桃生长素反应因子和生长素/吲哚乙酸蛋白家族基因的克隆及表达分析

生长素对果实发育起着重要的调控作用。生长素反应因子（auxin response factor,ARF）和生长素/吲哚乙酸蛋白（auxin/indoleacetic acids protein,Aux/IAA）是生长素信号转导系统中的两个关键因子,在转录水平上对生长素参与的生理活动进行调控。为探索生长素调控桃果实发育的机制,选取ARF家族的1 个基因PpARF1,Aux/IAA 家族的5 个基因PpIAA3、PpIAA9、PpIAA17、PpIAA26 和PpIAA29,克隆其全长cDNA 序列并进行生物信息学分析,对它们在桃果实不同发育时期中果皮和种子的表达进行qRT-PCR 检测。序列分析表明：这6 个基因的编码区全长分别为2 037、594、1 194、618、384 和723 bp,分别编码678、197、397、205、127 和240 个氨基酸;氨基酸序列比对分析显示桃PpARF1 蛋白序列和草莓的FvARF1（XP_004300014.1）同源性最高,达到90.56%,PpIAA 家族的5 个蛋白同源性很低,只有23.77%;荧光定量PCR 结果显示,在花后52 d（果实发育硬核期）,PpIAA3 和PpIAA17 在中果皮中的表达量显著升高;PpIAA26、PpIAA29 和PpARF1 在种子中的表达量显著升高。预示生长素可能在桃果实发育硬核期发挥着重要的调控作用。     

桃Aux/IAA家族基因鉴定及在果实成熟过程中的表达分析

通过生物信息学鉴定桃基因组中生长素/吲哚乙酸(Aux/IAA)基因家族,并对其在溶质型和硬质型桃果实成熟阶段的表达水平进行q RT-PCR检测。结果表明:桃Aux/IAA基因家族包含22个成员,这些基因集中分布在5条染色体上,以第1条染色体上含有最多,为8个。大部分Aux/IAA基因包含高度保守的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ功能域,聚类分析表明其分为10类。基因结构分析显示这些基因包含2~5个外显子。荧光定量PCR分析表明10个Aux/IAA基因在溶质型桃果实的表达量高于对应时期硬质型桃果实,其中5个基因随着溶质型桃果实的成熟上调表达,特别是ppa010303m、ppa010871m和ppa020369m。试验结果表明桃Aux/IAA家族成员在结构上高度保守,其中多个成员(尤其是ppa010303m、ppa010871m和ppa020369m等)可能参与调控桃果实的成熟。     

番茄LemiR390及其预测靶基因LeTAS3的鉴定与表达分析

以番茄（Lycopersicon esculentum）紫色花青素积累品系Aft基因型‘LA1996’为试验材料,以番茄总RNA反转录的cDNA文库为模板,根据mirbase数据库中MIR390基因和番茄unigene数据库预测到的靶基因序列,克隆番茄LemiR390前体基因及其预测靶基因LeTAS3;采用定量PCR技术检测LemiR390及其预测靶基因LeTAS3在番茄果实不同发育阶段的表达情况,利用RLM 5′RACE技术验证LemiR390对靶基因mRNA的剪切作用。结果表明,克隆到两个LemiR390的前体,分别与MIR390a和MIR390b一致,含有完整的茎环结构。LemiR390与其靶基因LeTAS3在番茄果实不同发育时期表达量不同,果实发育前期特别是花后1 ~ 2周幼果期表达量高,发育后期均下降为微量表达,并且在幼果期LemiR390与LeTAS3表达呈负调控关系。LemiR390能够靶作用于LeTAS3的转录本调控其降解,其剪切位点为LemiR390序列5′端的第10位碱基。     

苹果MdDRB1基因在番茄中异位表达与功能研究

【目的】将苹果Md DRB1基因转入番茄中,探究苹果MdDRB1基因在番茄中的异位表达与功能。【方法】采用农杆菌介导法,将苹果基因Md DRB1转入番茄植物体内,用PCR检测到该基因已整合到番茄总DNA中。对获得的5个转基因番茄株系进行半定量RT-PCR分析,挑选MdDRB1基因表达水平由低到高的3个株系,用实时荧光定量PCR检测与生长素有关的mi RNAs及相应靶基因的相对表达量。并对非转基因和转基因番茄进行3μmol·L-1IAA和5μmol·L-1IAA处理,对植株进行向光性检测。【结果】转基因株系中miR164、miR160、mi R393表达量下调,mi R167表达量上调,同时,它们分别对应的番茄中的靶基因SlNAC1、SlARF10和SlARF16、SlTIR1的相对表达量上调,SlARF8相对表达量下调。IAA处理后,转基因株系幼苗的侧根数目比未转基因植株增多,同时,转基因株系幼苗的向光性也增强。【结论】苹果Md DRB1基因在番茄中的异位表达,通过抑制生长素响应相关的mi R164、miR160、miR393和增加miR167的积累水平,部分解除其对下游靶基因SlNAC1、SlARF10和Sl ARF16、SlTIR1以及增加Sl ARF8的转录后基因沉默作用,进而提高了转基因番茄对生长素响应的敏感性。     

龙眼miR397家族成员分子特性及其在体胚发生早期的表达分析

【目的】探讨龙眼miR397家族成员的分子特性及其在龙眼体胚发生早期的表达模式。【方法】以‘红核子’龙眼胚性愈伤组织为材料,通过对龙眼miR397前体序列二级结构分析、进化树构建、靶基因预测与裂解位点验证、以及龙眼miR397a在龙眼体胚发育早期和不同激素浓度处理下的表达规律进行分析。【结果】龙眼miR397前体序列5端臂上可生成两个序列高度重合的成熟体序列dlo-miR397a和dlo-miR397,二者仅有5端两个碱基TC之间的差异,前体能形成稳定的茎环结构;进化树分析发现龙眼miR397前体与桃、可可、脐橙等亲缘关系较近,处于同一分支,龙眼miR397与拟南芥、甜橙、葡萄等亲缘关系较近,处于较为保守的同一分支,miR397家族成员较前体序列在进化上更为保守。靶基因预测表明龙眼miR397家族主要靶向调控漆酶基因家族和一条姐妹染色单体粘连蛋白(dlo_039206.1)。裂解位点验证发现靶基因姐妹染色单体粘连蛋白的裂解位点,但位于预测区间外。miR397a在体胚发生过程中对于靶基因姐妹染色单体粘连蛋白的调控模式在0～3 d较为一致,均为下调表达,6～12 d为显著上调表达,且二者呈典型的负调控关系。龙眼miR397a在不同浓度2,4-D与GA3激素处理下均出现下调表达趋势,而靶基因姐妹染色单体粘连蛋白则在激素处理下的表达趋势并不明显,可能由于靶向裂解位点在预测区外所致。【结论】龙眼miR397a可能在龙眼体胚发生早期的6～12 d,通过靶向调控姐妹染色单体粘连蛋白影响龙眼体胚发生早期形态建成。龙眼miR397家族在进化上较为保守,其靶基因主要靶向调控龙眼漆酶家族和姐妹染色单体粘连蛋白。龙眼miR397a在不同浓度2,4-D与GA3激素处理下均出现下调表达趋势,表明其在龙眼体胚发生早期可能通过激素信号传导参与龙眼体胚发生早期形态建成。     

山核桃miR159家族成员进化特性分析及功能研究

【目的】了解山核桃miR159家族成员的进化特性以及在植物花发育过程中的作用。【方法】通过PsRNATarget软件预测cca-miR159的靶基因,利用生物信息学软件对其进行系统进化及miR159成熟体碱基保守性分析;采用5’RACE技术验证cca-miR159对靶基因的裂解作用;以山核桃的雌雄花芽为试验材料,利用PCR技术扩增cca-miR159前体序列,通过转基因技术得到转基因阳性植株并对其基因功能进行验证,并通过荧光定量PCR分析转基因植株中miR159靶基因的表达情况。【结果】在山核桃中成功克隆了miR159的2种前体序列,分别为cca-miR159.1和ccamiR159.2。其中cca-miR159.1前体序列中只含有1个cca-miR159a成熟体,而cca-miR159.2前体序列中含有ccamiR159a和cca-miR159b 2个成熟体,且cca-miR159a碱基保守性明显高于cca-miR159b。进化分析发现山核桃miR159前体序列与杨树的亲缘关系较近。预测到cca-miR159a的靶基因主要为MYB家族基因,而cca-miR159b的靶基因则为AP1和UBX,分别对花发育以及生长素的调节有影响。进而对靶基因的切割位点进行验证,发现cca-miR159的靶基因切割位点基本在第11和12位碱基之间。过表达cca-miR159.1的拟南芥阳性植株叶片数量少于野生型,而过表达cca-miR159.2的阳性植株,除了叶片数量减少,其花期较野生型提早10 d左右。【结论】山核桃miR159含有ccamiR159a/b 2个成熟体,它们主要在靶基因的第11与12位碱基之间进行剪切。cca-miR159a的靶基因主要为MYB家族基因,其中MYB33、MYB65促进花药与花粉发育。cca-miR159抑制靶基因的表达从而发挥作用,cca-miR159.1过表达对植株的生长有一定的抑制作用,cca-miR159.2具有促进植物花期提前的作用。     

桃生长素酰胺水解酶基因家族序列特征及其表达分析

生长素酰胺水解酶（IAA-Leucine Resistant1-like Hydrolase,ILL）可催化生长素结合态释放游离态生长素（IAA）。为了深入研究桃ILL基因家族的功能,对桃基因组中ILL基因家族成员的数量、在染色体骨架的分布、编码蛋白质的结构、基因表达模式和编码氨基酸的进化树分类等方面进行了研究。桃基因组中共鉴定出了9个ILL基因,它们分布在4个染色体骨架上（scaffold 1、2、3和7）。在桃中编码ILL蛋白家族的基因成员分别为：PpILR1、PpILR2、PpILR3、PpILR4、PpILL1、PpILL2、PpILL3、PpILL4和PpILL5,所有这些预测的蛋白都含有M20结构域和M20二聚化结构域。运用荧光定量实时PCR技术对该基因家族在桃果实生长发育各阶段的表达水平进行了分析,结果显示：ILL 基因家族中的数个成员在果实不同发育阶段表达水平有变化,其中PpILR1的表达量在果实生理成熟期明显上调。     

三褶虾脊兰CtARF57和CtIAA12基因克隆及功能分析

以三褶虾脊兰(Calanthe triplicata)不同发育时期的花瓣距为试材，基于转录组测序数据，通过克隆获得生长素信号转导途径中CtARF57和CtIAA12基因全长序列，并进行生物信息学分析，探究园林花卉三褶虾脊兰生长素相关响应因子(ARF和Aux/IAA)的表达特性及功能，以期揭示三褶虾脊兰花瓣距的发育机理。结果表明：cDNA全长为3 054 bp和1 124 bp,分别编码911、177个氨基酸。2个基因氨基酸序列与铁皮石斛同源基因的相似性较高，均超过84%。保守结构域分析表明CtARF57蛋白具有B3结构域、Auxin＿resp结构域和Aux/IAA结构域；CtIAA12具有Aux/IAA蛋白的DomainⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ特异性结构域。实时荧光定量PCR结果显示，其转录水平受到生长素的诱导，不同时期基因表达水平差异明显，2个基因均在三褶虾脊兰花瓣距发育最后一个时期表达量最高，前2个时期表达量较低，与转录组FPKM值趋势一致。综上所述，初步推测2个响应因子基因参与生长素信号传导途径并调控园林花卉三褶虾脊兰花瓣距的形态建成和生长代谢过程。     

桃果实花色素苷积累与ABP1、ARF6表达分析

生长素结合蛋白ABP1和响应因子ARFs参与桃果实发育等生理过程。以两种红肉桃基因型(DBF、bf)和一个白肉桃品种的果实为试材,采用高效液相色谱法(HPLC)对其花色素苷组分含量进行定性和定量分析,同时应用荧光实时定量PCR分析PpABP1和PpARF6在桃果实发育过程中的表达量变化及其在不同组织中的表达差异性。结果表明,两种红肉桃基因型果实在发育期花色素苷的积累规律存在较大差异,其中"黑油桃"(bf)花色素苷含量在盛花后88d达到最高峰,随后直至果实成熟呈现连续下降的趋势;而"北京一线红"(DBF)的花色素苷含量在花后64d前未检测到花色素苷组分,而后呈现线性增长趋势,在果实成熟时达到最高峰。另外,PpABP1和PpARF6在桃果肉不同发育时期均有表达,其中北京一线红和"雪白桃"(白肉)分别在盛花后72d和74d表达量达到最大值,而黑油桃中表达量一直保持较低水平。基因表达组织差异性分析发现,PpABP1和PpARF6在花瓣中表达量相对较高;另外,在黑油桃果皮、幼果、新梢和叶片中的表达水平均低于其他品种。     

桃果实采后软化过程中内源IAA、ABA和乙烯的变化

以玉露桃果实为试材,分析了桃果实后熟衰老进程中内源ABA、IAA和乙烯水平的变化,探讨其相互关系,以及对果实后熟软化进程的调控机制。结果表明,桃果实乙烯跃变始于采后第3天,跃变峰值出现在采后第8天;采后初期ABA含量迅速积累,于采后第3天达到高峰,随后趋下降;但IAA水平在果实后熟软化进程中呈持续下降趋势。ABA和IAA水平在后熟软化末期均有所增加。     

桃果实PpOAT 和PpP5CS 的克隆及其对外源#br# GABA 处理的响应表达

 利用RT-PCR 结合RACE 技术从‘玉露’桃果实中克隆得到Δ1–吡咯啉–5–羧酸合成酶 （P5CS）和鸟氨酸转氨酶（OAT）基因的全长cDNA 序列,分别命名为PpP5CS 和PpOAT（GenBank 登 录号分别为KP973954 和KP973956）。PpP5CS 全长2 511 bp,开放阅读框为2 151 bp,编码717 个氨基酸 组成的蛋白质多肽,5′-UTR 长度为123 bp,3′-UTR 序列长度为235 bp;PpOAT 全长1 686 bp,开放阅读 框1 416 bp,编码472 个氨基酸,5′-UTR 长度为151 bp,3′-UTR 序列长度为119 bp。进化树分析发现, PpOAT 和PpP5CS 与湖北海棠的同源性最高,与MhOAT 和MhP5CS 的相似性分别达到88%和91%。采 用荧光定量PCR 分析了外源5 mmol · L-1 GABA 处理对桃果实0 ℃贮藏期间果实冷害发生和内源脯氨酸 合成关键基因PpOAT 和PpP5CS 表达的影响。结果表明,GABA 处理能显著抑制‘玉露’桃果实0 ℃贮 藏期间果肉出汁率的下降,减轻冷害。通过上调果实中PpOAT 和PpP5CS 的表达,提高内源脯氨酸的合 成和积累,进而增强了果实抵抗低温胁迫的能力,可能是外源GABA 处理减轻桃果实冷害的重要原因。     

Next generation sequencing reveals the potential functions of the genes involved in controlling several important commercial traits in peach (Prunus persica (L). Batsch) fruits

Next-generation sequencing techniques provide a new insight into the genetic bases of the most important commercial traits in fruit trees. The genomic deep sequencing results of peach cultivar ‘Xiaobaitao’ and its bud variation type ‘Jinliuzaohong’ are reported here. The numbers of detected Single nucleotide polymorphisms (SNPs) in wild type and in mutant were 591,485 and 593,484, with that of InDel as 113,934 and 115,065, respectively. Interestingly, the numbers of SNPs and InDels that differentiate ‘Jinliuzaohong’ from ‘Xiaobaitao’ were 50,217 and 19,368, respectively. The number of genes with non-synonymous mutation was 887, which involved in 109 pathways. The authors found dozens of genes involved in the important commercial traits of peach fruit which are of variations in Coding sequence (CDS) regions, including 3 NAC family genes, i.e. NAC66, NAC68, and NAC78. The relevant commercial traits of peach fruit include colour coverage, maturity date, fruit size, and sugar content. A phylogenetic tree of homological NAC proteins indicated relationship among the species. Genome sequence data suggested that a series of genes and several genetic pathways were likely involved in the formation of the important traits in peach fruits. The findings provide new evidence for the functions of the candidate genes controlling peach fruit traits which were proposed previously by researchers using QTL analysis.     

桃GH3基因家族的生物信息学分析及其在果实发育中的表达

为了探索生长素酰胺合成酶（GH3）基因家族在桃（Prunus persica L. Batsch）果实生长发育过程中的作用,对桃基因组中的GH3基因家族进行生物信息学分析,对它们在溶质型和硬质型油桃果实发育成熟阶段的表达水平进行qRT-PCR检测。检测结果表明：桃GH3基因家族有8个成员,分别为PpGH3-1 ~ PpGH3-8,聚类分析表明其分为GroupⅠ和GroupⅡ两类。实时荧光定量PCR分析表明GroupⅡ型基因（PpGH3-1、PpGH3-2、PpGH3-3、PpGH3-4和PpGH3-5）在溶质型油桃中的表达水平高于硬质型油桃,其中PpGH3-3和PpGH3-4最为明显。经NAA处理后的硬质型油桃果实PpGH3-1、PpGH3-3、PpGH3-4和PpGH3-7相比对照上调表达,其中PpGH3-3上调表达最为明显。试验结果表明生长素在桃果实成熟软化过程扮演着重要的角色。     

番茄S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因SlSAMDC1的克隆与序列分析

 以蔓陀罗S-腺苷蛋氨酸脱羧酶全长cDNA序列为信息探针, 筛选NCBI番茄EST数据库, 依据同源EST信息,经人工拼接、RT-PCR及RACE技术验证,获得了1个新的SAMDC基因家族成员,命名为SlSAMDC1(GenBank登录号：EF550528),并利用染色体步移技术克隆了879 bp的上游调控区域。SlSAMDC1 cDNA序列全长1 847 bp, 5′-UTR和3′-UTR分别长523 bp、241 bp;存在3个ORF(微型uORF、小型uORF和主ORF),主ORF编码360个氨基酸的SAMDC酶原;SlSAMDC1基因组序列全长3 648 bp,有3个内含子,均位于5′-UTR,所有内含子的剪切位点均符合真核生物“GT-AG”规则。SlSAMDC1基因与其它植物来源SAMDC基因同源性较高,与人、大肠杆菌以及酵母的同源性较低。表达谱分析发现,SlSAMDC1基因在番茄根、茎、叶、花蕾、果实等器官中均表达,果实中的表达量相对较高。生物信息学分析表明,SlSMDC1基因的上游调控序列存在多个顺式作用元件,如W-box、TATA-box、CAAT-box等。     

番茄LemiR828的克隆表达及其靶基因的鉴定

以番茄（Lycopersicum esculentum）LA1996（Aft基因型,紫色花青素积累品系）cDNA为模板,对LemiR828前体基因和预测到的靶基因LeTAS4（Trans-Acting SiRNA Gene 4）进行克隆,采用RT-PCR技术检测其在番茄果实发育中的差异表达,并用RLM 5′RACE技术验证LemiR828对预测靶基因LeTAS4 mRNA的剪切作用及靶作用位点。结果表明,LemiR828的前体序列含有完整的茎环结构;在果实发育成熟的过程中,LemiR828及LeTAS4在番茄中的表达量存在差异。在绿色果阶段的表达量较低且LemiR828对LeTAS4的负调控关系不明显;而在成熟果阶段,LemiR828及LeTAS4的表达量均升高,且存在明显的负调控关系。LemiR828能够靶作用于LeTAS4的转录本上调控其降解,其剪切位点为LemiR828序列5′端的第10位碱基。因此,在LA1996番茄果实发育过程中,LemiR828和LeTAS4参与果实发育的调控,并且LemiR828负调控其靶基因LeTAS4的表达。     

牡丹ACC氧化酶基因cDNA克隆及全序列分析

 以牡丹品种‘洛阳红’（Paeonia suffruticosa 'Luoyang Hong'）花瓣为材料,用CTAB法提取总RNA,根据已报道的ACC氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase,ACO）保守氨基酸序列设计简并引物,通过RT-PCR扩增得到1条821 bp的牡丹ACO基因同源片段。利用该已知中间序列,通过快速扩增cDNA末端技术(Race)及序列拼接,最终得到该基因cDNA全长序列,命名为Ps-ACO1,GenBank登录号为DQ337251。分析结果表明,Ps-ACO1 cDNA全长1 221 bp,包含一个939 bp的开放读码框,5'非翻译区长65 bp,3'非翻译区长117 bp,编码产物为含有312个氨基酸残基的蛋白质。氨基酸序列与烟草、苹果、桃等植物的ACO同源性都达80%以上。     

冬枣两个ACC氧化酶基因的cDNA克隆及其表达模式

 根据植物ACC氧化酶（ACO）家族的氨基酸和核苷酸保守区序列设计简并引物,采用3′RACE技术从半红期冬枣果实中分离了两个ACO同源基因片段,随后通过PCR技术进一步获得了两个包含完整开放阅读框（ORF）及3′端非编码区（UTR）序列的ACO基因的cDNA,即ZjACO1和ZjACO2。两个基因序列在GenBank中的登录号为EU216549和EU216550,其大小分别为1 115 bp和1 105 bp,编码蛋白大小分别为319个和321个氨基酸。ZjACO1和ZjACO2在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分别为79.4%和84.0%。Northern杂交结果表明,这两个基因在冬枣叶片中不表达,而在不同发育阶段果实中的表达具有明显差异。