苹果MdDRB1基因在番茄中异位表达与功能研究

【目的】将苹果Md DRB1基因转入番茄中,探究苹果MdDRB1基因在番茄中的异位表达与功能。【方法】采用农杆菌介导法,将苹果基因Md DRB1转入番茄植物体内,用PCR检测到该基因已整合到番茄总DNA中。对获得的5个转基因番茄株系进行半定量RT-PCR分析,挑选MdDRB1基因表达水平由低到高的3个株系,用实时荧光定量PCR检测与生长素有关的mi RNAs及相应靶基因的相对表达量。并对非转基因和转基因番茄进行3μmol·L-1IAA和5μmol·L-1IAA处理,对植株进行向光性检测。【结果】转基因株系中miR164、miR160、mi R393表达量下调,mi R167表达量上调,同时,它们分别对应的番茄中的靶基因SlNAC1、SlARF10和SlARF16、SlTIR1的相对表达量上调,SlARF8相对表达量下调。IAA处理后,转基因株系幼苗的侧根数目比未转基因植株增多,同时,转基因株系幼苗的向光性也增强。【结论】苹果Md DRB1基因在番茄中的异位表达,通过抑制生长素响应相关的mi R164、miR160、miR393和增加miR167的积累水平,部分解除其对下游靶基因SlNAC1、SlARF10和Sl ARF16、SlTIR1以及增加Sl ARF8的转录后基因沉默作用,进而提高了转基因番茄对生长素响应的敏感性。     

苹果糖转运蛋白TMT基因的表达及其与糖积累的关系

利用苹果基因组筛选液泡膜单糖转运蛋白TMT 家族基因,通过qRT-PCR 探索它们在苹果各器官组织中的表达特性,并分析其表达与果实糖积累的关系。结果表明,在苹果中主要存在5 个TMT 家族基因,均含有11 个跨膜区,并具有1 个长约330 氨基酸的亲水loop 区位于胞质内,它们与拟南芥和葡萄的TMTs 高度同源。定量表达分析发现,它们均在苹果中表达,且MdTMT1 表达量相对最高,MdTMT3和MdTMT4 表达量较低。MdTMT1 在花和成熟果实中表达量最高,MdTMT2 在成熟果实中表达最高。在果实发育过程中,MdTMT1 和MdTMT2 的表达量与果实中总糖、还原性总糖、果糖、蔗糖含量呈极显著正相关,说明MdTMT1 和MdTMT2 可能参与了苹果果实成熟期果糖和蔗糖的积累。     

苹果MdRCD1基因的表达分析以及功能的初步鉴定

【目的】分离克隆苹果MdRCD1基因,分析其蛋白结构和逆境响应,并初步鉴定MdRCD1在苹果愈伤中的功能。【方法】同源克隆MdRCD1并测序,用DNAman和MEGA5相关软件分析MdRCD1氨基酸序列以及进化关系,不同逆境处理‘嘎拉’苹果组培苗,qRT-PCR分析MdRCD1在逆境条件下的表达量。农杆菌介导的遗传转化方法获得过量表达MdRCD1的转基因愈伤,不同盐浓度处理野生型和转基因愈伤,观察愈伤的长势,检测愈伤的鲜质量、脯氨酸和丙二醛含量,鉴定MdRCD1的初步功能。【结果】从‘嘎拉’苹果中克隆了MdRCD1(MDP0000234325)基因。该基因ORF为1 803 bp。通过进化树和蛋白同源性分析,表明苹果MdRCD1和中国白梨PbRCD1进化亲缘关系最近。在MdRCD1的N端有1个保守的WWE结构域,1个PARP催化中心,在C端有1个RST结构域。qRT-PCR实验表明MdRCD1在苹果各个组织器官中都有表达,在茎中的表达量高于其他组织;同时MdRCD1的表达受Na Cl、ABA、渗透胁迫等逆境胁迫的诱导。通过农杆菌侵染获得过量表达MdRCD1转基因苹果愈伤。盐胁迫处理条件下,过量表达MdRCD1的抗性明显提高。【结论】MdRCD1在进化过程中比较保守,苹果不同组织中都有表达,过量表达MdRCD1苹果愈伤的抗盐性得到提高。     

苹果砧木耐盐性田间鉴定

1997～ 1998年在山东省东营市盐碱地农场分别种植 14种 1年生苹果砧木苗和 6种砧木的1年生嫁接苗 ,发现砧木珠美海棠 ( Malus　 zumi)、小金海棠 ( M.xiaojinensis)耐盐性较强 ;M2 6、MM10 6、M9、八棱海棠 ( M.micromalus)耐盐性中等 ;丽江山定子 ( M.rockii)和 A2不耐盐。不同砧穗组合的耐盐能力主要取决于砧木 ,同一种砧木嫁接不同品种的耐盐性相当。轻度盐碱地育苗、覆膜铺草等栽培措施能提高苹果苗对盐胁迫适应性能力     

苹果己糖激酶基因MdHXK1的克隆与表达分析

从‘嘎啦’苹果中克隆了己糖激酶基因MdHXK1(基因序列号:MDP0000309677)全长,测序发现其包含长为1 497 bp完整的开放阅读框,编码499个氨基酸,预测其编码蛋白质分子量为54.05k D,等电点为5.76。系统进化树分析表明,HXK1在不同物种间具有高度的序列保守性;其中,苹果MdHXK1与中国白梨Pb HXK1亲缘关系最近。功能域分析表明,MdHXK1蛋白含有两个保守的激酶域。Southern blotting结果表明,MdHXK1在苹果基因组中有一个拷贝。亚细胞定位预测表明,MdHXK1主要定位于细胞质。分析MdHXK1基因启动子序列发现含有与抗逆、糖信号及激素信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdHXK1在苹果的茎和花中表达量较高;在苹果果实发育期间,MdHXK1基因的表达、MdHXK1葡萄糖磷酸化相对酶活性和葡萄糖积累水平都呈现先升高后降低的趋势,MdHXK1基因的表达明显受盐、低温和ABA的诱导。原核诱导并纯化了MdHXK1蛋白,为后续MdHXK1蛋白的功能鉴定奠定基础。     

异位表达苹果G蛋白偶联受体基因MdGCR1降低烟草的抗旱性

以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica‘Royal Gala’)为材料,采用同源克隆和PCR技术分离了G蛋白偶联受体基因MdGCR1。其开放阅读框(ORF)为960 bp,编码含有319个氨基酸的蛋白。系统进化树分析显示,MdGCR1与梨GCR1亲缘关系最近,同源性最高。基因表达分析显示MdGCR1主要在苹果根、茎和叶中表达,在花和果实中的表达量较低;MdGCR1受多种逆境胁迫诱导,参与多种激素响应。构建了MdGCR1植物过表达载体,并通过农杆菌介导的遗传转化获得了转MdGCR1烟草。转基因材料抗性试验结果显示:超量表达MdGCR1显著降低烟草对干旱胁迫的抗性,表明苹果G蛋白偶联受体基因MdGCR1在响应植物抗旱胁迫中发挥重要作用。     

拟南芥耐寒基因AtCOR15a在番茄中异源表达增强其耐寒性

拟南芥耐寒基因AtCOR15a由冷诱导启动子RD29A控制后,重组进双元表达载体,经根癌农杆菌介导,将该基因导入‘Ailsa Craig’番茄。研究发现,筛选出的3个高表达转基因株系的耐寒性比野生型显著增强;外源基因AtCOR15a的表达量在低温处理过程中呈现先增后降的变化趋势,且在处理6h达到最大值;在冷胁迫下,该基因的表达促进了转基因植株中SlDehydrin-like(Sl DEHL)和SlDehydrin Ci7(SlCi7)等内源冷诱导基因的表达,降低了细胞膜透性和丙二醛(MDA)含量,减少了活性氧H_2O_2和O_2~.的积累,增强了超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶等活性氧清除酶的活性,提高了游离脯氨酸含量。因此,AtCOR15a异源表达能够显著增强转基因番茄的耐寒性。     

拟南芥中过表达野菊miR396a基因增强其耐盐性

从野菊(Chrysanthemum indicum)中克隆了 cin-miR396a前体序列及其启动子,对前体序列进行比对与进化分析,对启动子顺式作用元件进行分析,并研究了cin-miR396a前体序列对拟南芥的遗传转化及对其耐盐性的影响.结果表明,cin-MIR396a长度为145 bp,含有完整的茎环结构,与拟南芥...     

过表达SbRFP1基因提高马铃薯组培苗的耐盐性

利用不同浓度NaCl处理过表达SbRFP1的马铃薯转基因株系和对照组培苗,结果显示5和8 g·L^-1的NaCl胁迫时,转基因株系的株高、根长和鲜质量均显著超过非转基因对照。转录组测序发现F-box基因(PGSC0003DMG400013116)和GDSL(Gly-Asp-Ser-Leu)酯酶基因(PGSC0003DMG400007815)等在转基因株系中的表达量显著高于非转基因对照,且经NaCl诱导上调表达。用外源物质处理非转基因组培苗并检测差异基因的表达量,结果显示差异表达基因受水杨酸(SA)等多种物质和NaCl诱导表达。说明Sb RFP1可能是通过调控F-box和GDSL酯酶等胁迫相关基因的表达提高马铃薯组培苗的耐盐性。     

苹果磷酸果糖激酶基因MdPFPβ调控果实可溶性糖积累的功能

为阐明苹果（Malus×domestica Borkh.）磷酸果糖激酶基因MdPFPβ(Pyrophosphate-fructose 6-phosphate 1-phosphotransferase subunit beta,基因序列号MD09G1112800)的生物学功能,首先分析了基因启动子和全长序列信息,该基因包含全长为483 bp完整的开放阅读框,编码161个氨基酸。利用PlantCare数据库进行基因启动子顺式作用元件分析发现,MdPFPβ启动子序列中含有与脱落酸（abscisicacid,ABA）、低温及干旱信号相关的调控元件。荧光定量PCR分析发现,MdPFPβ在苹果叶片和成熟果实中表达量较高,并且受外源ABA的诱导表达。在外施ABA的条件下,MdPFPβ过量表达的苹果愈伤组织中可溶性糖含量明显上升。此外,MdPFPβ转基因番茄植株的光合性能增强,MdPFPβ可能通过调控糖代谢酶的活性最终影响果实中的可溶性糖含量。     

非均匀盐胁迫对番茄幼苗耐盐性的影响

为了研究非均匀盐胁迫下番茄幼苗的光合特性和根系生长发育的状况,采用分根水培系统,设置3个总盐胁迫水平（NaCl浓度）处理——无盐胁迫（0）、中度盐胁迫（0.4%）和重度盐胁迫（0.6%）,按照左右两侧根系处于非均匀和均匀胁迫两种方式分成6个处理：T1（0,0）为对照,T2（0.1%,0.3%）,T3（0.2%,0.2%）,T4（0.1%,0.5%）,T5（0.2%,0.4%）,T6（0.3%,0.3%）,测定各个处理下番茄的光合指标、生物量、Na+和K+含量以及根系生长参数等。结果表明：（1）随着盐胁迫的加重,叶片中Na+含量增加,K+含量、光合指标、生物量和根系生长指标均依次降低;（2）在总盐（NaCl）浓度相同时,与左右两侧根系均匀盐浓度胁迫相比,非均匀胁迫下叶片中Na+含量显著降低（P < 0.05),气孔导度（Gs）与均匀胁迫下无显著差异,但净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）均增加,T2比T3处理下的Pn、Tr分别增加了4.88%和3.83%,T4处理下叶片的Pn、Tr分别比T6处理增加了13.51%和8.25%,T5处理下叶片Pn比T6处理增大了7.83%,Tr无显著差异;（3）当总盐浓度一定时,非均匀胁迫比均匀胁迫下两侧根系的总根长、根表面积、根体积以及总干物质量均有所增加。研究结果表明非均匀胁迫较均匀胁迫显著提高了番茄的耐盐性,这为番茄在盐碱地上的生长提供了耐盐胁迫的理论依据。     

转YHem1 番茄植株耐盐性的研究

 YHem1是一个由拟南芥HemA1启动子（一种光响应型启动子）控制的酿酒酵母菌5–氨基乙酰丙酸（ALA）合酶基因（Hem1）。将该基因转化番茄植株,可以提高叶片内源ALA含量及其代谢能力,增加叶绿素含量和抗氧化酶活性,并降低产生速率和丙二醛（MDA）含量。200 mmol ·L^-1 NaCl处理,降低了野生型番茄叶片ALA合成与代谢能力和叶绿素含量,同时诱导叶片产生速率、H₂O₂和丙二醛（MDA）含量上升,而超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）等抗氧化酶活性则逐渐降低。盐胁迫也导致转YHem1番茄ALA合成与代谢能力、叶绿素含量和抗氧化酶活性下降,但其降幅明显低于野生型。盐处理10 d后,转基因番茄植株保持着较高的生物学积累量和较低的盐胁迫抑制程度,说明转入YHem1基因可以提高番茄耐盐性。此外,转基因番茄叶片H₂O₂含量始终保持较高水平,暗示其可能作为一种信号分子参与细胞生理调节。     

丛枝菌根真菌和水杨酸对番茄幼苗耐盐性的影响

以番茄为试材,采用接种丛枝菌根(AM)真菌摩西球囊霉(Funneliformis mosseae)和施用外源水杨酸(SA)的方法,研究了盐胁迫下番茄生长、光合作用、抗氧化物酶活性等的变化,以期为AM真菌与水杨酸在提高番茄耐盐性方面的应用提供理论支持。结果表明:6 g·L^-1 NaCl胁迫下,接种摩西球囊霉、施加外源水杨酸(400μmol·L^-1 SA)或摩西球囊霉和水杨酸联用3种处理均明显增加了番茄根和茎叶的质量,提高了叶绿素含量和气孔导度、蒸腾速率、电子传导速率和光化学猝灭系数等光合指标。接种AM真菌和施加水杨酸提高了抗氧化物酶和超氧化物歧化酶活性,摩西球囊霉和水杨酸提高番茄抗盐性具有明显协同效应。表明接种AM真菌摩西球囊霉配合施用外源水杨酸能协同提高番茄耐盐胁迫。     

番茄耐旱和耐盐遗传改良的研究进展及展望

 就番茄耐旱和耐盐遗传改良的研究进展进行了综述。主要包括番茄耐旱和耐盐的野生资源及其遗传进化,基于基因组的QTL挖掘,QTL的遗传与累加效应,以及利用基因工程转入包括离子运输和区室化、渗透调节、活性氧清除、转录因子、胁迫蛋白等在内的外源基因,提高番茄的耐旱和耐盐性。就目前番茄耐旱和耐盐遗传改良过程中存在的问题与未来的应对策略,包括番茄耐旱和耐盐表型鉴定、全基因组关联分析、基因工程、基因的协同调控、小RNA、表观遗传学等,进行了探讨与展望。     

番茄苗期耐盐性鉴定指标初探

采用50、100、150、200nmol／LNaCl盐溶液4个浓度处理，对耐盐性不同的番茄品系进行胁迫试验。结果表明品系间差异显著，抗（耐）盐性弱的品系长势较弱，株高、茎粗、干物质量下降明显，而抗（耐）盐性强的品系苗长势强，株高、茎粗、干物质量较稳定；同时抗（耐）盐性弱品系的盐害指数显著高于抗（耐）盐性强的品系，而且植株干鲜比变化趋势也与抗（耐）盐性强的品系明显不同。经筛选，植株的盐害指数、株高、茎粗、干物质量、根系与地上部干鲜比可以作为鉴别番茄耐盐性大小的指标，同时，NaCl胁迫溶液浓度选用100～150mmol／L效果较好。     

嫁接对番茄产量、品质及耐盐性影响的综合评价

以‘佳西娜74-112’番茄自根嫁接植株及其与8种砧木嫁接植株为试材,研究盐胁迫下不同砧木对番茄生长、产量、品质、钾钠离子吸收与分配、光合作用等的影响,采用隶属函数法进行综合评价。结果表明,虽然盐胁迫降低了生长势和产量,但却显著提高了果实品质。嫁接植株生长势、产量、品质和耐盐性因砧木不同而显著不同。采用‘西方番茄砧木’嫁接进行耐盐栽培,比对照条件下自根嫁接番茄产量降低32.3%,但比盐胁迫栽培的自根嫁接番茄产量提高37.7%,且对果实品质的负面影响相对较小,表现出最强的综合优势。采用隶属函数法将多项指标进行综合排序,提出了一套可应用于番茄耐盐砧木筛选的分析流程,有望为盐碱地土壤的综合开发利用提供参考。     

‘寒富’苹果与其同源四倍体耐盐差异研究

以含有200 mmol·L-1 NaCl的1/2 Hoagland营养液处理‘寒富’二倍体苹果及其同源四倍体幼苗8 d,分别在处理0、2、4、6和8 d时进行叶片相关生理指标及水通道蛋白相关基因表达水平的测定,比较分析两者的耐盐性差异。结果表明:盐胁迫下四倍体的形态表现优于二倍体;四倍体和二倍体的叶片相对含水量一直在下降,二倍体下降幅度大于四倍体,丙二醛含量和脯氨酸的积累随胁迫时间的延长而增加,二倍体含量始终高于四倍体;NaCl处理8 d时,二倍体的叶片相对含水量比四倍体低8%,丙二醛含量比四倍体多4.466 nmol·g-1FW,脯氨酸含量为四倍体的1.18倍;盐胁迫下两者叶片中水通道相关蛋白基因Md PIP1;1、Md PIP2;1、Md TIP1;1和Md TIP2;1的表达量均出现先下降后上升趋势,且四倍体均高于二倍体,尤其在处理24 h时差异最显著。四倍体比二倍体具有更强的耐盐性,可能与盐胁迫下四倍体相关水通道蛋白基因表达水平较高有关。     

盐胁迫对番茄种子萌发及叶片中丙二醛含量的影响

通过不同浓度的盐溶液(0、50、100、200mmol/L)对番茄种子以及植株进行盐胁迫处理,研究盐胁迫对番茄种子萌发及番茄成熟植株叶片中丙二醛含量的影响。结果表明:50mmol/L的NaCl溶液就能够抑制番茄种子的发芽率,100mmol/L和200mmol/L NaCl溶液状态下,番茄种子的发芽几乎完全被抑制,随着盐浓度的增加,番茄植株丙二醛含量成上升趋势,说明受到盐害加重。     

盐胁迫对番茄生长和果实品质的影响

为探索适宜高品质番茄栽培的盐胁迫浓度,试验通过调节番茄结果期营养液的电导率(EC值分别设为2.5、3.5、4.5、5.5 mS/cm),比较了不同盐胁迫处理对番茄长势、果实品质和产量的影响。结果表明:营养液EC值在3.5～5.5 mS/cm范围内,番茄果实的可溶性固形物、可溶性糖、VC和番茄红素含量均呈上升趋势,可滴定酸依次下降,且在4.5～5.5 mS/cm范围内,667 m~2产量均比对照增加;因此,通过NaCl进行盐胁迫有利于改善番茄口感和营养品质,适宜EC值范围为4.5～5.5 mS/cm。     

抗盐锻炼对盐胁迫下樱桃番茄幼苗成活率及生理特性的影响

针对盐碱地对番茄幼苗移栽后定植生产的严重迫害现象,以"美味"樱桃番茄为试材,设置对照组、抗盐锻炼组与非抗盐锻炼组处理,研究了不同时间循序渐进施用不同递增盐(NaCl)浓度对樱桃番茄幼苗存活率及其抗性生理指标的影响,以期为突破樱桃番茄建植在盐碱环境中成活率低、生长发育不良等难题提供有效解决途径和参考依据。结果表明:相比于非抗盐锻炼组,抗盐锻炼组处理有效地提高了樱桃番茄幼苗移栽到盐碱地的成活率(33.32%);同时抗盐锻炼有效的提高了樱桃番茄幼苗中脯氨酸含量和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)的活性,降低了丙二醛(MDA)的积累量。说明抗盐锻炼通过提高渗透调节物质的含量和抗氧化酶活性,并降低细胞膜氧化损伤以缓解盐碱地对樱桃番茄幼苗的毒害作用,促进了生长。除此,该试验发现低盐浓度比高盐浓度范围锻炼效果更好,以50～150 mmol·L^-1 NaCl范围最适宜,且浓度梯度差值以25mmol·L^-1 NaCl递增更为优越。