超量表达PMADS20-SRDX 的矮牵牛花瓣和雌蕊出现异位表皮毛和气孔

 以矮牵牛（Petunia hybrida）花序cDNA 为模板，利用EST 数据库信息，克隆了一个MADS-box 基因编码区序列，GenBank 登录为PMADS20（GU129907）。进化树分析表明，PMADS20 属StMADS11 亚家族SVP 分支，与番茄和辣椒的JOINTLESS 基因氨基酸序列相似性最高。定量PCR 检测结果表明， PMADS20 在矮牵牛营养器官中的表达量高，在花中的表达量低。构建了PMADS20 的超量表达载体（35S︰ PMADS20）和CRES-T（Chimeric Repressor Gene Silencing Technology）载体（35S︰PMADS20-SRDX）。 35S︰PMADS20 和35S︰PMADS20-SRDX 转基因矮牵牛的花器官表型变化相似，花萼增大，花瓣和雌蕊 出现营养器官特征，但35S︰PMADS20-SRDX 的变化更为明显。扫描电镜观察显示，35S︰PMADS20-SRDX 转基因花瓣下表皮的表皮毛增多，并有气孔分布；子房和花柱表面为表皮毛覆盖，呈现超量表达UNHAVEN 的矮牵牛心皮的特征，并且有气孔分布。35S︰PMADS20 转基因植株株形无明显变化，35S︰PMADS20-SRDX 植株花序的节间较野生型短。     

矮牵牛PMADS9基因的结构特征和mRNA的表达分析

 PMADS9基因是MADS-box基因AGL15亚家族成员,而AGL15基因被认为在开花植物中具有促进胚胎发生、延缓衰老进程的作用。使用PCR法克隆到了PMADS9基因的基因组序列EU338501,通过同家族基因比较分析发现矮牵牛PMADS9基因和番茄SIMBP11基因组织结构相似,和其他同源基因相比有着较长的第3外显子和庞大的1、2内含子等显著特征。通过Southern杂交初步判定其在基因组中可能为单拷贝。利用荧光定量分析发现PMADS9基因在花药和子房中优先表达,并在随后合子胚发育过程中持续表达,这与AtAGL15在拟南芥中的表达模式略有不同。对矮牵牛幼苗施加不同化学和物理处理后发现PMADS9基因对2,4-D和GA3处理有反应,并在多种胁迫环境下表达量增加,可能参与植物抗逆途径。     

建兰花发育相关B、C和E类MADS-box基因的表达分析

开花植物中B、C和E类MADS-box基因控制花雄蕊和雌蕊的合成。以具有高度进化蕊柱（雄蕊和雌蕊合生）的建兰为材料,从已有转录组中搜索到14个B、C和E类基因,包括GLO、DEF、AG、SEP和AGL6类基因,并进行实时荧光定量表达分析,发现CeDEF1和CeAGL6-1在萼片和花瓣中大量表达,唇瓣中微量表达;CeDEF3、CeDEF4和CeAGL6-3则在唇瓣和蕊柱中大量表达,在萼片和花瓣中几乎不表达;CeAG1和CeAG2主要在蕊柱中表达;而且CeDEF3、CeDEF4、CeAG1、CeAG2和CeAGL6-3在蕊柱突变体‘新品梅’的蕊柱状花瓣中的表达量比‘铁骨素’花瓣中高很多,说明这几个基因在建兰蕊柱的形成过程中可能扮演关键角色。     

超量表达PhWRIL1基因抑制矮牵牛叶片外植体再生不定芽

许多研究发现AP2/ERF家族euANT支基因超量表达可以促进植物生长和离体再生。但尚未有关于与euANT支亲缘关系很近的AP2/ERF基因basalANT进化支基因超量表达对离体培养中不定芽再生影响的研究。本研究中从矮牵牛中克隆了一个basalANT基因,命名为PhWRIL1。Real-time PCR结果显示,PhWRIL1的mRNA在矮牵牛各种组织中均有表达,表达量处于中等水平,在成熟组织中比幼嫩组织中更高。超量表达PhWRIL1的矮牵牛植株严重矮化,但开花时间没有显著变化。测定再生能力的结果表明：PhWRIL1超量表达的转基因植株叶片外植体的愈伤组织和芽的诱导与生长明显减少。这些结果表明PhWRIL1在矮牵牛中超量表达抑制了离体培养过程中不定芽的再生能力,在植物发育过程中basalANT和euANT基因可能发挥相反的作用。     

GhMADS3基因组成型表达对矮牵牛花形和花色的影响

 利用农杆菌介导法将GhMADS3基因转入矮牵牛。对14株转基因植株进行分析鉴定, GUS染 色表明外源基因在转基因植株中表达, PCR检测显示GhMADS3整合到矮牵牛的基因组中, RT-PCR分析表 明GhMADS3在转基因植株中表达。转基因植株花器官普遍较野生型小, 花萼膨大、顶尖向内弯翘, 花冠深 裂且边缘伴有不规则褶皱, 柱头裸露在外, 花器官颜色较野生型变淡甚至完全白化。测定花瓣、花萼中花 色素苷和花萼中叶绿素含量, 结果表明转基因植株均较对照偏低。说明GhMADS3的导入使得矮牵牛花形、 花色发生改变。     

大岩桐SsPIN2基因的克隆及组织表达分析

以大岩桐为试材,采用RT-PCR方法对大岩桐SsPIN2基因进行了克隆,获得898bp的基因序列,经BLAST比对,采用邻接法构建进化树;并利用半定量RT-PCR方法,研究了SsPIN2基因在大岩桐叶、茎尖、根、茎、花瓣和花萼组织的表达情况。结果表明:大岩桐SsPIN2基因与黄瓜CsPIN2、豌豆PsPIN2基因等亲缘关系较近;该基因在上述6种组织中均有表达组织,其中在茎尖、根、茎和花萼的表达量较高,在叶和花瓣中的表达量较低。     

苦瓜BAG基因组织特异性表达研究

 实时荧光定量RT-PCR分析表明: 苦瓜BAG基因仅在心皮、雄蕊、花萼和幼果中表达, 花瓣中没有表达。心皮中表达水平远远高于其它组织, 为雄蕊的77倍之多; 在幼果、雄蕊和花萼中有低水平的表达。因此BAG基因直接参与苦瓜花和果实发育, 尤其对心皮的发育起着关键的作用。     

牡丹切花ERF转录因子基因的分离与表达分析

利用已获得的‘洛阳红’牡丹花瓣转录组数据库,筛选得到3个与植物乙烯响应因子ERF蛋白同源性较高的Unigene序列,利用RACE及RT-PCR技术,设计特异性引物对3个ERF基因最大阅读框进行扩增并测序。生物信息学分析表明PsERF1、PsERF2和PsERF3分别含有长为1 158、747和609 bp的开放阅读框,编码383、248和202个氨基酸残基,且均含有1个典型的AP2结构域。进化分析表明3个牡丹ERF转录因子分别属于ERF亚家族的B2组、B1组和B3组。利用实时定量PCR分析了3个ERF基因在牡丹乙烯敏感型品种‘洛阳红’和乙烯不敏感型品种‘雪映桃花’不同花器官（花瓣、雄蕊、雌蕊和萼片）以及不同发育级别切花花瓣中的表达情况。结果表明,PsERF1在2个品种花瓣中的表达量显著高于其他花器官,其表达量在‘洛阳红’切花发育过程中逐渐增加,而在‘雪映桃花’切花发育过程中逐渐降低,推测PsERF1可能对牡丹切花的乙烯响应具有重要的调控作用,PsERF2和PsERF3则可能同时参与了多种信号途径。     

洋葱花发育B类MADS-box基因AcDEF的克隆与表达分析

 以紫皮洋葱常规品种‘RUPI’为试材,通过RACE方法克隆了AP3/DEF同源基因AcDEF,并用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR研究AcDEF在洋葱各类器官中的表达模式。GenBank登录号为JX661502的AcDEF基因长1 014 bp,开放阅读框长度为675 bp,编码224个氨基酸。系统发育分析表明,AcDEF基因属于单子叶B功能基因家族的AP3/DEF亚家族。表达模式分析显示,AcDEF在花器官中特异表达,其中在花瓣、雄蕊内高丰度表达,在花葶和膜状总苞中微量表达,在心皮中表达水平极低,在无性营养器官如根、假茎、叶片和鳞茎中无表达。在开花过程中,各花器官中AcDEF转录物的积累呈动态变化;在花瓣和雄蕊发育过程中AcDEF均高丰度表达,但在完全开放花的花瓣和雄蕊中表达量略有降低;在花葶、膜状总苞和心皮中表达量递减,在完全开放花的膜状总苞和心皮中AcDEFAcDEF基因的序列结构和表达模式具有单子叶物种AP3/DEF基因的特征,属于paleoAP3进化系。的表达量很低。     

板栗雌雄花发育相关的MADS-box基因发掘与表达分析

为筛选板栗混合花序中雌雄花形成与发育关键基因,基于板栗雌雄花表达谱测序结果,从差异表达基因中分离到17个MADS-box基因。通过序列结构分析,发现其中2个基因缺少半保守的K盒,为Ⅰ型MADS-box基因,另外15个基因为Ⅱ型MADS-box基因。系统进化关系分析显示,13个包含完整读码框的MADS-box基因中有2个B类基因,1个C/D类基因和3个E类基因。荧光定量PCR结果证实这些MADS-box基因在板栗早期混合花序中的雌雄花之间表达差异显著（变化倍数 > 2）,且部分B、C/D和E类基因在板栗幼叶、纯雄花和雌花中的表达变化趋势相似,推测这些MADS-box基因在板栗雌雄花形成和发育中起重要调控作用。     

Production of intraspecific hybrids between wild-type and petaloid-sepal cultivars in Habenaria radiata

Orchids are commercially important plants with flowers that are unique and very specialized in shape and color. The flowers consist mostly of sepals, lateral petals, lip (labellum) and column, and are zygomorphic and resupinate. Whereas most orchid species have petaloid tepals in the first and second whorls, Habenaria radiata has a flower with greenish sepals and white lateral petals and lip. ‘Hishou’, one of the cultivars of H. radiata, is a floral homeotic mutant and has a petaloid median sepal and lip-like lateral sepals in the first whorl. Additionally, this cultivar often has non-resupinate flowers whereas wild-type H. radiata flowers are resupinate. In the present study, we investigated the genetic inheritance of these characters in the ‘Hishou’ cultivar by crossing it with wild-type plants. Some intraspecific hybrids, which were confirmed by PCR-RFLP analysis, had flowers with a petaloid median sepal and lip-like lateral sepals in the first whorl, indicating that these were dominant characters. Since the remainder of the intraspecific hybrids had wild-type flowers, these characters must be heterozygous in ‘Hishou’ plants. Although ‘Hishou’ plants had non-resupinate flowers, intraspecific hybrid flowers were resupinate, even though they had the petaloid median sepal and lip-like lateral sepals. This result indicates that non-resupination must be a recessive character. Since sepal-petalization and triple lip characters of ‘Hishou’ inherited dominantly, these characters can be utilized for the breeding of Habenaria species by intra- and interspecific crosses.     

蝴蝶兰PhSVP的克隆及其在花发育过程中的表达分析

从蝴蝶兰杂交品种‘大辣椒’中克隆到SVP同源MADS-box基因PhSVP，使用RACE方法获得PhSVP全长，其开放阅读框为687 bp，编码228个氨基酸。蛋白序列多重比对表明PhSVP蛋白包含一个高度保守的MEF2-like MADS结构域和一个中度保守的K-box结构域，且与兰科的SVP/AGL24同源蛋白相似度高，进化树分析也表明PhSVP蛋白与其他兰科植物的SVP/AGL24同源蛋白亲缘关系最近。PhSVP的空间表达模式表明其在营养器官表达量高，在萼片、侧瓣和唇瓣等生殖器官表达量低。进一步对PhSVP在成花转换和花发育过程中花序顶端的表达进行分析，表明PhSVP的转录水平在营养分生组织向花序分生组织过渡的过程中无显著变化，仅在花序分生组织阶段有少量上升，但在花发育早期花分生组织阶段中的表达水平显著升高，而在花发育后期的萼片原基、花瓣原基和合蕊柱原基阶段持续下降。此外还发现A类基因PhAP1在花发育过程中的花序顶端的表达模式与PhSVP相似，而B类基因PhPI和C类基因PhAG在花瓣原基和合蕊柱原基阶段的表达量最高。检测了PhSVP在抽葶期、花蕾期和盛花期的根、叶和花葶中的转录水平，结果表明PhSVP在花蕾期的根中的表达量稍高于其他时期，在不同阶段的叶中的表达水平无显著差异，而在抽葶期花葶中的表达量显著高于花蕾期和盛花期。试验结果暗示蝴蝶兰PhSVP可能起到调控花分生组织状态的维持、避免花器官原基过早分化的作用。     

凤仙花花逆转突变体的组织学研究

从经过卫星搭载的凤仙花种子后代中获得了可遗传的仅顶花叶化的花逆转突变体。该突变体保持了花的基本结构,但是不同程度地出现了花瓣增厚、变绿、出现锯齿等现象,雄蕊也片状化、早衰或完全消失。组织学观察发现,在叶化花瓣中出现了叶绿体和栅栏组织。统计分析结果表明,叶化花瓣与正常花瓣相比组织结构上确实发生了显著变化。     

大蒜MADS-box基因AsPI的克隆及表达分析

B类MADS-box基因在调控显花植物的花瓣和雄蕊发育过程中发挥关键作用。为初步了解大蒜花发育的分子机制,以‘阿城紫皮’大蒜(Allium sativum)的花蕾为试材克隆了AsPI(Gen Bank登录号为KY272748)。AsPI的cDNA长939 bp,开放阅读框为615 bp,编码204个氨基酸。推导的氨基酸序列显示,AsPI编码的蛋白质包含高度保守的MADS结构域(1~57氨基酸)和保守的K结构(76~140氨基酸),AsPI蛋白具有PI亚家族特有的序列特征:MADS区特征丝氨酸残基、K区高度保守序列KHExL以及C–末端的PI基序。序列比对、功能域分析及系统发育分析结果表明,AsPI属于单子叶植物B功能基因PI亚家族。半定量和实时RT-PCR检测AsPI在大蒜不同组织器官中的表达模式,结果表明,在花蕾中高丰度表达,在花茎中表达量中等,在根、假茎、嫩叶、保护叶等营养器官中表达量极低甚至不表达。     

月季花瓣特异表达启动子的筛选和鉴定

以月季品种‘萨曼莎’（Rosa hybrida‘Samantha’）为试验材料，选取了13个花色、花香相关的基因，研究其在根、茎、叶和花等器官中的表达规律及其启动子活性。结果表明，RhOOMT2（Rosa hybrida orcinol o-methyltransferase 2）和RhCCD4（Rosa hybrida carotenoid cleavage dioxygenase 4）在花瓣中具有相对较高的表达量，RhNUDX1（Rosa hybrida nudix hydrolase 1）在根部表达量最高，花瓣中其次，在茎和叶中几乎没有表达，另外10个类黄酮代谢途径相关基因在各器官中表达差异较小。使用FPNI-PCR的方法克隆到ATG上游1 601 bp的RhOOMT2启动子、1 539 bp的RhCCD4启动子和1 433 bp的RhNUDX1启动子。将携带RhOOMT2、RhCCD4和RhNUDX1启动子的PBI121载体通过农杆菌的介导，在月季‘Samantha’、洋桔梗（Eustoma grandiflorum‘Green Pelleted’）和百合（Lillium Oriental hybrida‘Siberia’）花瓣中进行瞬时表达，GUS染色结果表明，与阳性对照35S启动子相比，RhOOMT2启动子在月季、洋桔梗和百合花瓣中具有更强的活性，RhCCD4启动子在百合花瓣中具有较弱的活性，而在月季和洋桔梗中活性很弱，RhNUDX1启动子则在3种花中均无活性。进一步在4个月季品种‘萨曼莎’、‘戴安娜’、‘香槟月季’和‘雪山’中比较了RhOOMT2和35S的启动子活性，证实了在花瓣中RhOOMT2启动子具有比35S更高的活性。