猪瘟病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

为了建立快速检测猪瘟病毒(CSFV)环介导等温扩增(LAMP)方法,试验利用Primer Explorer4.0(https://primerexplorer.jp/)针对CSFV的NS3基因设计LAMP引物,并对LAMP反应体系、反应条件进行优化,评定其特异性和敏感性。结果表明:该方法可在65℃、50 min内快速扩增CSFV,扩增结果可通过可视的颜色判断;LAMP反应对猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等无交叉反应,其检测CSFV的最低浓度为13.6 fg/μL,对临床样品的检出率高于RT-PCR技术。说明LAMP方法灵敏、准确,操作快速、方便,可用于猪瘟的临床诊断。     

小反刍兽疫病毒RT-LAMP检测方法的建立

利用逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)建立了小反刍兽疫病毒快速检测方法,同时评价了该方法的灵敏性和特异性。结果表明,根据小反刍兽疫病毒N基因保守区域设计的LAMP引物能够在63℃恒温下,1小时内实现目的核酸的大量扩增,由于在检测前加入荧光指示试剂,检测结果可以直接用肉眼判断,避免了由于开盖检验带来的扩增产物污染导致的假阳性。该检测体系具有较高的特异性,只能特异性地检测目的病毒,与其他同属的病毒或类似病毒等无交叉反应;具有较高的检测灵敏度,比普通RT-PCR灵敏性高10倍,与荧光RT-PCR的灵敏度相当。     

犬瘟热病毒N基因环介导等温扩增检测方法的建立

为建立犬瘟热病毒(CDV)环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究根据GenBank中CDVN基因保守序列设计合成了2对LAMP引物,内引物FIP、BIP和外引物F3、B3。以CDVN基因重组质粒(pMD-CDV-N)为模板,经反应条件优化、特异性试验、敏感性试验及临床样品检测。检测结果显示,该方法于61℃水浴60min即可完成反应,最低检出量为70个拷贝,比RT-PCR灵敏10倍。该检测方法仅对CDV产生阳性扩增,而对狂犬病毒,犬细小病毒,犬腺病毒Ⅱ型扩增结果均为阴性。用建立的LAMP方法检测临床样品,检测结果与RT-PCR检测结果一致。本方法简便,特异,有利于CDV的临床检测。     

非洲猪瘟病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

本试验利用环介导等温扩增技术（LAMP）建立了一种快速高效检测非洲猪瘟病毒的方法。整个反应在水浴锅中恒温进行,不需要其他昂贵仪器,30 min即可得到阳性结果,灵敏度是OIE标准PCR方法的100倍,并且与其他常见猪DNA病毒无交叉反应。该方法非常适合在野外现场或缺乏试验条件的边远地区检测非洲猪瘟病毒。     

黑蜂王台病毒环介导等温扩增检测方法的建立

为建立一种快速检测蜜蜂黑蜂王台病毒(BQCV)的环介导等温扩增方法(LAMP),本研究根据Gen Bank中登录的BQCV-JL1株基因序列(KP119603.1)设计了多套LAMP引物,通过引物筛选,反应体系和反应条件优化,建立了可视化LAMP方法,并且评价了该方法的特异性、敏感性、重复性和稳定性。结果显示,建立的LAMP方法在63℃下可对BQCV核酸进行高效扩增,可视化判定结果与real-time Turbidimeter仪检测结果一致;该方法具有较强的特异性和较高的敏感性(最低检出限量为4.0×102拷贝/μL),为普通PCR的100倍。临床样品检测结果表明LAMP法检出率高于常规PCR。本研究建立的可视化LAMP方法操作简便,适用于BQCV的快速检测。     

羊口疮病毒环介导等温扩增高效检测方法的建立

羊口疮(ORF)的快速诊断对于该病的防控至关重要,而环介导等温扩增(LAMP)技术可以满足对羊口疮病毒(ORFV)高效性的现场检测需求。本试验对ORFVVIR基因扩增,通过优化反应条件,对LAMP检测ORFV进行了显色反应、特异性和灵敏性的检测,并进行了后续的临床检测。结果显示,利用优化的LAMP染色法,将呈现绿色的阳性组与橙色的阴性组区分开。对扩增的质粒和阳性对照样品的检测呈现出了阳性条带,而对山羊痘、绵羊痘、牛传染性鼻气管炎和牛副流感3型病毒的检测并无阳性条带。优化的LAMP检测ORFV的灵敏度比传统PCR高出1 000倍。对15份临床样品检测的结果表明,优化的LAMP电泳和染色法对ORFV的检出率均为100%,与传统PCR检测结果相一致。上述结果表明优化的LAMP对ORFV的检测具有特异性、高灵敏性且更加方便等优点,从而更适用于现场的高效检测。     

猪巨细胞病毒环介导等温扩增方法的建立

根据GenBank已登录的猪巨细胞病毒(Porcine cytomegalovirus,PCMV)gB基因的DNA序列设计合成4对特异性引物,通过优化反应条件,以及敏感性、特异性检测,建立了猪巨细胞病毒的环介导等温扩增检测方法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP);用建立的检测方法对2013年来自四川省雅安、成都、绵阳、眉山、乐山、德阳、遂宁、资阳等市的136份病料进行猪巨细胞病毒检测,将检测结果与常规PCR方法检测结果进行比对。结果显示,本试验建立的方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,是常规PCR的10倍;136份病料用LAMP检测,其中有89份样品为猪巨细胞病毒阳性,其阳性率与常规PCR方法检测的阳性相符率为100%。结果表明,本试验成功建立了PCMV的LAMP检测方法,可用于临床上PCMV感染猪的确诊,对PCMV的快速诊断、综合防控等具有重要意义。     

猪细环病毒2型环介导等温扩增检测方法的建立

为了能快速、特异的检测猪细环病毒2型(TTSuV2),本研究针对TTSuV2全基因序列的非编码区域和第1个开放性阅读框前端设计了2对引物,建立了TTSuV2的环介导等温扩增(LAMP)检测方法并对反应成分和条件进行了梯度摸索。试验结果显示,该LAMP检测方法最佳反应条件为64 ℃恒温90 min,可特异性检测TTSuV2,与猪细环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪博卡病毒无交叉反应,病毒最低检出限为100拷贝/μL。结果表明,建立的LAMP方法具有快速、特异且灵敏的特点,可在TTSuV2快速检测方面提供一定的技术支持。     

羊痘病毒环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立

为建立羊痘病毒(CaPV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究根据GenBank中羊痘病毒的保守基因序列,设计出针对羊痘病毒的LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪优化得到病毒核酸等温扩增最佳条件是62 ℃恒温反应60 min。在此条件下,病毒核酸的最低检测含量为3.1×10^-2 pg/μL,灵敏度比OIE推荐的PCR方法高10⁴倍。添加钙黄绿素(calcein)建立的目测法,还可实现对上述病原体检测结果肉眼观察。本研究获得的CaPV LAMP仪器法和目测法可特异性地扩增羊痘病毒属的山羊痘病毒、绵羊痘病毒及牛疙瘩皮肤病病毒核酸,具有反应快速、特异性强、灵敏度高、操作简便、设备要求低等特点。     

犬细小病毒环介导等温扩增快速检测方法的初步建立

为建立犬细小病毒(CPV)环介导等温扩增(LAMP)检测方法,实现CPV的早期快速诊断,本研究根据GenBank登录的CPV VP2基因序列,在其序列保守区域设计LAMP引物,利用CPV基因组DNA为模板进行扩增。结果表明:LAMP方法检测灵敏度达到10-1TCID50/mL;并且与其它细小病毒等无特异性扩增,表现出良好的特异性。与PCR技术相比,LAMP法操作更加简单方便,更适合基层和实验室的快速检测。     

RT-PCR检测小反刍兽疫病毒核酸方法的建立

本研究结果显示,在我国实际应用中,先用基于扩增核蛋白基因的普通PCR进行筛选,再用巢式PCR进行排除和鉴定,是为快速、准确、经济的方法。     

环介导等温扩增技术快速检测犬细小病毒方法的建立

旨在建立一种利用环介导等温扩增技术(LAMP)检测犬细小病毒感染的新方法。根据Gen-Bank中犬细小病毒(CPV)VP2基因序列,设计4条LAMP特异性引物,对反应条件、特异性、敏感性、可视化效果和应用效果进行研究。结果显示,在65℃等温条件下、1h内可完成LAMP扩增过程;病毒的最低检出限量为10-2个TCID50/mL;特异性和可视效果良好;对36份临床标本进行检测,阳性检出率为80.5%(29/36),检出率高于普通PCR 72.2%(26/36)。建立的LAMP检测方法,显示了较高的特异性和敏感性,而且兼具高效、快捷、可视化的优势,为临床检测犬细小病毒感染提供了一种快速简便的新方法。     

锦鲤疱疹病毒环介导等温扩增检测方法的建立

为建立一种快速检测锦鲤疱疹病毒(CyHV-3)的环介导等温扩增方法(LAMP),本研究根据Gen Bank中登录的CyHV-3 Sphi基因编码区序列设计了LAMP特异性引物,经反应体系和反应条件优化,建立了检测CyHV-3的LAMP方法。结果表明,本研究建立的LAMP检测方法与鲤痘疱疹病毒、金鱼造血器官坏死病病毒和鳗鱼疱疹病毒均无交叉反应,特异性强;最低检出率为13.9拷贝/μL,灵敏度高。使用LAMP方法和普通PCR方法对四川地区的15个检测点采用鱼鳃拭子非致死性采集的临床样品进行检测,阳性检出率均为31.40%(27/86)。表明本实验建立的该检测方法具有高灵敏度、高特异性、快速和简便的特性,适用于临床上对锦鲤疱疹病毒病的快速诊断。     

弓形虫环介导等温扩增快速检测方法的建立

为了建立弓形虫的快速检测方法,本研究建立了一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法——环介导等温扩增技术(LAMP)。用10倍系列稀释的DNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试,同时通过对扩增产物做内切酶验证;为证明LAMP技术的特异性,对新孢子虫、附红细胞体、瑟氏泰勒虫等病原体进行检测。结果显示:利用LAMP技术成功检测到弓形虫基因区,此方法的灵敏度可达到能检测5个拷贝DNA分子水平,酶切分析结果正确,并且特异性强,对新孢子虫、附红细胞体、瑟氏泰勒虫等病原体检测均为阴性。说明LAMP技术可应用于弓形虫的快速检测。     

检测蜜蜂囊状幼虫病毒环介导等温扩增技术的建立

为建立一种快速检测蜜蜂囊状幼虫病毒(SBV)的环介导等温扩增方法(LAMP),本研究根据SBV-UK株多聚蛋白基因序列(AF092924.1)设计了4条特异性引物,通过LAMP real-time Turbidimeter仪对SBV的反应体系和反应条件进行检测和实时监控,并评价其特异性、敏感性、重复性和稳定性。结果显示,在63℃恒温扩增40 min后,仅SBV核酸扩增,而其他病毒均呈阴性。反应结束后在反应体系中加入SYBR Green I的可视化判定结果与real-time Turbidimeter仪检测结果一致;该方法具有较强的特异性和较高的敏感性,其最低检出量为3.2×10~1拷贝/μL,是普通PCR的100倍;对同一批次和不同批次提取的SBV核酸进行扩增,结果表明重复性和稳定性良好;临床样品检测结果表明LAMP法与常规PCR法检测结果一致。本研究建立的LAMP方法操作简便,适用于SBV的快速检测。     

猪流行性腹泻病毒环介导等温扩增检测方法的建立及应用

试验旨在建立一种快速检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）的环介导等温扩增方法（LAMP）,为诊断PEDV提供简便、敏感、准确可靠的工具。参考GenBank中PEDV基因序列（登录号：KT799997）,针对PEDVN基因设计了6条引物,对所建立的LAMP反应体系、反应温度进行优化,建立可特异性扩增PEDV的LAMP方法。结果显示,本试验成功建立了PEDV LAMP检测方法,在60℃恒温下反应60 min,能特异性地检测PEDV,检测限量为91拷贝/μL,比常规PCR方法的敏感性高100倍。对比75份临床样本的LAMP和常规RT-PCR法检测结果,显示两种方法符合率为97.3%。综上所述,本试验建立的LAMP方法具有特异性强、敏感性高,操作简单,设备要求低的特点,适用于PEDV临床样本的快速检测。     

猴免疫缺陷病毒实时荧光环介导等温扩增快速检测方法的建立

以猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus,SIV)的核心蛋白Gag区域的部分保守基因序列为检测靶标,通过软件设计内、外引物和环引物,借助恒温荧光扩增仪建立SIV实时荧光环介导等温扩增快速检测方法(real-time loop-mediated isothermal amplification,Realamp),根据有无S型扩增曲线判断检测结果。Realamp方法对含有猴免疫缺陷病毒目标片段的质粒标准品的检测灵敏度为300 copies/μL,对猴类的其他常见病原如猴D型逆转录病毒、猴T淋巴细胞趋向性病毒、猴B病毒等无非特异性扩增。通过33份临床样本的检测,Realamp检出的阳性2例,qPCR检出的阳性率为1例,两种检测方法的符合率为97%。本研究建立的Realamp检测技术所需设备简单、反应效率快、检测灵敏度高和特异性强,可用于偏远地区猴养殖单位相关病原的检测。     

反转录环介导等温扩增技术快速检测猪水疱病毒方法的建立

为了建立一种针对猪水泡病毒(SVDV)的反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),用于减少猪水泡病与口蹄疫因临床症状相似而造成的误诊,试验针对SVDV VP1基因序列设计4个LAMP引物,其中外侧引物用于SVDV PCR检测,并利用RT-LAMP和RT-PCR方法进行敏感性试验、特异性试验以及临床样品检测。结果表明:针对SVDV的RT-LAMP检测方法的敏感性是RT-PCR的10倍; RT-LAMP方法的特异性良好,与口蹄疫病毒无交叉反应;两种方法对临床样品检测的符合率为100%。说明试验建立的RT-LAMP方法具有敏感性高、特异性强、快速等特点,适合实验室和临床对SVDV的快速诊断。     

水貂阿留申病毒环介导等温扩增（LAMP）检测方法的建立

为建立一种简便、快速、特异的水貂阿留申病毒（ADV）检测方法,根据GenBank中已登录的ADV基因组序列,选择水貂阿留申病毒VP2基因作为靶基因,设计并合成5套环介导等温扩增（LAMP）反应所需的引物,通过试验筛选出最佳引物,并进行最佳引物的特异性及敏感性试验,建立了LAMP快速检测方法。试验结果表明,该方法比普通PCR方法灵敏性高10倍,与其他的水貂源病毒不发生非特异性反应,并且具有良好的重复性。利用建立的LAMP检测方法对30份临床样品的阳性检出率为6.7%。该方法简便快速,为水貂阿留申病的检测提供了新的发展方向,有望成为简易的常规检测手段,尤其适用于基层应用。     

牛瑟氏泰勒虫环介导等温扩增检测方法的建立

为建立快捷、灵敏的牛瑟氏泰勒虫(T.sergenti)检测方法,本研究以感染牛T.sergenti的阳性血液为试验材料,建立了牛T.sergenti P33表面蛋白基因环介导等温扩增(LAMP)检测技术,并优化了LAMP的各反应条件,进行了敏感性和特异性试验。结果显示,扩增产物经显色、电泳、酶切鉴定后,LAMP方法扩增牛T.sergenti产物检测管显色后呈阳性反应,最低检测量为2.3fg/μL模板DNA,比普通PCR高10倍,牛T.sergenti LAMP产物电泳后呈特征性梯状条带,而弓形虫等对照组均无扩增条带。说明本研究建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速等优点,适合于牛T.sergenti的检测。