检测猪肺炎支原体抗体间接ELISA方法的建立

选用猪肺炎支原体Mhp J株培养物制备抗原,建立检测猪肺炎支原体抗体的间接ELISA(酶联免疫吸附)方法.结果显示,ELISA试验的最佳反应条件为:抗原包被浓度为1.5 μg/ml,待检血清的最佳稀释浓度1∶100,2%明胶作封闭液,抗原抗体最佳结合时间为90 min,酶标抗体1∶10 000(体积比)稀释,最佳作用时间为60 min.对136份样品检测结果表明,建立的猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测方法与美国IDEXX公司生产的猪肺炎支原体抗体检测试剂盒检测的符合率达到83.8%,假阴性率8.8%,假阳性率1.5%.     

猪支原体肺炎可疑肺组织PCR检测方法的建立

建立了病猪肺脏组织的处理方法和DNA提取方法,根据猪肺炎支原体的P36基因设计一对引物,建立猪肺炎支原体PCR检测方法,并对该方法进行了特异性和敏感性试验,使用建立的方法检测了临床样品。结果表明,建立的检测方法能成功从猪支原体肺炎可疑肺组织中扩增出目的条带,成功建立了猪支原体肺炎可疑肺组织PCR检测方法,为该病的诊断提供了条件。     

检测疫苗中猪肺炎支原体污染的PCR-斑点杂交法和套式PCR法比较研究

为建立一种敏感、特异的检测疫苗中猪肺炎支原体污染的方法,设计了猪源支原体PCR通用外套引物和猪肺炎支原体种特异性内套引物及地高辛标记寡核苷酸探针,建立了PCR-斑点杂交技术,应用于猪瘟活疫苗中猪肺炎支原体污染的检测,并与套式PCR技术进行比较研究.结果显示,探针最低检出DNA量为23.4 pg,比套式PCR(最低检出量为62.5 pg)敏感性更高,且探针与鸡毒支原体和大肠杆菌DNA无交叉反应.对来自6个生产厂家共90批疫苗的检测结果显示,PCR-斑点杂交法比套式PCR法对疫苗猪肺炎支原体污染的检出率高10%.以上结果表明PCR-斑点杂交法具有更高的敏感性和特异性,在疫苗猪肺炎支原体污染的检测中具有推广应用价值.     

猪肺炎支原体DnaK基因的表达及ELISA方法建立

猪肺炎支原体(Mhp)是猪气喘病的主要病原体。利用Mhp NJ株的DnaK基因通过SOE-PC(splicing withoverlap extension PCR)R扩增和突变,获得了目的片段并插入表达载体pET-28a(+)中,然后转入宿主菌BL21(DE3)。重组质粒经1 mmol/L IPTG在37°C温度下诱导5 h,目的蛋白可达到总蛋白的14.1%。Western Blotting证明表达的重组蛋白具有猪肺炎支原体反应原性,用该重组蛋白建立的ELISA方法可检测到猪肺炎支原体抗体。此为该病基因工程疫苗抗原的筛选和ELISA诊断试剂盒的研制奠定基础。     

猪肺炎支原体PCR检测方法的建立及初步临床应用

根据GenBank中猪肺炎支原体（Mhp）J株P36蛋白基因（登录号X67286）的核苷酸序列设计1对引物,建立了快速检测Mhp的PCR方法。该方法能扩增出948bp的Mhp特异性条带,其敏感性达到可检测出0．735ng的MhpDNA,但对鸡毒支原体、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪流感病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒均未检测出相应目的条带;将克隆获得的目的片段与GenBank已发表的MhpJ株的P36基因进行比较,同源性达到99．9％。采用所建立的PCR方法对42份疑似猪支原体肺炎（MPS）病料进行临床诊断,发现有13份呈阳性（31．0％）。可见,该PCR方法适合于MPS的临床诊断,可为其防控提供可靠依据。     

猪鼻支原体间接血凝及EUSA检测方法的初步建立

本试验旨在建立猪鼻支原体间接血凝及ELISA检测方法,为猪鼻支原体的血清学诊断、流行病学调查及防控提供技术基础。利用Mhv全茵及P37蛋白为抗原．通过间接血凝及ELISA方法检测抗体,初步建立猪鼻支原体血清学检测方法。结果表明：利用Mhv全茵抗原建立的间接血凝法检测猪鼻支原体阳性血清具有较高的抗体效价。但与猪肺炎支原体阳性血清存在严重的交叉反应：这些结果提示Mhv全茵间接血凝及全茼包被ELISA方法检测Mhp血清与Mhp存在严重交叉反应,而P37包被ELISA不存在交叉反应。     

猪鼻支原体间接血凝及EUSA检测方法的初步建立

本试验旨在建立猪鼻支原体间接血凝及ELISA检测方法,为猪鼻支原体的血清学诊断、流行病学调查及防控提供技术基础。利用Mhv全茵及P37蛋白为抗原．通过间接血凝及ELISA方法检测抗体,初步建立猪鼻支原体血清学检测方法。结果表明：利用Mhv全茵抗原建立的间接血凝法检测猪鼻支原体阳性血清具有较高的抗体效价。但与猪肺炎支原体阳性血清存在严重的交叉反应：这些结果提示Mhv全茵间接血凝及全茼包被ELISA方法检测Mhp血清与Mhp存在严重交叉反应,而P37包被ELISA不存在交叉反应。     

猪肺炎支原体 P65蛋白的单克隆抗体的制备

P65蛋白是猪肺炎支原体的主要免疫优势蛋白,与其他支原体无交叉反应,常作为猪肺炎支原体检测的靶蛋白。本实验应用原核表达的重组 P65蛋白免疫小鼠,用 Mhp全菌蛋白和P65蛋白筛选,制备了1株特异性单克隆抗体3G12。鉴定结果表明,该株单克隆抗体可与 P65蛋白和 Mhp全菌蛋白反应,采用间接 ELISA法测得3G12细胞培养上清与P65蛋白反应抗体的效价为1∶12800,与全菌蛋白反应抗体的效价为1∶3200;3G12腹水与P65蛋白反应的抗体效价为1∶4000000以上,与168全菌蛋白反应的抗体效价为1∶20000以上,细胞经长期体外培养和冻存后复苏能稳定分泌抗体。本研究成功获得到1株针对 P65和Mhp全菌的单克隆抗体,为猪肺炎支原体致病机制和检测方法的进一步研究提供了基础。     

猪肺炎支原体人工感染引起易感猪各肺叶病变差异的研究

为研究猪肺炎支原体对易感猪肺脏及各肺叶部位的损伤差异性,选二元猪(大白×二花脸)和三元猪(杜洛克×长白×大白) 2个品系,共6批次的猪肺炎支原体(Mhp)阴性猪,经人工"气管定位注射"途径感染猪肺炎支原体,于感染后28 d剖检,通过肉眼观察,运用"猪支原体肺炎的肺病变28分制评分法"对肺脏及各个肺叶部位所显示的病变情况进行测算、评分、统计和分析,并对所收集的肺泡灌洗液(BAFL)中猪肺炎支原体病原进行PCR检测。结果表明:猪肺炎支原体能引起肺脏各个肺叶产生特异性"虾肉样"病变,该病变主要呈现在心叶和尖叶部位。不同肺叶所呈现的病变程度存在一定的差异,其中猪肺炎支原体对心叶造成病变最严重,且右心叶比左心叶严重。猪肺炎支原体引起的右肺的病变程度高于左肺,推测其在右肺部位的定植水平可能高于左肺。通过猪肺炎支原体人工感染引起易感猪各肺叶病变差异的研究,为丰富猪支原体肺炎的临床诊断方法和致病机制、疫苗免疫效果评价研究提供了参考依据。     

猪肺炎支原体气溶胶富集检测技术的建立(英文)

[目的]建立一个高效的猪肺炎支原体气溶胶富集和检测技术,以弥补临床上猪肺炎支原体气溶胶检测技术的空白。[方法]结合液体冲击式采样器和过滤式采样器的原理,自行设计一个气溶胶双重富集装置,并在密闭环境下采集人工制备的猪肺炎支原体气溶胶,荧光定量PCR检测以确定该装置的采集效率。再通过收集不同猪群中的气溶胶进行检测以确定该装置临床应用的可行性。首先,收集人工感染Mhp阴性仔猪后不同时间猪舍内的气溶胶;其次,收集1个猪支原体肺炎发病猪场和1个阳性未发病猪场的产房、保育舍和育肥舍共11个猪舍的气溶胶,荧光定量PCR或套式PCR检测所收集的气溶胶。[结果]实验室模拟采样的采集效率达到(37.04±6.43)%,人工感染猪肺炎支原体后7天即在饲养房间的气溶胶中检到猪肺炎支原体;2个猪场共11个不同猪舍气溶胶中猪肺炎支原体检测结果均为阳性,检出率100%。[结论]成功建立了一个高敏感性的猪肺炎支原体气溶胶富集检测技术,适用于临床上猪肺炎支原体气溶胶的检测。     

反向斑点杂交法快速检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯G病毒

[目的]以克隆得到的甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV）和甘薯G病毒（Sweetpotato virusG,SPVG）基因片段为探针建立反向斑点杂交技术体系,应用于甘薯组培脱毒苗带毒情况检测,为生产优质甘薯组培脱毒苗提供保障.[方法]根据已公布的侵染甘薯的SPFMV和SPVG的核苷酸序列设计两对特异引物,以RT-PCR法从染病的甘薯叶片扩增SPFMV和SPVG的两个片段,并以克隆到的两个病毒片段及内参基因Actin片段为探针建立反向斑点杂交体系.[结果]分别克隆出长度约310和500 bp的片段,经BLAST比对,所获得的310 bp片段为SPFMV的外壳蛋白基因片段,同源性为97％,500 bp片段为SPVG的外壳蛋白基因片段,同源性为99％.分别用带有SPFMV和SPVG片段的重组质粒pUC-SPFMV和pUC-SPVG进行反向斑点杂交,发现不同病毒能获得单一信号,无交叉现象.以染病甘薯和脱毒甘薯苗为样品,用该种病毒的探针进行反向斑点杂交,染病植株样品中能获得单一信号,而脱毒苗甘薯样品未见任何信号,杂交结果与RT-PCR检测结果一致.[结论]用建立的反向斑点杂交技术体系能有效检测甘薯中的SPFMV和SPVG,无交叉信号,可用于甘薯组培脱毒苗的前期检测.     

用cDNA点杂交及ELISA测定大麦黄矮病毒及分子间互作

本文比较了ｃＤＮＡ点杂交与酶联免疫吸附试验在大麦黄矮病毒的鉴定、检测及病害诊断中的应用特点及价值，并利用这两种技术研究在混合侵染中不同病毒（株系）间所发生的一些互作。通过使用适当的抗体或。ｃＤＮＡ探针，这两种检测技术均能特异地测定大麦黄矮病毒。尽管ｃＤＮＡ点杂交具有更高的灵敏度，但酶联免疫技术是目前最理想的病毒快速检测方法。这两种方法结合后所产生的另一技术－免疫杂交技术可成功地检测自然条件下受混合侵染病株内病毒或株系间的相互作用，这些相互作用包括＂表型混合现象＂和＂反式壳体化＂等。本文还对自然条件下检测这种病毒间相互作用的意义进行了讨论。     

应用~(32)P 标记DNA探针检测伪狂犬病病毒的研究

本文报道建立了一种以~(32)P 标记的 PRV 全基因组 DNA 和重组质粒PSAG1-19DNA 作为探针,检测感染培养细胞中 PRV-DNA 的斑点杂交法。两种探针均能检测10Pg 的 PRVNDA,而与正常细胞抽提物无同源关系,具有较高的灵敏度和特异性。应用了一种快速、简便的 PRV DNA 抽提法,简化了样品制备的程序,提高了检测的可靠性。比较研究了杂交法中的一些重要条件,包括探针的选用,样品 DNA 的处埋,滤膜的选用等,为检测 PRV 提供了一种灵敏、可靠的方法。     

猪肺炎支原体PCR鉴定方法的建立

根据猪肺炎支原体的P36基因序列设计一对引物,建立猪肺炎支原体PCR检测方法,并对该方法进行了特异性和敏感性试验。成功建立了猪肺炎支原体特异且敏感的PCR检测方法,可区别猪鼻支原体、絮状支原体和鸡毒支原体,最低检出量为4.26 ng。     

猪肺炎支原体P97单抗的生物学特性鉴定及初步应用

对已成功制备的猪肺炎支原体P97原核表达产物单抗进行生物学特性鉴定。鉴定结果为:两株单抗的免疫球蛋白亚类均为IgG1,亲和常数分别为52 mg/L,46 mg/L。单抗腹水中的间接ELISA效价分别为1×106和1×105。两株单抗特异性的识别猪肺炎支原体168株97kD左右的抗原成分。在Dot-ELISA试验中,两株单抗均与猪肺炎支原体反应,而与猪鼻支原体(Mh)、猪絮状支原体(Mf)和鸡毒支原体(Mg)无交叉反应。进一步将该单抗用于单抗阻断ELISA中,检测了36份血清样,其中9份呈阳性,检测结果与IDEXX公司猪肺炎支原体抗体检测试剂盒的结果基本吻合,从而为猪肺炎支原体诊断试剂盒的研制及猪气喘病早期诊断方法的建立奠定了基础。     

克伦特罗残留GC-MS检测方法的建立及对自制试纸条性能的确证

建立了猪尿液中盐酸克伦特罗(CL)残留的GC-MS检测方法,并对自主研制的CL残留快速检测免疫金标试纸条(CL-Strip)进行了比较分析.结果表明,GC-MS的检测限为0.5ng/ml,CL-Strip的检测限为1.0ng/ml:CL-Strip与GC-MS两者的加标测定实验结果完全一致;用CL-Strip检测出的100份阴性尿样和18份阳性尿样,与GC-MS检测结果完全一致.说明CL-Strip与GC-MS同样灵敏、准确、稳定,由于CL-Strip具有简便、直观、快速、敏感、特异、准确等优点,建议在CL残留快速检测中推广应用.     

用PCR、斑点杂交及间接免疫荧光试验诊断鸡传染性贫血的初步研究

利用地高辛标记的０８５ ｋｂ 的鸡传染性贫血病毒 （ Ｃ Ａ Ｖ） 核酸探针, 对江苏某地区疑为 Ｃ Ａ Ｖ 的１５～３０日龄病鸡的肝 Ｄ Ｎ Ａ 样品进行斑点杂交。结果在被检的２０份样品中有６份为阳性,阳性率为３０％ 。对相同样品根据已知引物（特异性扩增出 Ｃ Ａ Ｖ 的０５８ ｋｂ Ｄ Ｎ Ａ） 进行 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增, 所得结果与斑点杂交相同。对应的病鸡血清经间接免疫荧光试验 （ Ｉ Ｆ Ａ）, 有７份为 Ｃ Ａ Ｖ 抗体阳性, 与 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增结果的符合率为８３％ 。初步结果表明, 江苏某地区存在 Ｃ Ａ Ｖ 感染。