柑橘品种对不同基因型柑橘衰退病毒的抑制及变异的影响

为研究不同柑橘品种对柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）不同基因型的抑制效果,将T36、T30、VT和T3等基因型CTV的毒源分别接种于‘赛蒙斯’甜橙、‘邓肯’葡萄柚、‘墨西哥莱檬’和‘强徳勒柚’,运用RT-qPCR技术检测被接种植株中CTV复制水平的差异。结果表明,‘墨西哥莱檬’最适于CTV各基因型的复制。‘邓肯’葡萄柚中VT、T3和T36基因型的复制水平最低。4种柑橘品种对T36基因型CTV都有明显的抑制作用。通过对CTV的CP基因进行分析发现,VT基因型CTV在‘赛蒙斯’甜橙中发生了较大变异。     

浙江柑橘产区柑橘黄脉病毒的发生、分布与分子特性研究

运用RT-PCR技术对采自浙江12个柑橘产地的181份柑橘样品进行检测,首次从浙江的‘佛手’柑(Citrus bergamia)和‘红美人’橘(C.reticulata)上检测出柑橘黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV),其检出率分别为68.0%和47.2%。选取4个CYVCV毒株与11个已知CYVCV毒株进行全序列分析,结果显示CYVCV序列保守性较高,所有15个CYVCV毒株的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为96.9%~99.8%和97.9%~99.4%。虽然采自浙江的4个CYVCV毒株在进化树中聚成单独的簇,但CYVCV毒株间的亲缘关系可能不与其采样地的存在相关性。     

柑橘黄化脉明病毒的TGB基因生物信息学分析及亚细胞定位

柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)是一种正义单链RNA病毒。其基因组含有6个开放阅读框(ORF),其中ORF2、ORF3和ORF4组成了三基因连锁结构(triple gene block,TGB)。以感染CYVCV的尤力克柠檬[Citrus limon(L.)Burm.f.]植株的总RNA为模板,扩增和克隆了CYVCV的TGB基因,并开展了其编码蛋白的理化性质和分子特性等生物信息学分析;进而通过In-Fusion~?技术构建了TGB各基因的亚细胞定位载体,经农杆菌介导转化洋葱表皮细胞并在荧光显微镜下进行亚细胞定位观察。生物信息学分析结果表明,CYVCV-TGB具有与Potexvirus属病毒TGB相似的理化性质和分子特性,可能参与病毒在寄主中的运动且需要外壳蛋白的参与。亚细胞定位结果显示,TGBp1定位于细胞壁(膜)上,TGBp2和TGBp3主要定位于细胞壁(膜),少量呈星点状定位于细胞内。研究结果为揭示CYVCV在寄主中的运动机理奠定了基础。     

柑橘黄脉病毒侵染对柠檬光合特性和叶绿体超微结构的影响

以3年生尤力克柠檬实生苗为试验材料,嫁接柑橘黄脉病毒(CYVCV)现症后,测定叶片的叶绿素含量、叶绿素荧光参数、光合参数和酶活性.与健康植株相比,病株中叶绿素含量(Chl)、净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、潜在光化学效率(Fv/Fo)和最大光化学效率(Fv/Fm)较对照植株显著降低,初始荧光(Fo)、过氧化氢酶(...     

柑橘黄化脉明病毒DTBIA检测方法的建立

通过柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）兔源多克隆抗体（一抗）及Ap标记羊抗兔IgG（二抗）最佳稀释度等条件优化建立了CYVCV直接组织点免疫（Direct tissue blot immunoassay,DTBIA）检测方法,并对其特异性、稳定性和检测效果进行了评价。试验结果显示,一抗、二抗稀释比例分别为1︰8 000和1︰2 000时,DTBIA检测CYVCV效果最佳;应用所建立的DTBIA方法对携带9种不同柑橘病害的柑橘样品进行检测时,仅携带CYVCV样品呈阳性反应;柑橘黄脉病样品植物组织印迹后,印迹膜于4 ℃保存,90 d内可进行有效的CYVCV检测;对田间不同柑橘品种利用DTBIA法检测CYVCV,其结果与一步法RT-PCR符合率为97.92%。可见,该CYVCV检测方法快速、简便、稳定、特异及可靠,可推广应用于田间快速检测CYVCV,对于防范柑橘黄化脉明病毒大面积传播流行具有重要的现实意义。     

柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒的二重RT-PCR检测体系的建立与应用

选用柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)和柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)两种病毒外壳蛋白保守序列及内参基因Ubiquitin的特异性引物,优化影响二重RT-PCR反应的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度和退火温度,建立了针对两种病毒的一步法二重RT-PCR检测体系。二重RT-PCR获得CYVCV、CTV及Ubiquitin的特异性片段大小分别为614、373和194 bp,克隆测序和序列对比结果显示它们与已报道的病毒序列具有较高的同源性。该体系最低能从40 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CYVCV,从4 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CTV,其灵敏度与单一RT-PCR检测灵敏度一致。利用该体系对33份田间样品进行检测,CYVCV和CTV感染率分别为54.5%和66.7%,复合侵染率高达36.4%。该一步法二重RT-PCR技术体系可用于大量田间样品中CYVCV和CTV的快速同步检测。     

柑橘黄化脉明病毒RT-LAMP检测方法的建立

柑橘黄脉病由柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）引起,是中国近年来新发生的一种柑橘病害。根据CYVCV的外壳蛋白基因序列设计了一组特异性引物,经过一系列条件优化,建立了该病毒的RT-LAMP检测方法。结果显示该方法能特异扩增CYVCV,与其他6种柑橘病原物（柑橘衰退病毒、温州蜜柑萎缩病毒、鳞皮病毒、柑橘裂皮病类病毒、柑橘碎叶病毒和柑橘黄龙病菌）不发生反应;灵敏度为RT-PCR的10倍;田间样品的检出率为63.33%,与RT-PCR的结果一致,适用于田间样品的检测。在产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ直接用肉眼观察就可判断样品是否感染CYVCV,可省去电泳分析的时间。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点。     

应用实时荧光RT-PCR检测柑橘黄化脉明病毒

为更快速准确检测柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）,根据病毒外壳蛋白基因的保守序列设计特异性引物,通过体系优化得到最佳反应条件,建立基于SYBR GreenⅠ的CYVCV实时荧光RT-PCR检测方法。该方法可特异性检测CYVCV,而测试的柑橘衰退病毒、碎叶病毒等5种柑橘病毒均不能检测出。灵敏度较普通RT-PCR提高了100倍,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率和相关性系数分别为102%和0.999。对田间样品的检测结果表明,建立的实时荧光RT-PCR适用于检测不同柑橘品种中CYVCV的含量。     

中国柑橘叶斑驳病毒和碎叶病毒发生状况及其分子特性研究

柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)和柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)均可侵染柑橘的不同种。为明确CLBV及CTLV在中国柑橘上的发生状况和分子特性,采用RT-PCR技术对来源于中国7个省的342份和346份柑橘样品进行检测,检出率分别为9.6%和11.0%。对14个CLBV分离物和15个CTLV分离物的外壳蛋白(Coat protein,CP)基因部分序列分析显示,CLBV分离物间cp核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为82.1%~100%和88.1%~100%,CTLV分离物的cp核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为89.5%~100%和92.5%~100%。测定的14个CLBV分离物在系统进化树中聚为2个组;而CTLV分离物分组不明显,该病毒的系统进化与寄主来源无明显关系。     

柑橘钙调蛋白cDNA的克隆及序列分析

 以温州蜜柑(Citrus unshiu Marc. ) 幼果cDNA第1链为模板, 参照大麦钙调蛋白基因序列(Accession No. M27303) 合成5p端和3p端引物, 以PCR的方法扩增得到柑橘钙调蛋白cDNA, 将其克隆到PMD182T载体上并进行测序。序列分析表明, 柑橘钙调蛋白cDNA全长453 bp, 共编码148个氨基酸, 与大麦和大豆钙调蛋白基因的同源性均高达83%以上, 所编码氨基酸序列同源性达97%以上。以该cDNA作探针进行点杂交, 得到良好的杂交信号。     

柑橘黄化脉明病毒基因组的长链RT-PCR扩增、克隆及序列分析

为了建立柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)基因组长链RT-PCR扩增体系,构建其全长cDNA克隆,为深入了解CYVCV分子特性及其致病机理奠定基础。根据GenBank中CYVCV基因组序列和5′RACE扩增结果设计引物。以感染CYVCV的代代酸橙(Citrus aurantium‘Daidai’)植株总RNA为模板进行长链RT-PCR扩增,得到CYVCV全基因组cDNA,克隆至pGEM-Teasy载体,并进行序列测定与分析。结果显示,建立了一步扩增CYVCV全基因组的长链RT-PCR方法,扩增出约7.5 kb的目标片段;所获得的4个CYVCV全基因组cDNA序列与GenBank中已登录的相关毒株的核苷酸序列同源性为93%~99%。     

广东地区冬瓜感染的小西葫芦黄花叶病毒检测及其外壳蛋白基因多样性分析

小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)是危害广东省冬瓜的常见病毒。摸索了冬瓜叶片总RNA最佳提取方法,通过基于ZYMV病毒外壳蛋白基因(coat protein gene,cp)序列的RT-PCR扩增,检测采集自广东省9个冬瓜产区的76份病毒侵染样品的病毒田间发病率;将扩增产物克隆测序,利用MegAlign软件构建系统发育进化树分析cp基因遗传变异与系统进化。结果表明,24份样品检测为阳性,田间发病率为31.59%;所有参试病毒分离物cp基因全长840 bp,编码279个氨基酸的多肽;测序的16个分离物cp基因的核苷酸序列与推导蛋白的氨基酸序列相似性分别为98.1%~100%与96.1%~100%;所有广东分离物的推导氨基酸序列基序保守,除GD121-9增加2个人类白细胞抗原外,其他均包含5个人类白细胞抗原及1个N糖基化位点,均包含保守potyv_CP功能域及与病毒蚜传相关的结构域DAG三联盒"Asp-Ala-Gly";系统进化分析表明,ZYMV病毒划分为7个基因型,广东分离物均属于同一基因型Ⅰ,包含3个株系;广东地区的16个分离物分为3组,无明显地域选择性。总体上广东ZYMV-cp比较保守,分子变异较小。明确了广东省冬瓜上ZYMV病毒的侵染情况及外壳蛋白基因的变异特点,为对其致病性和抗病毒基因工程等研究提供依据。