牡丹开花调控转录因子基因PsCOL4的克隆、表达与系统进化分析

采用RT-PCR 方法从‘紫罗兰’牡丹（Paeonia suffruticosa‘Ziluolan’）花芽中克隆得到1个重要开花调控转录因子基因CONSTANS-like,其cDNA 全长1 125 bp,编码373 个氨基酸。序列比对和结构域分析表明,此蛋白包含两个B-box 型锌指结构和1 个CCT 结构域,与拟南芥的AtCOL4 最为相似,将其命名为PsCOL4,GenBank 登录号为KF113358。系统进化树分析表明,PsCOL4 与葡萄编码的VvCOL4的亲缘关系最近,属于第1 群组CO 类似基因。实时定量PCR 表明,PsCOL4 在不同组织器官中均有表达,其中茎和叶中的表达量最高,根中最低。在花芽不同发育时期,PsCOL4 的表达呈现递减趋势。不同光周期条件下,PsCOL4 的表达稍有不同,短日照条件下在叶中的表达有所增加,茎中稍有减少。     

番荔枝开花调控转录因子基因AsLEAFY的克隆与表达分析

利用同源克隆和RACE-PCR获得番荔枝LEAFY基因的全长cDNA序列,命名为AsLEAFY,Gen Bank登录号为KP866145。序列分析表明,克隆获得的番荔枝AsLEAFY基因长为1 236 bp,编码411个氨基酸,该氨基酸序列含有5′-N端脯氨酸富集区和中央酸性区,具有LEAFY(FLO)家族的典型结构特征。同源分析表明,该氨基酸序列与多种木本植物LEAFY类蛋白的同源性较高。进化树分析表明AsLEAFY与木本植物的亲缘关系高于草本植物。实时定量PCR结果表明,AsLEAFY在番荔枝花发育的整个过程中都有表达,在初期的花芽中表达量最高,在不同组织器官中表达量存在差异,在枝条去叶后的腋芽中的表达量最高。推测该基因在番荔枝花器官形成初期发挥重要作用。     

牡丹病程相关蛋白1基因的克隆及表达分析

 以牡丹柱枝孢叶斑病病原菌Cylindrocladium canadense处理的牡丹‘鲁菏红’叶片为材料,根据已发表植物PR1的保守区域设计兼并引物,利用RT-PCR和RACE技术,获得病程相关蛋白1基因的cDNA,命名为PsPR1。该序列全长为744 bp,5′和3′非翻译区分别有42 bp和225 bp。该基因有477 bp的开放阅读框（ORF）,编码158个氨基酸,成熟蛋白分子量14.8 kD,等电点（pI）6.19,具有典型的SCP_PR1_like保守结构域。通过Blast比对发现该基因与多种植物病程相关蛋白1基因具有高度同源性。通过实时荧光定量PCR检测,发现该基因在牡丹萼片中相对表达量最高,在正常生长的叶片中最少。该基因受病原菌C. canadense和信号物质SA的显著诱导,分别在处理的24 h和12 h达到最高峰,说明PsPR1可能参与了牡丹的抗病防御过程。     

苹果属小金海棠转录因子MxMYB1基因的克隆及其原核表达

 MxMYB1是苹果属小金海棠MYB类转录因子。MxMYB1含1个重复序列及MYB蛋白特有的氨基酸组成。酶切、PCR扩增及测序分析表明构建的原核表达载体结构正确, 未出现碱基突变及移码现象。1 mmol/L IPTG诱导2 h后, 在预期的蛋白分子量38 kD处出现1条表达加强的蛋白条带, 而未经诱导的转化子没有此蛋白条带。为进一步目的蛋白的纯化和鉴定提供试验基础。     

牡丹PobZIP1在种子发育中的表达及其与ABA含量的关系

 采用RT-PCR方法从‘凤丹’牡丹（Paeonia ostii‘Fengdan’）种子中克隆得到1个与ABA信号途径相关的转录因子基因PobZIP1,并利用超高效液相色谱—串联质谱（UPLC–MS/MS）的方法测定了不同发育时期种子的ABA含量。PobZIP1 cDNA全长957 bp,编码318个氨基酸,其编码的蛋白C末端含有bZIP转录因子的典型结构域,GenBank登录号为KJ009392。PobZIP1蛋白与拟南芥bZIP转录因子聚类分析显示,PobZIP1转录因子属于拟南芥bZIP转录因子的A亚族,与AtbZIP39/ABI5聚在一起。与其他物种bZIP蛋白的系统进化分析表明,牡丹PobZIP1与蔷薇科的苹果bZIP亲缘关系最近。SqRT-PCR结果表明：PobZIP1在‘凤丹’牡丹根、茎、叶和花芽中均有表达,其中花芽中的表达量最低,根、茎、叶中的表达量相近。在种子发育过程中,PobZIP1的表达呈现出先增加后降低的趋势。ABA含量测定结果显示,随着种子的发育ABA含量迅速上升,达到最大值后缓慢下降并保持在较高水平。推测种子发育后期,较高含量的ABA和表达相对较高的PobZIP1可能是诱导种子休眠形成的原因。     

牡丹NCED 基因的克隆和表达分析

 通过RT-PCR和RACE技术克隆得到了牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）中编码9–顺式–环氧类胡萝卜素加双氧酶蛋白（NCED）的一条cDNA基因全长（暂命名为Ps-NCED1）。进化树分析显示Ps-NCED1的氨基酸序列与葡萄、马铃薯、胡萝卜等植物中的NCED一致性均达到了70%以上。通过与拟南芥中CCD（类胡萝卜素分解加双氧酶）家族氨基酸序列比对后发现,Ps-NCED1与调控ABA合成的At-NCED3一致性最高。对花朵中内源ABA的研究发现,ABA在花朵蕾期及衰老期含量较高,盛开期时含量较低,表明ABA对于植物的开放衰老具有促进作用。相对荧光定量PCR分析发现：在花朵完全开放的牡丹植株中,Ps-NCED1在根、茎、叶、花托、萼片、花瓣、心皮、雄蕊中的表达量以在根和雄蕊中较高,在叶和萼片中最低。在外源ABA处理的牡丹花瓣中,Ps-NCED1表达量变化与内源ABA含量变化具有相同的趋势,推测该基因是调控内源ABA含量的主要基因。     

牡丹查耳酮合酶基因Ps-CHS1的克隆及其组织特异性表达

以牡丹（Paeonia suffruticosa）品种‘彩绘’为试材,采用RT-PCR和RACE方法从花瓣中获得了一个牡丹查耳酮合酶（chalcone synthase,CHS）基因cDNA全长,命名为Ps-CHS1,GenBank登录号为GQ483511。序列分析结果表明,Ps-CHS1全长1 475 bp,包含82 bp的5′非编码区、208 bp的3′非编码区和一个长度为1 185 bp编码394个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列分析显示该基因编码的蛋白具有CHS家族保守存在的所有功能活性位点和特征多肽序列。序列比对和系统进化分析表明,Ps-CHS1与杨柳科、锦葵科、蔷薇科等植物的CHS亲缘关系较近,相似性达90%以上。相对荧光定量PCR分析表明,Ps-CHS1在花瓣中的表达量最高,其次是萼片,再次是叶片和雄蕊,在心皮中表达量最低。     

番茄转录因子基因SlWRKY16的克隆及原核表达分析

从栽培番茄(Solanumlycopersicum)‘M82’中克隆到1个WRKY家族基因SlWRKY16。研究结果显示:SlWRKY16包含1 497 bp的完整开放读码框,编码498个氨基酸,理论分子量为55.5 kD,含有1个WRKYGQK保守结构域和C2H2锌指结构域,属于Ⅱb类WRKY转录因子基因,且定位于细胞膜上;栽培番茄Sl WRKY16与潘那利番茄Sp WRKY6(XP₀15064265.1)、马铃薯St WRKY6(XP₀06350473.1)同源性最高。qRT-PCR结果显示SlWRKY16在番茄不同组织中均有表达,叶片中的表达量最高;短时间非生物胁迫下该基因的表达量显著降低。此外,重组菌pET-30a-SlWRKY16在NaCl、甘露醇胁迫下生长均明显低于对照菌pET-30a。综上,番茄SlWRKY16基因可能在响应非生物胁迫过程中具有负调控效应。     

牡丹切花ERF转录因子基因的分离与表达分析

利用已获得的‘洛阳红’牡丹花瓣转录组数据库,筛选得到3个与植物乙烯响应因子ERF蛋白同源性较高的Unigene序列,利用RACE及RT-PCR技术,设计特异性引物对3个ERF基因最大阅读框进行扩增并测序。生物信息学分析表明PsERF1、PsERF2和PsERF3分别含有长为1 158、747和609 bp的开放阅读框,编码383、248和202个氨基酸残基,且均含有1个典型的AP2结构域。进化分析表明3个牡丹ERF转录因子分别属于ERF亚家族的B2组、B1组和B3组。利用实时定量PCR分析了3个ERF基因在牡丹乙烯敏感型品种‘洛阳红’和乙烯不敏感型品种‘雪映桃花’不同花器官（花瓣、雄蕊、雌蕊和萼片）以及不同发育级别切花花瓣中的表达情况。结果表明,PsERF1在2个品种花瓣中的表达量显著高于其他花器官,其表达量在‘洛阳红’切花发育过程中逐渐增加,而在‘雪映桃花’切花发育过程中逐渐降低,推测PsERF1可能对牡丹切花的乙烯响应具有重要的调控作用,PsERF2和PsERF3则可能同时参与了多种信号途径。     

牡丹隐花色素基因PsCRY2的克隆与表达分析

以‘秋发1号'和‘洛阳红'牡丹(Paeonia suffruticosa)为试验材料,采用RT-PCR的方法从花芽中克隆得到1个隐花色素基因Cryptochrome 2,其ORF全长为1902 bp,编码633个氨基酸,基因登录号为KP982893。序列比对和结构域分析表明,此蛋白包含1个PHR和1个CCT结构域,与拟南芥中AtCRY2最为相似,将其命名为PsCRY2。系统进化树分析表明,PsCRY2与甜橙(Citrus sinensis)CsCRY2亲缘关系最近。实时荧光定量PCR表明,PsCRY2在牡丹的不同组织器官中均有表达。其中,成年植株的花芽以及种子胚的表达量最高,幼苗根、茎、叶次之。在整个花芽分化不同时期,PsCRY2的表达呈现较高的表达水平;在花蕾发育不同时期,PsCRY2的表达呈现先降低再升高而后有降低的趋势,大风铃期表达量最高,推测PsCRY2在花芽分化和花蕾发育的过程中均起到重要作用。在‘洛阳红'和‘秋发1号'牡丹春季花芽发育过程中,PsCRY2的表达均呈升高的趋势,‘秋发1号'显著高于‘洛阳红'。不同光周期条件下,PsCRY2表达稍有不同。与长日照条件相比,短日照条件下PsCRY2在现蕾期和小风铃期的表达量均下降。     

牡丹泛素延伸蛋白基因ubiquitin克隆及其作为内参基因的研究

以牡丹品种‘洛阳红’（Paeonia suffruticosa‘Luoyanghong’）为试验材料,采用RT-PCR方法获得一个牡丹泛素延伸蛋白基因Psubiquitin（PsUBI）,其cDNA开放阅读框（ORF）长度为447 bp,编码148个氨基酸,GenBank登录号为KP742952。序列比对发现,该基因与其他23种植物泛素延伸蛋白核苷酸序列的相似性均在81%以上,氨基酸序列的相似性达96%。进化分析表明,牡丹泛素延伸蛋白与棉花泛素延伸蛋白的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,在牡丹不同组织器官中,相对于其他5个常用看家基因（GAPDH、GAPDH1、tubulin、tubulin2、18S rRNA）,ubiquitin的PCR扩增曲线的CT值最为恒定,尤其是在不同花器官中的CT值完全一致。进一步分析发现该基因在牡丹的根、茎、叶片、花、雄蕊和心皮组织中均恒定表达,特别是花器官中的表达量几乎完全一致。以ubiquitin作为内参基因探讨控制花器官发育的基因PsAG的表达情况,结果显示PsAG的表达模式与其作用位点相吻合,ubiquitin更适宜作为牡丹花器官研究的内参基因。     

苹果己糖激酶基因MdHXK1的克隆与表达分析

从‘嘎啦’苹果中克隆了己糖激酶基因MdHXK1(基因序列号:MDP0000309677)全长,测序发现其包含长为1 497 bp完整的开放阅读框,编码499个氨基酸,预测其编码蛋白质分子量为54.05k D,等电点为5.76。系统进化树分析表明,HXK1在不同物种间具有高度的序列保守性;其中,苹果MdHXK1与中国白梨Pb HXK1亲缘关系最近。功能域分析表明,MdHXK1蛋白含有两个保守的激酶域。Southern blotting结果表明,MdHXK1在苹果基因组中有一个拷贝。亚细胞定位预测表明,MdHXK1主要定位于细胞质。分析MdHXK1基因启动子序列发现含有与抗逆、糖信号及激素信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdHXK1在苹果的茎和花中表达量较高;在苹果果实发育期间,MdHXK1基因的表达、MdHXK1葡萄糖磷酸化相对酶活性和葡萄糖积累水平都呈现先升高后降低的趋势,MdHXK1基因的表达明显受盐、低温和ABA的诱导。原核诱导并纯化了MdHXK1蛋白,为后续MdHXK1蛋白的功能鉴定奠定基础。     

苹果BR信号转录因子基因MdBZR1的克隆及表达分析

从矮化苹果砧木Malling 9（M9）中分离1个BR信号转录因子BRASSINAZOLE-RESISTANT 1（BZR1）基因,命名为MdBZR1,其开放阅读框为888 bp,编码295个氨基酸,有5个保守结构域：核定位信号结构域NLS（MARRKPSWRERENNRRTERRR）、氮（N）端结构域（NLPKHCDNNEVLKALCLQ AGWTVEDDGT）、BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE 2（BIN2）磷酸化结构域（STKISPYSSLNPSPIPS YOVSPSSSSYPSPTR）、PEST结构域（PTAATIPECDESDASTVDSGQ）和碳（C）端保守结构域（VKPWIGEK IHEVGLDDLELTLGNGKA）。系统进化树分析显示,MdBZR1与美国National Center for Biotechnology Information（NCBI）数据库中注释的苹果BZR1基因亲缘关系最近。MdBZR1在M9不同组织均有表达,在顶梢中的表达水平最高;外源BR和生长素处理促进苹果幼苗（M9和平邑甜茶）株高增长,MdBZR1表达量增加;GA处理虽也促进株高增长,但对MdBZR1的表达影响不显著。此外,半矮化砧穗组合长富2号/MM106和乔化砧穗组合长富2号/长富2号接穗中MdBZR1的表达量明显高于矮化砧穗组合长富2号/M9。因此,MdBZR1很可能对苹果树株高具有重要调控作用。     

牡丹5个管家基因的克隆及其在系统进化分析中的应用

利用RT-PCR技术从牡丹组7个野生种和1个栽培种中分别克隆得到泛素延伸蛋白基因(ubiquitin,UBI)、素环蛋白基因(cyclophilin,CYP)、肌动蛋白基因(Actin)、葡萄糖六磷酸脱氢酶基因(glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase,G6PD)和β–微管蛋白基因(beta-tubulin,TUB)等5个管家基因的编码序列(coding sequence,CDS)。序列比对分析发现,5个管家基因序列均相对保守,其在牡丹7个野生种和1个栽培种中的保守性在99.04%~99.69%。利用5个管家基因分别构建了其在牡丹组8份材料中的系统进化树。5个系统进化树均将8份材料分成两组,即革质花盘亚组和肉质花盘亚组;由于5个管家基因核苷酸序列各自的保守性不同,在区分亚组成员间略有差异。综合分析5个管家基因构建的系统进化树可知,杨山牡丹(Paeonia ostii)和栽培牡丹(P.suffruticosa‘Luoyanghong’)常聚为一支,二者亲缘关系较近,因而推测杨山牡丹可能参与了栽培牡丹的形成;紫斑牡丹(P.rockii)和四川牡丹(P.decomposita)一直聚为一支,推测二者亲缘关系较近;黄牡丹(P.lutea)和紫牡丹(P.delavayi)一直聚为一支,推测这二者亲缘关系较近。狭叶牡丹(P.potaninii)与黄牡丹和紫牡丹分化较早,结合前人研究结果建议将狭叶牡丹作为一个独立的种。