苹果溶质转运蛋白基因MdSLC35F2-like表达与花青苷积累的研究

以‘长富2’苹果片红芽变的果皮为试材,克隆了溶质转运蛋白家族基因Md SLC35F2-like(Solute Carrier Family 35 Member F2-like)的开放阅读框（ORF）,其长度为1 041 bp,编码346个氨基酸。利用在线软件进行生物信息分析,该蛋白是1个稳定的疏水性α螺旋跨膜蛋白,定位于细胞膜。同源性分析表明,Md SLC35F2-like与白梨的Pb SLC35F1-like同源性最高;系统进化分析表明,其与白梨的进化亲缘关系最近,与可可、巨桉的进化亲缘关系最远。分析‘长富2号’及其片红芽变果实着色期花青苷的积累与Md SLC35F2-like表达量的变化,结果表明,摘袋后Md SLC35F2-like表达量在‘长富2号’及其2个片红芽变果实果皮中均呈先升高后降低的趋势,在摘袋后3d表达量最高,而后逐渐降低,2个芽变材料均显著高于其野生型,表达量与花青苷含量呈正相关关系。在其他颜色品种上进行验证分析,Md SLC35F2-like在红色果皮品种‘烟富3号’果皮中的表达量极显著高于绿色果皮品种‘金陵’,在红色果肉品种‘红色之爱’果肉中的表达量显著高于白...     

苹果液泡膜蔗糖转运蛋白基因MdSUT4的表达分析与功能鉴定

以新疆红肉苹果杂种一代优系‘红脆1号’为试材,克隆MdSUT4并原核诱导获得其重组蛋白,对其进行生物信息学分析,测定其在不同组织及不同发育时期果实中的表达,通过亚细胞定位及转基因鉴定其功能。结果发现,MdSUT4编码的蛋白大小为55 kD左右,定位于8号染色体,由5个外显子和4个内含子组成;糖代谢相关基因系统进化树分析发现,MdSUT4与AtSUC4、PpSUT4在同一个进化支上;定量表达分析发现,MdSUT4在苹果的花、叶和幼果中均有较高的表达,且在果实发育中的表达水平与蔗糖含量显著负相关;MdSUT4启动子含有与糖信号及激素信号相关的顺式作用元件;在‘王林’苹果愈伤组织中过表达MdSUT4,能降低蔗糖含量,但却提高类黄酮含量;MdSUT4定位于‘王林’愈伤组织原生质体的液泡膜上。以上结果表明,MdSUT4可能参与了蔗糖从液泡膜中的外排,并可能促进类黄酮的合成。     

套袋对苹果果皮花青苷合成及着色的影响

套袋是提高苹果果实着色的主要技术措施之一,也是研究苹果果皮花青苷合成和基因表达的重要手段。苹果果皮花青苷的合成经由苯丙烷类代谢途径,编码苹果花青苷合成酶类的基因已得到克隆。套袋后果皮花青苷合成酶类的基因表达受到抑制,因而抑制了花青苷合成;摘袋后果皮花青苷迅速合成,与套袋后果皮光受体浓度增加和叶绿素含量降低从而提高对光的敏感度、迅速启动花青苷合成酶类的基因协同表达有关。果皮色素特别是花青苷和叶绿素的含量、比例和分布决定果实的着色状况,套袋促进果皮花青苷合成的同时大大降低了叶绿素含量,从而使果实着色鲜艳。     

金雀异黄素和环鸟苷酸调控离体葡萄果实花青苷积累

以离体‘巨峰’葡萄为材料,观察到金雀异黄素（GNT）对果皮花青苷积累的促进效应,而且证明GNT的诱导过程（约10 ~ 12 h）不需要光照,但其后的花青苷积累却依赖于光照。如果在GNT预处理后6 h内用环鸟苷酸（cGMP）处理,可以明显抑制GNT的促进效应,但在GNT预处理后12 h再用cGMP处理,则抑制效应消失。半定量RT-PCR检测表明,光和GNT诱导葡萄果皮花青苷合成相关基因PAL、CHS和UFGT表达量上调,而对LDOX表达量无明显影响;cGMP处理抑制了GNT诱导的PAL和CHS等基因表达的促进作用,说明GNT和cGMP相互拮抗,共同调控葡萄果皮花青苷积累。     

过表达苹果多肽激素基因MdCEP1促进花青苷积累

以‘王林’苹果(Malus×domestica‘Orin’)愈伤组织为试材,初步探讨苹果多肽激素Md CEP1(C-TERMINALLY ENCODED PEPTIDE1)在调控花青苷合成方面的作用。分析显示Md CEP1位于苹果第15号染色体,只有1个外显子。蛋白序列比对显示不同物种中CEP结构域非常保守。启动子分析表明,Md CEP1启动子序列包含多个顺式作用元件,包括与分生组织有关的CAT-box元件、赤霉素响应元件(P-box)、光响应元件(MNF1)和与类黄酮合成相关的MYB类蛋白结合位点(MBSI)。通过农杆菌介导的遗传转化获得Md CEP1转基因苹果愈伤组织,进一步分析发现过表达Md CEP1能够明显促进愈伤组织花青苷积累,并且促进花青苷合成相关基因的表达。Md CEP1在拟南芥中异位表达,同样能够促进拟南芥中花青苷的积累,并且促进拟南芥花青苷合成相关基因的表达。研究结果表明,Md CEP1能够正调控苹果花青苷的合成。     

苹果愈伤组织超表达MdNAC029促进花青苷积累

以‘光辉’海棠(Malus spectabilis‘Guanghui’)与‘王林’苹果(Malus×domestica‘Orin’)杂交后代中分离出来的红肉苹果果实为试验材料,克隆得到1个NAC(NAM,ATAF1/2,CUC2)转录因子基因,命名为MdNAC029。该基因开放阅读框(ORF)为843 bp,编码含有280个氨基酸的蛋白。保守结构域分析显示,MdNAC029蛋白在N端包含1个保守的NAC结构域。基因表达分析显示该基因在红肉苹果果实中表达量较非红肉果实高。在‘王林’苹果愈伤组织中超表达MdNAC029,其花青苷积累显著增加,表明MdNAC029在调控花青苷积累过程中发挥重要作用。对MdMYB1启动子序列进行分析,发现其序列包含1个MdNAC029转录因子的结合位点。同时,烟草瞬时表达试验显示,MdNAC029能够激活MdMYB1基因的表达。由此推测,MdNAC029可能通过直接促进MdMYB1基因的表达,正向调节花青苷的积累。     

紫甘蓝花青苷提取工艺及抗氧化性研究

以新鲜紫甘蓝为试材,在单因素试验的基础上,采用响应面法对紫甘蓝花青苷的提取工艺进行了优化试验,并对紫甘蓝花青苷的抗氧化性进行了研究。结果表明:4个单因素对响应值的影响大小顺序为:D(提取时间)A(提取温度)B(乙醇浓度)C(料液比);紫甘蓝花青苷提取的最佳工艺条件为提取温度64℃,提取时间3.4h,乙醇浓度58%,料液比1∶10g/mL。在最佳提取条件下,花青苷的平均得率:109.873mg/g,RSD5%,与理论值(110.243mg/g)的相对误差为0.34%。紫甘蓝花青苷抗氧化性试验研究表明,紫甘蓝花青苷对·OH和O·2均有较好的清除效果,且在一定浓度范围内对这2种活性自由基的清除率与紫甘蓝花青苷的浓度呈正相关变化。总抗氧化活性试验结果表明,当紫甘蓝花青苷和维生素C的浓度相同时,其各自的总抗氧化活性及变化趋势相同,没有显著差异。     

红富士苹果套袋后果皮中花青苷积累与酚类物质代谢的关系

以红富士苹果为试材,分别在山东栖霞和泰安研究了套袋后果皮中酚类物质代谢与花青苷积累的关系。结果表明,套袋后果皮花青苷积累与酚类物质代谢密切相关。果皮中多酚氧化酶（PPO）含量较对照（不套袋果）降低,过氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）较对照升高,类黄酮、水溶性酚和花青苷含量较对照增加,果实着色迅速而良好。但在摘袋后气候不利和果袋为劣质单层纸袋条件下,果皮中酚类物质和花青苷含量均低于对照。     

葡萄芽变新品种南太湖特早果实发育过程中果皮花青苷积累规律研究

【目的】鉴定芽变新品种南太湖特早及其母本夏黑的果皮花青苷组分,鉴别二者发育过程中的转色差异和花青苷积累规律,为葡萄的色泽遗传育种提供理论基础。【方法】利用UPLC-Triple-TOF 5600+飞行时间液质联用技术鉴定成熟果实的果皮花青苷组分,采用HPLC高效液相色谱测定发育过程果皮花青苷含量。【结果】南太湖特早和夏黑的成熟果实果皮中共检测到15种花青苷,其中甲基花青素-3,5-O-双葡萄糖苷（Pn-DG）、二甲基花翠素-3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷（Mv-DG-Co）仅在南太湖特早中检测到,二甲基花翠素-3,5-O-双葡萄糖苷（Mv-DG）、二甲基花翠素-3-O-乙酰葡萄糖苷（Mv-G-Ac）仅在夏黑中检测到;均以二甲基花翠素类衍生物为主,单葡萄糖苷含量均高于双葡萄糖苷。南太湖特早果皮总花青苷含量约为夏黑的1.5倍,2个品种积累规律存在较大差异。南太湖特早果皮花青苷积累比夏黑提早7 d,花翠素类衍生物（花翠素类,甲基花翠素类,二甲基花翠素类）在花后31～52 d快速积累,达到与成熟时期相当含量,使果实较快呈现深紫色。夏黑果皮花青素快速积累期短,积累量少于南太湖特早,且P...     

血红素加氧酶–1促进萝卜芽苗菜下胚轴花青苷积累

以萝卜（Raphanus sativus L.）芽苗菜为材料,在白光下外源添加与血红素加氧酶–1（HO-1）相关的试剂为处理,以加水为对照,探究HO-1对花青苷合成的影响。结果表明,各个处理均不影响芽苗的鲜质量。与对照相比,添加HO-1诱导剂（Hemin）后下胚轴中花青苷含量显著升高,HO-1抑制剂（ZnPP）及血红素降解产物（BR、CO、Fe2+）处理下花青苷含量均有所下降,其中抑制剂ZnPP处理后下降最多;经诱导剂Hemin处理后HO-1及花青苷合成途径中的调控基因PAP1和关键结构基因PAL、CHS、CHI、F3H、DFR的表达量以及PAL酶活性与对照相比都有显著提高。由此表明,血红素加氧酶–1（HO-1）通过上调花青苷合成途径关键基因表达量促进花青苷积累。     

早熟苹果花青苷积累与其相关酶活性及乙烯生成之间的关系

 以生长发育期相近但着色不同的早熟苹果‘泰山早霞’（红色）和‘辽伏’（绿色）为试材,研究果实生长发育过程中果皮花青苷含量和PAL、CHI、UFGT 活性,以及乙烯释放速率的变化。结果显示：①在果实发育过程中,‘泰山早霞’花青苷含量与苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查尔酮异构酶（CHI）、类黄酮半乳糖苷转移酶（UFGT）活性均明显高于‘辽伏’。②两个早熟苹果在采收前均有乙烯释放高峰,并且乙烯释放高峰早于花青苷的迅速积累;喷施1-MCP 后果实的乙烯释放速率降低,花青苷合成随之显著减少：说明乙烯启动并调控早熟苹果成熟期花青苷的积累。③‘泰山早霞’发育后期花青苷含量与UFGT活性显著正相关,乙烯可能是通过调控UFGT 酶的活性来促进花青苷的合成。     

苹果MdMYB2基因的克隆及功能鉴定

以‘嘎拉’苹果为材料,采用同源克隆和PCR技术分离了苹果基因MdMYB2(基因序列号:MDP0000823458)。MdMYB2的开放阅读框(ORF)长度为873 bp,编码含有290个氨基酸的蛋白,预测其蛋白质分子量为32.92 kD,等电点为4.91。系统进化树分析显示,苹果MYB2与梨MYBL2亲缘关系最近,同源性最高。组织表达分析表明,MdMYB2在苹果的各个组织均有表达,在茎和果实中表达相对较高。MdMYB2的表达明显受盐胁迫的诱导。构建了MdMYB2的表达载体,并通过农杆菌介导的遗传转化得到了转基因苹果愈伤和转基因拟南芥植株。抗性试验表明,过量表达MdMYB2明显提高了转基因苹果愈伤对盐胁迫的抗性。此外,异位表达MdMYB2也能提高拟南芥对盐胁迫的抗性,以上试验结果表明MdMYB2在植物盐胁迫响应中发挥重要作用。     

苹果MdCBL3基因的克隆与功能鉴定

从‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆MdCBL3(序列号:MDP0000155124),长852 bp。系统进化树分析表明,苹果MdCBL3与白梨亲缘关系最近。利用PlantCare数据库进行启动子顺式作用元件预测分析,MdCBL3启动子序列中存在干旱、低温、光、生长素、防御等响应元件。构建MdCBL3表达载体并利用农杆菌介导法侵染苹果愈伤组织和拟南芥。半定量RT-PCR证明MdCBL3在转基因愈伤组织中过量表达,在拟南芥中得到异源表达。表型分析发现,在盐胁迫中,与野生型相比,转基因愈伤组织和拟南芥成龄苗生长更好,盐胁迫的抗性更强。在拟南芥中异源表达MdCBL3,能提高拟南芥对干旱和低温的抗性。     

花青素积累相关负调控因子的研究进展

植物花青素的积累受正调控因子与负调控因子的影响,过去多集中于对正调控因子的研究,而最近注意到负调控因子对于保证植物正确响应发育及环境信号,进而精细调控花青素的积累具有重要作用。从结构特征,作用机制,参与的调控途径等方面综述了与植物花青素积累相关的负调控因子的研究进展,根据其对花青素合成关键基因的调控方式分为转录水平调控的转录抑制因子、参与转录后水平调控的负调控因子以及具体作用机制尚不明确的因子3 大类,并对相关后续研究方向进行了探讨。     

苹果液泡铁离子转运蛋白基因家族的鉴定与表达分析

液泡铁离子转运蛋白(vacuolar iron transporter,VIT)参与铁的储存和运输,对植物光合作用、固氮、呼吸、DNA和激素合成有重要作用。本研究中鉴定了苹果全基因组的9个VIT基因,通过系统发育分析其进化关系,表明苹果VIT蛋白与拟南芥进化关系较近。染色体定位显示9个VIT基因分布在7条染色体上,VIT基因的启动子区域富含光反应、植物激素调控和启动子相关顺式作用元件。表达谱分析显示VIT基因在花和果实中的表达量相对较高。此外,对MdVIT家族进行蛋白理化性质、String互作网络和基因结构等分析,表明苹果VIT家族扩增的主要因素是串联重复和片段复制,与苹果VIT蛋白互作的主要蛋白是阳离子共转运蛋白(XP₀08372221.1和XP₀08383418.1)。qRT-PCR分析结果表明:在2 000μmol·L-1 FeSO4·7H2O(高铁)处理的‘M26’苹果砧木苗中,苹果VIT家族基因在不同组织的表达中存在差异,6 h后,MdVIT4在茎中的相对表达量最高,是对照的237倍。24 h后,MdVIT1和MdVIT2在叶片中的...