■NPR1同源基因全长cDNA的分离与表达分析

NPR1是水杨酸诱导抗病基因表达的重要调控因子之一,主要作用于水杨酸信号转导途径的上、下游。采用稀释池PCR法,筛选■(Prunus salicina var. cordata)叶片全长均一化cDNA文库,分离■叶片NPR1同源基因的全长cDNA;用不同浓度的水杨酸喷施一年生■嫁接苗嫩叶,采用荧光定量PCR技术检测所获得的NPR1同源基因的表达量差异。试验结果表明,共获得了4个NPR1同源基因的全长cDNA,分别命名为PsNPR1、PsNPR3.1、PsNPR3.2和PsNPR3.3,其长度分别为2 442、1 827、2 244和2 615 bp,其ORF长度分别为1 788、1 770、1 767和1 782 bp,分别编码596、590、589和594个氨基酸的蛋白质;氨基酸序列比对结果表明,■这4个NPR1同源基因的编码区均含有BTB/POZ和ANK两个保守域及核定位信号(NLS);PsNPR1与拟南芥的AtNPR1和At NPR2聚为一簇,PsNPR3.1、PsNPR3.2和PsNPR3.3与拟南芥的AtNPR3和At NPR4聚为另一簇。PsNPR1在喷施1.0 mmol·L^-1水杨酸的叶片中表达量最高;PsNPR1、PsNPR3.1、PsNPR3.2在响应1.0 mmol·L^-1水杨酸诱导过程中表达量持续上升,30h表达量最高,之后呈下降趋势,因此,水杨酸诱导抗病基因高表达的最佳处理浓度为1.0 mmol·L^-1,最佳响应时间为30 h。     

水杨酸对梨SOD、PPO 同工酶和NPR1 表达的影响

 以鸭梨（Pyrus bretschneideri‘Yali’）为试材,研究外源水杨酸处理后梨叶片中内源水杨酸（SA）及超氧化物歧化酶（SOD）、多酚氧化酶（PPO）同工酶的变化特点以及病程相关基因非表达子1（NPR1）对水杨酸的早期应答反应。结果表明：水杨酸处理后梨叶片中内源SA含量升高,其中游离态SA含量随处理浓度增大而逐渐升高,但均显著低于对照;结合态SA随处理增大而逐渐降低,但均显著高于对照。SOD、PPO同工酶酶谱分析结果显示,水杨酸处理后酶谱带表达量增强。接种病菌试验表明,0.200 mmol · L^-1 SA可以诱导梨增强对轮纹病的抗性,且诱导处理过的叶片受到病菌侵染时SOD、PPO酶活性增强。实时荧光定量PCR分析表明,0.200 mmol · L^-1 SA诱导后梨叶片中NPR1表达量明显升高,但NPR1在茎中的表达受到抑制。     

日本晚樱花器官特征基因ClAP1的克隆与表达分析

用同源克隆的方法和3′ RACE技术,从日本晚樱（Prunus lannesiana）中克隆得到了1个AP1同源基因ClAP1的cDNA全长。其cDNA全长1 005 bp,包括1个编码238个氨基酸共717 bp的开放阅读框。序列比对和分子系统发生分析表明,ClAP1是拟南芥的AP1同源基因,其蛋白质的C末端具有一个保守的euAP1模体。半定量RT-PCR分析表明,ClAP1在3个日本晚樱品种‘大岛’、‘一叶’和‘普贤像’的萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊中均有表达,在叶中不表达,属参与花发育的转录因子,但其表达模式与拟南芥的AP1有一定差别。     

白菜病程相关蛋白1基因cDNA全长的克隆与分析

 以水杨酸处理后的‘苏州青’白菜为材料, 通过RT2PCR和RACE技术, 获得了白菜病程相关蛋白PR-1基因的cDNA全长序列。该基因与甘蓝型油菜PR-1基因氨基酸序列的同源性为91% , 与拟南芥的同源性为78% , 与其它植物的同源性为57%～60%。Southern杂交表明该基因在白菜基因组中的拷贝数至少为2个。半定量RT2PCR分析表明, 2 mmol/L的水杨酸处理后12 h, 该基因的表达量达到高峰。     

杜梨类钙调磷酸酶B亚基蛋白PbCBL10基因的克隆和表达特性研究

【目的】为了探明杜梨类钙调磷酸酶B亚基蛋白(Calcineurin B-like protein,CBL)基因的序列特征和表达特点,【方法】以杜梨幼苗为试材,运用同源克隆和半定量RT-PCR对PbCBL10基因进行克隆和表达分析。【结果】结果表明,PbCBL10基因编码区cDNA长度为801 bp,编码的多肽由266个氨基酸组成。该多肽预测的等电点为4.56,估计的相对分子质量为30.45 ku。其对应基因组DNA序列长1 983 bp,包括9个外显子和8个内含子。通过PSORT进行亚细胞定位分析发现PbCBL10蛋白位于质膜上的几率最大。PbCBL10基因编码的多肽具有4个钙离子结合域EF手形结构和1个钙调磷酸酶A亚基结合位点。PbCBL10与番茄SlCBL10(NP_001239045)和拟南芥AtCBL10(NP_195026)蛋白间的同源性较高,分别为82%和77%,并与AtCBL10亲缘关系最近。PbCBL10基因在杜梨幼苗根、茎和叶片中均为诱导型表达,50~200 mmol.L-1CaCl2、20μmol.L-1ABA、100 mmol.L-1NaCl、10%(w/v)PEG6000或180 mmol.L-1甘露醇处理后其表达量明显上调。【结论】PbCBL10基因具备植物CBL基因家族的固有特征,能够响应胞内钙浓度变化,对ABA、盐碱、干旱和渗透胁迫均存在转录响应。     

唐菖蒲茉莉酸生物合成关键酶基因LOX1的克隆及表达分析

 以唐菖蒲（Gladiolus hybridus）品种‘Rose Supreme’的球茎为试材,通过RT-PCR和RACE技术克隆到了一个全长为2 797 bp的茉莉酸（Jasmonic acid,JA）生物合成关键酶LOX基因的cDNA序列,命名为GhLOX1,属于9-LOX。该序列含有一个2 541 bp的开放阅读框（ORF）,编码846个氨基酸,推导的蛋白质分子量为94.90 kD。RT-PCR表达分析表明,该基因在唐菖蒲叶、花、根、匍匐茎、新球茎和籽球上都表达,而在叶和匍匐茎中表达量最高,在花和籽球中表达量较低;离体条件下,经过0、0.1、0.5、1.0、2.0 mmol · L^-1的不同浓度梯度的水杨酸（SA）处理后,其表达水平随着浓度的升高而降低,当SA浓度达到2.0 mmol · L-1时没有表达。     

荔枝AP1同源基因在花芽中表达最多

据《园艺学报》2011年第12期《荔枝APETALA1（AP1）同源基因cDNA全长克隆及其表达研究》（作者丁峰等）报道，应用RT—PCR方法克隆得到荔枝AP1同源基因cDNA全长，     

异源表达唐菖蒲GhOPR3 提高了拟南芥的抗逆性

 通过RT-PCR 与RACE 技术从唐菖蒲（Gladiolus hybridus）品种‘Rose Supreme’球茎中克 隆茉莉酸生物合成途径中的关键酶——12–氧–植物二烯酸还原酶（12-oxo-phytodienoic acid reductase， OPR）基因的1 489 bp 全长cDNA 序列，quantitative RT-PCR 结果表明，GhOPR3 在唐菖蒲叶、花、根、 匍匐茎、新球茎和籽球中都表达，其中在籽球和匍匐茎中相对表达量较高；0.1 ~ 0.5 mmol · L-1 的茉莉酸 甲酯（Methyl jasmonate，MJ）处理后，提高了GhOPR3 在球茎中的表达量和内源MJ 含量；采用农杆菌 介导侵染拟南芥花粉，进行GhOPR3 基因的过表达分析，过表达拟南芥株系较野生型提高了耐盐性和抗 旱性；提高了机械损伤后相关基因的表达水平和内源MJ 含量。     

桃PpSnRK1蛋白激酶对植株根系生长的影响

为探讨桃PpSnRK1蛋白激酶对植株根系生长的影响,以桃[Prunuspersica(L.)Batsch]实生苗为试材,通过外源施加水杨酸(SnRK1促进剂)和海藻糖(SnRK1抑制剂)调节植株体内Sn RK1活性,观测其对植株根系构型及活力的影响。从桃叶片克隆到PpSnRKα(Ppa004347m)目的基因,通过农杆菌介导遗传转化获得超表达PpSnRKα拟南芥植株,以T3代纯合株系为试材,观测PpSnRKα对拟南芥根系构型及根系中生长素合成和转运基因表达的影响。结果表明,无论是瞬时还是长期施加水杨酸,桃幼苗根系PpSnRK1α表达量与SnRK1酶活性都上调,且促进了根系生长,提高了根系活力,而施加海藻糖后抑制了根系生长和根系活力,当同时施加水杨酸+海藻糖(1︰1,体积比)后,SnRK1酶活性及PpSnRK1α表达量介于上述两个处理之间,且部分缓解了海藻糖对根系生长的抑制作用。通过观察超表达PpSnRKα拟南芥4-1、4-2、4-3纯合株系的根系可知,SnRK1可以增加根系的长度和密度,特别是增加了侧根的数量;通过RT-qPCR技术分析,超表达PpSnRKα拟南芥的3株纯合株系根系中,无论是生长素合成相关基因(AtTAA1、AtYUC2、AtYUC6),还是生长素运输相关基因(AtPIN1、AtPIN2、AtPIN3)表达量相比野生型均明显上调,且外施0.1 mg·L-1 IAA的野生型株系与3株超表达PpSnRKα拟南芥纯合株系的根系表型相似,根系密度、长度及侧根数量增加,说明SnRK1对植株根系构型的影响与生长素信号途径密切相关,其可以正向调控生长素的合成与转运,进而正向调控根系生长,特别是侧根生长。     

赤霉素、水杨酸、柠檬酸和蔗糖对灰毛黄栌叶色变化的影响

 2011 年秋,选取长势一致的4 年生灰毛黄栌（Cotinus coggygria var. cinerea Engl.）组培苗, 喷施不同浓度的赤霉素（GA3）、水杨酸、柠檬酸和蔗糖水溶液,研究其对叶色的影响。结果表明,使用 浓度为0.01 mmol · L-1 的赤霉素处理可以推迟灰毛黄栌的落叶期,从而使叶片观赏期平均延后5 d;用浓 度为0.5 mmol · L-1 的水杨酸处理,会使叶片观赏期平均推迟7 d,而浓度为1.0 mmol · L-1 的水杨酸处理, 叶片的观赏期平均提前了3 d;喷施4.8 mmol · L-1 的柠檬酸和200.0 mmol · L-1 的蔗糖溶液,都能显著提高 灰毛黄栌叶片中花青素的相对含量,使叶片更红,并且使叶片的观赏期分别提前了6 d 和9 d。     

拟南芥中异源过表达黄瓜CsTRY基因对表皮毛的抑制作用

 将拟南芥表皮毛调控基因TRIPTYCHON（TRY）、CAPRICE（CPC）以及ENHANCER OF TRY AND CPC1（ETC1）的序列信息,在黄瓜基因组数据库中进行BLAST比对后发现,它们都对应于黄瓜中的同一个基因CsTRY。异源过量表达黄瓜CsTRY导致拟南芥叶片表皮毛大量减少,且使拟南芥中表皮毛起始基因GLABRA2（GL2）的表达量显著下降,表明黄瓜CsTRY基因与拟南芥TRY基因可能具有功能上的保守性,通过阻碍GL1-GL3/EGL3-TTG1三聚体复合物的形成来降低GL2的表达,从而抑制表皮毛的形成。     

苹果生长素阻遏蛋白基因MdIAA26的分子克隆与功能鉴定

从‘皇家嘎拉’苹果（Malus × domestica Borkh.）中克隆了一个生长素阻遏蛋白家族基因（基因序列号MDP0000164095）。测序发现,该基因包含长为978 bp完整的开放阅读框,编码325个氨基酸。系统进化树分析表明,这一生长素阻遏蛋白与拟南芥IAA26同源序列相似性最高,因此将该基因命名为MdIAA26。利用PlantCare数据库进行基因启动子顺式作用元件预测分析发现,MdIAA26启动子序列中含有与脱落酸（ABA）、赤霉素（GA）、水杨酸（SA）及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdIAA26在苹果的各组织中均有表达,在根和叶片中表达量相对较高;苹果组培苗中MdIAA26的表达明显受到ABA和IAA的诱导。MdIAA26过量表达的苹果愈伤组织在外源ABA处理下和MdIAA26异位表达拟南芥在外源ABA、PEG和IAA处理条件下,生长势均明显比野生型对照强,表明MdIAA26降低了对ABA和IAA的敏感性和对干旱的抗性。     

切花菊‘神马’细胞分裂素合成酶基因DgIPT3参与侧枝发育的功能分析

 利用RACE方法,从菊花（Chrysanthemum morifolium）‘神马’中分离得到细胞分裂素合成异戊烯基转移酶基因的全长cDNA序列,命名为DgIPT3,基因登录号为JQ711176。序列分析结果表明,DgIPT3的cDNA全长为1 171 bp,开放阅读框ORF编码331个氨基酸,具有IPT家族典型的ATP/GTP结合位点MGATGTGKS。系统进化分析显示,DgIPT3与毛果杨（Populus trichocarpa）的PtXP02321061亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,DgIPT3在菊花根、茎、叶中均有表达,其表达量为叶 > 茎 > 根。瞬时转化拟南芥（Arabidopsis thaliana）原生质体表明DgIPT3蛋白定位于细胞质中。过表达DgIPT3异源转化野生型拟南芥,莲座侧枝明显增多,表明DgIPT3可能是参与菊花侧枝形成的关键基因。     

唐菖蒲茉莉素受体基因GhCOI1的克隆与表达分析

通过RACE技术在唐菖蒲(Gladiolus hybridus)品种‘Rose Supreme’的籽球苗叶片中克隆得到茉莉素受体COI1基因的c DNA序列,命名为Gh COI1。该基因全长为2 603 bp,包含一个编码613个氨基酸的开放阅读框,5′utr和3′utr分别为484 bp和277 bp,预测的蛋白质分子量为69.46 k D;其氨基酸序列具有典型的F-box基序和LRRs结构域。同源比对和系统进化树的分析结果表明,Gh COI1与番茄Le COI1氨基酸序列的相似性最高,达到64.3%;与水稻Os COI1的亲缘关系最近。利用实时荧光定量PCR分析基因表达的结果表明,Gh COI1在唐菖蒲叶片中的相对表达量最高,根中其次,匍匐茎、新球、籽球、花瓣、雄蕊、雌蕊里中的相对表达量较低,推测在唐菖蒲中存在器官专一性表达的COI1同源基因。采用0.05、0.1和0.5 mmol·L-1 Me JA喷施处理唐菖蒲叶片,检测到施用0.1 mmol·L-1 Me JA可显著上调Gh COI1的表达。同时伴随此浓度Me JA处理时间的增加,12 h内Gh COI1的表达量呈现先上升再下降后上升的趋势。洋葱表皮细胞瞬时表达结果表明Gh COI1蛋白定位于细胞质和质体中。本研究中初步验证了Gh COI1在茉莉素信号途径中的作用。     

茄子花药开裂相关基因SmDAD1启动子的克隆及功能分析

以茄子‘F142’为材料,通过染色体步移法克隆了花药开裂相关基因SmDAD1上游746 bp的启动子序列。通过生物信息在线软件预测,该启动子中含有多个与植物发育及逆境应答相关的顺式作用元件。为进一步分析SmDAD1启动子的功能,构建prSmDAD1::GUS融合表达载体,转化到拟南芥,并对T3代纯合转基因拟南芥进行GUS染色分析。结果表明,SmDAD1启动子在拟南芥幼苗的根部、叶片和花药均有较强活性,其中在根部活性最强,在茎中没有活性。检测转基因植株GUS基因的表达量发现,SmDAD1启动子受茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)、赤霉素(GA)、生长素(IAA)和1–氨基环丙烷–1–羧酸(ACC)诱导。因此推测SmDAD1可能在茄子发育和抗外界逆境胁迫中起重要作用。     

基于EST库的枳APETALA2基因cDNA克隆及其表达分析

 根据物种间同源基因相对保守的特点,利用生物信息学方法以拟南芥APETALA2 cDNA序列作为模板,对柑橘EST数据库进行同源检索筛选,克隆了柑橘APETALA2基因的cDNA序列,并以枳[Poncirus trifoliata (L.) Raf.]花cDNA为模板,根据以上cDNA序列设计特异引物,利用RACE技术分别获得该基因的5'和3'末端,序列拼接后获得枳的APETALA2 cDNA全长。该cDNA全长为1 980 bp,命名为Pt-AP2。Pt-AP2核苷酸序列有一个1 539 bp完整的开放读码框(ORF),5'末端起始密码子ATG其始于290 bp,3'末端非翻译区为152 bp,其中含有27 bp的Ploy⁺(A)。该基因已在GenBank基因数据库注册,注册号为EU883665。推导该cDNA编码512个氨基酸,与苹果、矮牵牛和拟南芥中相应序列同源性分别为59.1%,59.7%和63.8%。序列分析表明, Pt-AP2除了具备完全保守的核定位信号序列（KKSR）外,还具有两个高度保守的重复序列即AP2结构域。分别采用半定量RT-PCR和SYBR Green I实时定量RT-PCR方法分析Pt-AP2在枳叶、茎、根、花和果等不同器官中的表达水平,结果一致表明Pt-AP2在各个器官中的表达水平不同, 花中的表达量最高,果实中的表达量最低。     

茶树亚硝酸还原酶基因CsNiR的克隆及表达分析

以‘龙井43’茶树叶片的cDNA为模板,利用RT?PCR技术克隆了茶树亚硝酸还原酶基因（CsNiR）,得到完整的ORF全长为1 764 bp,编码587个氨基酸;所推导的氨基酸序列与垂枝桦（Betula pendula）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、菠菜（Spinacia oleracea）和水稻（Oryza sativa）的同源性均大于76%。生物信息学分析表明,CsNiR分子量为68.648 kD,等电点为6.12,为亲水性的非分泌蛋白;二级结构的预测显示,CsNiR具有完整的NiR 蛋白结构,含血红素蛋白β–化合物区域和4Fe-4S区域。实时荧光定量结果表明,该基因在成熟叶片中表达量高于一芽二叶和根。采用营养液水培3个茶树品种,在氮饥饿两周后分别供应正常氮素和低氮素（1和0.1 mmol · L^-1 NH₄NO₃）,qRT-PCR测定发现,正常氮素处理的2 h和6 h,诱导根CsNiR表达量显著增加,叶片中的表达量变化延迟到24 h之后,且变化幅度存在基因型之间的差异;低氮处理对CsNiR表达量的影响相对较小。因此,研究CsNiR基因的表达特性及其在茶树氮素利用中所发挥的作用,需结合茶树基因型、组织部位、供氮水平等进行综合评价。     

利用正交设计优化番茄SRAP-PCR反应体系

以番茄耐低温材料抗寒0号和不耐低温番青的F2为材料,利用正交试验设计对SRAP-PCR反应体系中的5因素（模板DNA、引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶）在4个水平上进行正交优化试验。结果表明：各因素水平变化对反应体系影响的大小依次为：引物＞Taq DNA聚合酶＞dNTPs＞模板DNA＞Mg2+。建立番茄耐低温SRAP-PCR的20 μL最佳反应体系为：模板DNA为15 ng、引物浓度0.75 μmol?L-1、Mg2+浓度2.0 mmol?L-1、dNTPs浓度0.125 mmol?L-1、Taq DNA聚合酶1.0 U。     

杜梨PbNHX1基因的克隆、表达分析及功能验证

【目的】克隆1个杜梨Na~+/H~+逆向转运蛋白基因PbNHX1,并对其序列特征、表达特点及功能进行研究。【方法】采用RT-PCR和PCR克隆PbNHX1的c DNA和DNA序列,利用生物信息学方法进行序列分析,定量PCR检测其在非生物胁迫下转录水平变化,酵母互补试验检测PbNHX1基因的离子转运能力。【结果】杜梨PbNHX1基因c DNA编码区长1 704 bp,对应基因组DNA序列长3 594 bp,由13个外显子和12个内含子组成,编码蛋白含567个氨基酸。系统进化树显示,PbNHX1位于液泡膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白分支上,与杨树液泡膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白Pt NHX1.3基因亲缘关系较近。正常生长条件下,PbNHX1在杜梨叶片中表达量高于根。施加200 mmol·L-1Na Cl、10%(φ)PEG6000或100μmol·L-1ABA后,PbNHX1在叶片中的转录水平持续上升;其在根中的表达量先升后降,表达高峰依次出现在处理后6、3和6 h。PbNHX1的转入可恢复Na Cl、KCl和潮霉素B对nhx1缺失酵母菌株AXT3的生长抑制,转基因酵母细胞中Na~+和K~+含量显著增加。【结论】PbNHX1具有植物NHXs基因家族的固有特征,对盐碱、渗透胁迫和ABA处理均存在转录响应,转入该基因能够提高酵母nhx1缺失突变体AXT3对盐胁迫的耐受能力,部分恢复其对阳离子的转运功能,从而促进Na~+、K~+积累。     

豆梨植物络合素合酶PcPCS1基因克隆及其表达分析

以梨砧木豆梨（Pyrus calleryana Dcne.）为试材,克隆其植物络合素合酶基因（PcPCS1）的cDNA全长序列,并研究该基因的表达特点。结果表明PcPCS1 cDNA 序列长度为1 970 bp,编码497个氨基酸,推导的氨基酸序列由两个典型的植物络合素亚家族结构域组成,具有3个相邻的Cys-Cys元件（331-332、351-352和369-370位氨基酸）和植物络合素合酶蛋白的特征位点（Cys-56、Cys-90/91和Cys-109）。它与豆科植物的PCS1蛋白处于系统发生树的同一分支,且与百脉根LjPCS1蛋白的同源性最高（84%）。荧光定量RT-PCR分析结果显示：PcPCS1基因为组成型表达,各器官表达量存在差异,在20 mmol · L-1 CdSO4胁迫条件下,其表达量迅速上升,并且在豆梨叶中的表达量高于根;不同重金属离子对其上调表达的诱导能力为Cd2+ > Zn2+ > Cu2+。200 mmol · L-1 γ–谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂丁胱亚磺酰亚胺能够显著抑制该基因的表达,补充200 mmol · L-1谷胱甘肽后,其相对表达量恢复或超过单一重金属离子处理的表达水平,即豆梨植物络合素以谷胱甘肽为底物,通过γ–谷氨酰半胱氨酸合成酶途经合成。