河北部分地区狐狸源肺炎克雷伯菌血清型鉴定、毒力基因及致病性检测

为分析河北部分地区狐狸源肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的荚膜血清型、毒力基因流行情况及致病性,从河北地区养殖场中采集患病狐狸肺脏、心血、肝脏等病料组织217份,分离得到63株致病性肺炎克雷伯菌。采用PCR法分别检测63株肺炎克雷伯菌荚膜血清型及19种毒力基因;通过人工感染小鼠致病试验验证4株优势血清型流行株的半数致死量(LD_(50))。结果显示,63株肺炎克雷伯菌中23株为K2血清型,7株为K20血清型。63株肺炎克雷伯菌携带13种毒力基因,毒力基因fimH、mrkD、wabG、uge、ybt、ybtA、alls、ompK35等检出率均在58.73%以上,其他毒力基因检测率较低;分离菌株呈现多重毒力基因型,同时携带9种毒力基因的菌株最多,占致病性菌株的33.33%。优势血清型流行株KD1(K20)和KD45(K2)的致病性最强,其LD_(50)分别为3.16×10~5,3.16×10~6 CFU/mL。本研究为该地区肺炎克雷伯菌病的防控提供参考。     

水貂绿脓杆菌分离株的生物学特性和血清型分析

为了解国内水貂出血性肺炎病原绿脓杆菌的生物学特性和血清型分布,2002—2010年间从国内5个省水貂养殖场暴发出血性肺炎的水貂肺中分离获得45株绿脓杆菌,测定了分离株的生化特性、血清型、抗生素敏感性和对小鼠和水貂的半数致死量(LD50)。结果表明:分离菌株的主要生化指标除甘露醇和ONPG与人医临床分离株的不同外,其余均与绿脓杆菌的生理生化特性相同。45株菌共分为3种血清型:G型(42/45),B型(2/45)和I型(1/45),此结果与国外近几十年流行的水貂出血性肺炎和人医临床分离的绿脓杆菌主要流行血清型相同。45株菌对5种抗生素均较敏感,敏感性与分离的年份和菌株的血清型无关系。经动物试验证明,所选的4株菌毒力均不同,2株B型菌株毒力均较G型弱,4菌株对水貂的毒力均强于对小鼠的毒力,说明菌株对水貂较易感。     

血清C型水貂绿脓杆菌的分离鉴定

为确诊引起水貂死亡的主要细菌性病原,对采集的病料进行细菌分离和培养,分离出3株菌。通过对分离株的形态、生化和培养特性研究,分子生物学和血清型鉴定,并对其中一分离菌株生长曲线、毒力和免疫原性进行测定。结果表明,分离株均为血清C型水貂源绿脓杆菌;分离株16S r RNA基因序列与已知的绿脓杆菌相应序列同源性为99.7%~99.98%不等;生长曲线结果表明,C型绿脓杆菌4~14 h为对数生长期;对小鼠的半数致死量(LD_(50))为8.11×105 CFU;制备的单价疫苗对小鼠的免疫原性良好,攻毒保护率为100%,对照组小鼠全部死亡。     

四川省山羊源沙门菌血清型鉴定及毒力基因的分布

调查四川省山羊源沙门菌血清型及部分毒力基因的分布及其致病性,为食品安全控制提供参考。采用沙门菌单因子血清对42株山羊源沙门菌血清型进行鉴定,并用PCR检测其携带invA、sopE、orgA、avrA、ttrB、sseL、rhuM、mgtC、orfL、sopB、pipD、sodC1、lpfC、pefA、spvC等15个毒力基因的情况;根据血清型和毒力基因的携带情况选取山羊源沙门菌菌株,采用灌胃法对BALB/c小鼠进行攻毒试验。血清学鉴定结果显示,23株为布利丹沙门菌、15株为肠炎沙门菌、3株为阿贡纳沙门菌、1株为纽波特沙门菌;PCR检测结果显示,42株沙门菌均携带invA、orgA、pipD、sopB、lpfC5种毒力基因,sopE、sseL、ttrB、rhuM、sodC1、pefA、spvC、avrA、mgtC、orfL的携带率分别为97.6%、97.6%、88.1%、95.2%、92.9%、47.6%、47.6%、40.5%、40.5%、38.1%;每个菌株携带6~15种毒力基因,且发现有2株阿贡纳沙门菌携带毒力质粒;携带15个毒力基因的2株布利丹沙门菌、2株肠炎沙门菌和2株阿贡纳沙门菌均在5×108 CFU剂量下致死全部未经抗生素处理的小鼠,其中肠炎沙门菌SWUN3816对小鼠的LD50为1.6×102 CFU。综上可见,布利丹沙门菌和肠炎沙门菌是四川省山羊源沙门菌的优势血清型,首次发现阿贡纳沙门菌携带毒力质粒。     

华南地区两株副猪嗜血杆菌的生物学特性与致病性研究

本试验旨在对来源于广东省的两株副猪嗜血杆菌的生化特性、血清型、耐药性、生长特性以及毒力和免疫原性进行研究。试验结果表明,两株菌分别为血清4型和5型;两株菌均具有较好的生长能力,培养10 h活菌含量都能达到10⁹以上;其LD₅₀分别是1.52×10⁹ CFU和9.3×10⁸ CFU;分离菌株对喹诺酮类和磺胺类抗生素有较强的抵抗力;免疫试验结果表明,两株菌具有较好的免疫原性。以上试验结果表明,这两株菌可以作为疫苗的基础候选菌株。     

腹泻水貂检出携带耶尔森菌HPI毒力岛的大肠杆菌

为了解大肠杆菌引起水貂腹泻的机理,进行了小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因的检测,并对其菌株做毒力试验。用PCR扩增法检测毒力岛基因irp2和fyua,小鼠腹腔注射检测菌株毒力。结果：从3个貂场腹泻病死水貂脏器以及粪便中分离出血清型分别为078、029和038的大肠杆菌,对3个血清型大肠杆菌进行毒力岛检测,均检出携带小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因irp2和fyua。3个血清型078、029和038的大肠杆菌均使小鼠发病死亡。结果表明水貂腹泻是由携带小肠结肠炎耶尔森茵HPI毒力岛基因irp2和fyua的大肠杆菌引起,该茵对水貂的健康具有潜在的威胁。     

副猪嗜血杆菌国内流行血清型菌株的生物学特性比较研究

本研究对我国最流行的HPS血清4、5、12、13和14型共16株细菌的菌体形态、生长速度、生化特性、小鼠毒力等生物学特性进行了比较研究。革兰染色镜检结果表明,除4型菌株H4L3外,同一血清型HPS的菌体形态比较一致;不同血清型HPS的菌体形态具有明显差异,且具有型特异性。培养结果表明,在TSA固体培养基上生长24h后的菌落平均直径大小依次为13型2.02mm、4型1.91mm、5型1.80mm、14型1.71mm、12型1.66mm,同一血清型的不同菌株之间无显著差别。生化试验结果表明不同血清型HPS的生化反应存在明显差异,即使是同一血清型的不同菌株之间也有较大差别。小鼠毒力试验结果表明,除4型外,毒力强弱依次为血清12型、14型、5型、13型,其LD50分别介于(2.7⁴.6)×108、(4.34.6)×108、(4.3⁷.9)×108、(1.07.9)×108、(1.0¹.3)×109、(2.31.3)×109、(2.3².8)×109 CFU之间,同一血清型的不同菌株之间无显著差别。在血清4型菌株中,H4L3的毒力明显偏强(LD50为3.6×108 CFU),其他菌株的LD50介于(1.42.8)×109 CFU之间,同一血清型的不同菌株之间无显著差别。在血清4型菌株中,H4L3的毒力明显偏强(LD50为3.6×108 CFU),其他菌株的LD50介于(1.4¹.6)×109 CFU之间。本研究为HPS不同血清型的快速鉴定、致病机理和疫苗研发等提供了理论依据。     

貂源肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定

2013~2016年山东省、河北省、黑龙江省、吉林省的部分水貂养殖场发生了严重的出血性肺炎,导致水貂大量死亡,为了客观评估水貂出血性肺炎的危害及为综合防控提供参考依据,试验对423个水貂病例样本进行分离鉴定并且对所分离的细菌进行了形态特征观察、16SrRNA基因测序、血清型鉴定、小鼠毒力试验测定、生化试验鉴定及药敏试验测定。结果表明:423个样本中分离到68株肺炎克雷伯氏菌,其中最为流行的血清型为K2型(35株);并筛选出4株菌株对小鼠有很强毒力性;生化试验结果表明同一血清型的不同菌株之间也存在明显差异;药敏试验结果表明,4株K2型肺炎克雷伯氏菌强毒菌株对氧氟沙星、阿米卡星2种抗生素均为敏感或介于中间;对强力霉素、环丙沙星等8种抗生素均耐药;对诺氟沙星、庆大霉素等4种抗生素均为耐药或介于中间。     

副猪嗜血杆菌小鼠毒力和仔猪毒力的相关性分析

旨在对我国最为流行的血清4、5、12和13型副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)(共36株)进行BALB/c小鼠和仔猪毒力试验的比较研究。小鼠毒力试验结果表明,4种血清型菌株的LD_(50)分别介于9.80×10~7～4.60×10~9、2.10×10~8～8.85×10~9、4.81×10~7～7.01×10~9和1.75×10~8～8.45×10~8 CFU;整体毒力表现强弱依次是13、4、12、5型,但仅在5型与13型菌株之间毒力具有显著差异(P0.05)。仔猪毒力试验结果表明,同一血清型中不同菌株的毒力具有明显差异,均存在强毒和弱毒菌株;整体毒力表现强弱依次是5、13、4、12型;但5型与4型(P=0.039)和12型(P=0.033)之间具有显著差异(P0.05),与13型差异不显著(P=0.241)。综合对比分析HPS的小鼠和仔猪毒力试验结果,可以得出3个结论:1)4种国内流行性血清型菌株的整体毒力由强到弱依次是5、13、4和12型;2)但同一血清型中均存在强毒和弱毒菌株,HPS的血清型与其毒力之间不具有相关性;3)HPS虽能致死BALB/c小鼠,但其毒力结果与仔猪毒力试验结果并不一致,表明其作为替代模型具有一定的缺陷。     

鸡致病性E.coli地方株血清型的鉴定、毒力基因及致病性检测

为了研究河北秦皇岛地区鸡致病性大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)地方流行株的优势血清型、毒力基因和致病性,本研究采用常规鉴定方法和16SrRNA PCR方法,从采集自河北秦皇岛地区不同养鸡场的83份病鸡组织中分离鉴定出56株E.coli。人工感染1日龄雏鸡试验表明,46株分离株为致病性E.coli。采用玻片凝集试验、PCR方法分别测定致病性E.coli分离株的血清型分布和16种毒力基因携带情况。结果显示,定型的42株致病性E.coli分离株包括11种血清型,以O7 8、O89、O142及O1为优势血清型;46株致病性E.coli分离株中以irp2、fuyA、ompT、Iss a、iutA、iroN和hlyF毒力基因检出率较高,在89.1%~100.0%,其他毒力基因检出率为22.0%~72.0%。选择优势血清型代表株QH1(O78)、QH1(O89)、QH1(O142)和QH1(O1)人工感染1日龄雏鸡,计算半数致死量(LD50),确定其致病性。结果表明,QH1(O78)株致病性最强,对1日龄雏鸡的LD50为3.16×106 CFU/mL;对14,49日龄雏鸡的LD50分别为1.07×107,5×108 CFU/mL。本研究为河北秦皇岛地区鸡致病性E.coli地方流行株防控提供试验依据。     

牛支原体P48蛋白及其片段的表达、纯化及间接ELISA检测方法的建立

为了建立一种快速、特异、敏感的检测牛支原体血清抗体的方法,对牛支原体(M.bovis)P48膜蛋白基因进行密码子优化,并在编码基因两端加入酶切位点。利用生物学软件对P48蛋白进行抗原位点和亲水性分析,选择P48蛋白的主要抗原表位区和亲水性区域以及全基因进行原核表达。采用SDS-PAGE和Western blot对重组蛋白进行鉴定及反应原性分析。结果显示,表达的P48全蛋白、28～185、221～455位氨基酸区域蛋白均能与牛支原体阳性血清发生特异性反应,P48(221～455)效果最好。采用Ni-NTA对目的蛋白进行纯化,并基于纯化的P48(221～455)蛋白建立了一种间接ELISA检测方法。该方法组内及组间变异系数均小于7%,重复性较好。临床样本检测结果表明,建立的检测方法符合率较高。     

狐狸源肺炎克雷伯菌的分离鉴定及毒力检测

从濒死期蓝狐肺脏中分离到1株革兰阴性短杆菌,并对分离菌株进行形态学观察、16S rRNA鉴定、全自动细菌生化鉴定仪鉴定及khe基因鉴定,在此基础上,完成了分离菌株的分型、人工感染小鼠试验、药敏试验及毒力基因检测等。最终鉴定结果显示,该分离菌株为K20型肺炎克雷伯菌,命名为SWKp17;同时,Vitek细菌鉴定仪鉴定该菌为肺炎克雷伯菌。人工感染试验和药敏试验结果表明,该细菌有致病性和多重耐药性。其对小鼠的半数致死量(LD₅₀)为2.9×10~7 CFU;对三代头孢菌素类、氯霉素类、喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类、磺胺类耐药,但对亚胺培南和多黏菌素敏感。该菌株具有fim、ureA、mrkD及wabG毒力基因,但不具有rmpA、kfu、alls、iroNB、ybtA、uge、iucB等毒力基因。结果表明,引起本次狐狸肺炎的致病菌为非K1、K2、K3、K5、K20、K54及K57型肺炎克雷伯菌,本研究为临床治疗由该菌引起的狐狸肺炎提供参考依据。     

基于丝状支原体丝状亚种P35反应原性的验证及其间接ELISA方法的建立

为建立检测丝状支原体丝状亚种(Mmm)的间接ELISA方法,本研究利用生物信息学软件对Mmm的全基因组序列进行了分析,选定大小为540bp的0584基因,该基因是编码分子量为35ku的脂蛋白,并对其免疫反应原性进行研究。利用原核表达系统获得了0584基因的重组蛋白rP35,以牛传染性胸膜肺炎(CBPP)阳性血清为一抗进行western blot分析,试验结果为阴性,但Dot-blot试验结果为阳性,证明该蛋白可能是Mmm特有的一种构象依赖性免疫相关蛋白且具有反应原性。以rP35蛋白为包被抗原,通过反应条件优化初步建立了检测CBPP血清抗体的间接ELISA方法,特异性为88.0%,敏感性为89.8%,批内和批间变异系数均小于10%,与商品化试剂盒符合率为84.8%。本研究为研制CBPP血清检测试剂盒提供了一种候选蛋白。     

包虫病的流行危害和防控技术

包虫病是一种危害十分严重的人畜共患寄生虫病。尽管经过多年来的大力防控使该病已经得到有效控制,但是,在草食家畜养殖区,该病流行仍然还较为严重.随着我国人口老龄化伴发伴侣动物饲养量的增加,流浪犬在城镇成为包虫的潜在主要终末宿主,是需要密切关注的主要流行因素之一。因此,有必要就包虫病的流行、危害、致病机制和综合防治技术等再做宣传普及。     

氨基葡萄糖调控仔猪初生重和均匀度的应用及机理

养猪生产中产(活)仔数和胎儿初生重是影响母猪繁殖生产效率的主要因素,但产仔数和初生重呈负相关关系,近年来母猪繁殖生产的研究重点之一便是如何提高仔猪初生重并降低初生重变异。氨基葡萄糖是一种饲料原料,其制作原料广泛存在于自然界中,近期研究发现氨基葡萄糖应用于母猪妊娠后期可调控仔猪的胎盘发育和初生重。文章介绍了近年来有关氨基酸和蛋白质、能量、功能性添加剂在调控仔猪初生重和均匀度中的应用及其效果,简述了氨基葡萄糖的性质、来源及合成方法,重点阐述了母猪妊娠后期使用氨基葡萄糖在维持胎儿果糖浓度稳定、促进母猪胎盘发育和改善胎盘功能等方面的效果,分析了氨基葡萄糖通过促进胎盘基质和胎褶双分子层发育、刺激胎盘滋养层细胞增殖、增强胎盘功能等途径调控胎盘发育、仔猪初生重和均匀度可能的机理;提出了氨基葡萄糖在调控仔猪初生重和均匀度方面未来的研究方向,以期为在生产实践中调控仔猪初生重和均匀度提供理论参考和实践依据。     

层积、激素和光照对千屈菜种子萌发的影响

本实验通过对千屈菜（Lythrum chiesas L.）种子进行冷层积处理、改变日光照时数以及使用不同浓度的赤霉素、细胞分裂素溶液浸泡种子,通过测定种子的发芽率、发芽势,研究以上因素对种子萌发的影响。结果表明：冷层积对种子萌发的影响不显著,在24 h光照时分别使用100 mg·L^-1,200 mg·L^-1,300 mg·L^-1浓度的赤霉素、细胞分裂素溶液浸泡对种子的萌发均有不同程度的影响,且以光照24 h、使用200 mg·L^-1的赤霉素溶液浸泡种子为最佳处理方法。在16 h光照时,用100 mg·L^-1,200 mg·L^-1,300 mg·L^-1浓度的赤霉素、细胞分裂素溶液浸泡均对种子萌发影响不显著。可得出千屈菜种子对激素刺激、光照刺激敏感,对冷层积刺激不敏感的结论。     

华支睾吸虫病在我国的流行及诊断方法研究进展

华支睾吸虫病是由华支睾吸虫引起的危害严重的鱼源性人兽共患寄生虫病,主要引起人和多种动物的肝胆病变,严重者可引起胆管上皮癌,因此华支睾吸虫被国际癌症署(IARC)归为第Ⅰ类生物性致癌因子。我国华支睾吸虫病主要流行于淡水资源丰富的地区,在我国27个省、市、自治区均有该病人体感染的报道。近年来,我国华支睾吸虫感染率呈上升趋势,且受威胁地区和人数不断增加。对该病的诊断和防控已刻不容缓,传统的病原学诊断方法存在着一定的局限性和弊端。免疫学方法和分子生物学技术的不断发展为该病的诊断提供了新的途径,今后在华支睾吸虫病的基础研究与防控中起到更加重要的作用。论文就华支睾吸虫病的流行特点及诊断方法研究进展进行综述,以期为华支睾吸虫病的研究提供参考。     

伪狂犬病病毒UL56蛋白与宿主蛋白Nedd4相互作用的研究

伪狂犬病病毒(PRV)UL56蛋白(pUL56)属于Ⅱ型膜蛋白。近期研究结果表明PRVpUL56与PRV对啮齿动物的致病性相关。为揭示PRVpUL56与宿主相互作用的分子基础,本研究通过免疫共沉淀(Co-IP)试验确定了pUL56与神经前体细胞表达的发育下调蛋白4(Nedd4)存在相互作用。进一步,利用激光共聚焦试验确定过表达pUL56与Nedd4在转染HEK293T细胞的高尔基体存在共定位。通过互作,pUL56可以将细胞质分布的Nedd4重新定位于高尔基体。前期研究表明,含有WW结构域的宿主蛋白可以与含有PPxY(PY)基序的病毒蛋白互作。因此,本研究构建了pUL56PY基序丙氨酸突变体(PPxY/AAxY),利用Co-IP试验对pUL56突变体和Nedd4相互作用进行验证,结果表明随着pUL56PY基序突变的增加,蛋白互作能力逐渐减弱。此外,pUL56通过其PY基序显著下调Nedd4的表达。这些结果证实了PRVpUL56与Nedd4主要通过WW结构域/PY基序模式发挥相互作用,并下调Nedd4的表达。因此,本研究为阐明PRVpUL56与宿主相互作用的分子机制提供了参考依据。     

云南半细毛羊6种蛋白质饲料的可消化粗蛋白质和有效能的评价

本试验旨在利用概略养分分析法测定半细毛羊6种蛋白质饲料原料[豆粕、干酒糟及其可溶物(DDGS)、棉籽粕、膨化大豆、玉米蛋白粉和菜籽粕]的营养成分含量,并通过消化代谢试验结合套算法实测饲料原料的可消化粗蛋白质(DCP)含量和有效能值。试验选取16只体重为(56.05±5.47) kg的云南半细毛羊,采用完全随机设计,平均分为4组,每组4只。试验共2期,共7个饲粮,包含1个基础饲粮和6个试验饲粮。第1期饲喂4种饲粮,第2期饲喂3种饲粮。试验期10 d,其中预试期5 d,正试期5 d。结果表明:1)玉米蛋白粉的粗蛋白质(CP)含量最高,为65.77%,棉籽粕和豆粕的CP含量为50%左右,膨化大豆和菜籽粕的CP含量为37%左右,DDGS的CP含量最低,为25.93%。菜籽粕和膨化大豆的粗纤维(CF)含量较高,为16%左右,DDGS和棉籽粕的CF含量为11%左右,豆粕和玉米蛋白粉的CF含量较低,均在6%以下。2)各种蛋白质饲料原料的DCP含量之间差异显著(P <0. 05),其中玉米蛋白粉的DCP含量最高,为581. 79 g/kg,其次是棉籽粕、豆粕、膨化大豆和菜籽粕,DDGS的DCP含量最低,为211.48 g/kg。膨化大豆的消化能(DE)和代谢能(M E)最高,分别为21.54和19.79 M J/kg,其次是玉米蛋白粉、豆粕、棉籽粕和菜籽粕,DDGS的DE和ME最低,分别为14.62和12.45 MJ/kg。棉籽粕、菜籽粕和DDGS的有效能之间差异不显著(P>0.05)。综上所述,从营养成分含量上看,玉米蛋白粉品质最好,其次是豆粕、棉籽粕、膨化大豆、菜籽粕和DDGS。从DCP品质来说,玉米蛋白粉的品质最优,依次高于棉籽粕、豆粕、膨化大豆、菜籽粕和DDGS。从有效能值来说,膨化大豆最优,依次高于玉米蛋白粉、豆粕、棉籽粕、菜籽粕和DDGS。     

病原菌分子生物学诊断技术及其在奶牛子宫内膜炎诊断中的应用进展

子宫内膜炎(Endometritis)是奶牛常见的生殖系统疾病,影响奶牛的生产性能,给奶牛养殖业带来了巨大的经济损失。奶牛子宫内膜炎多由病原菌混合感染,若能及时、准确地检测出致病菌,对该病的综合防控至关重要。目前,奶牛子宫内膜炎病原菌诊断技术的相关报道甚少,为进一步研究开发奶牛子宫内膜炎病原菌诊断技术,论文对目前应用于其诊断的PCR技术、环介导等温扩增(LAMP)技术、基因芯片技术等的研究进展进行了综述,并对其应用情况和优缺点进行了分析与总结,以期为奶牛子宫内膜炎病原菌诊断技术研究提供参考。