黄化曲叶病毒侵染豇豆的首次报道。     

水貂株犬瘟热病毒融合蛋白基因的克隆与序列分析

以犬瘟热病毒水貂分离株RNA为模板,经RT-PCR反应,扩增出融合蛋白基因的1053bp DNA片段,通过T-A克隆技术,成功构建克隆载体PMD-18T/F。序列分析表明:分离株与01-2689株、2544-Han95株、A75-17株、DOGDK91C株、00-2601株、ONP株、PDV-2株核苷酸序列同源性分别为94.3%、93.5%、94.4%、93.6%9、5.3%、97.3%和94.5%;氨基酸序列同源性分别为97.2%、96.6%、97.4%、97.4%、97.4%、97.2%和98.0%。抗原指数分析表明分离株与疫苗ONP株、强毒A75-17株在40-50位氨基酸间存在明显差异。     

部分地区猪传染性胃肠炎病毒株ORF7基因的序列分析

猪传染性胃肠炎（Porcine Transmissible Gastraenteritis,TGE）是猪的一种高度接触性肠道疾病。以不同地区猪传染性胃肠炎病毒株的ORF7基因为靶序列,序列分析不同地区TGEV病毒株ORF7基因的同源性和进化性关系,序列分析包括同源性比较、进化树分析和碱基替换分析等。结果表明：ORF7基...