柑橘响应黄龙病菌侵染的NAC基因的克隆及表达分析

挖掘柑橘抗黄龙病（Huanglongbing,HLB）基因是抗病育种的基础和关键。以感染黄龙病菌亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus(CLas)早期（2个月）锦橙根和叶片中脉比较转录组数据为基础，筛选到9个响应柑橘黄龙病侵染诱导的NAC基因，从中选3个差异表达水平较高的基因克隆，分别命名为Cs NAC21/22、Cs NAC68和Cs NAC78。生物信息分析表明3个基因均符合NAC基因家族的特征；烟草亚细胞定位结果表明，Cs NAC68定位在细胞核，Cs NAC21/22和Cs NAC78定位在细胞核和细胞质。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析表明，3个候选基因在易感HLB的锦橙、耐病的马蜂柑和高耐病的九里香的组织和病原菌诱导表达特征呈现明显差异。以健康植株为对照，Cs NAC68和Cs NAC78主要在锦橙的根中响应CLas感染，显著上调表达，Cs NAC68在九里香叶肉和马蜂柑根中响应CLas感染，显著上调表达；Cs NAC21/22主要在锦橙根和马蜂柑叶肉中显著下调表达。以‘锦橙’叶片为试材通过q RT-PCR分析候选基因响应SA、J...     

柑橘超量表达CsNBS-LRR通过SA信号途径增强对溃疡病抗性

克隆了柑橘CsNBS-LRR基因,分析该基因在柑橘溃疡病菌（Xcc）、水杨酸、茉莉酸甲酯诱导下的表达特征,通过在晚锦橙中超量表达验证其功能。结果表明,CsNBS-LRR的开放阅读框为3 633 bp,编码1 210个氨基酸。其在感病品种晚锦橙中受Xcc诱导下调表达,而在低感品种四季橘中上调表达;在四季橘中受水杨酸诱导明显上调表达,而晚锦橙中上调幅度较小;两品种CsNBS-LRR受茉莉酸甲酯诱导均不明显;超量表达载体转化晚锦橙获得4个阳性植株;抗性评价表明超量表达CsNBS-LRR明显提升了转基因植株对柑橘溃疡病的相对抗性（病情指数为野生型的75% ~ 88%）;转基因植株中水杨酸含量和水杨酸合成途径中关键基因转录水平明显提高;水杨酸信号途径中的PR基因转录水平也升高。综上所述,CsNBS-LRR是柑橘抗溃疡病的1个抗病基因,它可能通过对水杨酸途径的调控一定程度上增强柑橘对溃疡病抗性。     

响应黄龙病侵染的柑橘乙醇脱氢酶基因CsADH1的克隆与表达分析

对前期在感染黄龙病的‘晚锦橙’中发现的明显差异表达的柑橘乙醇脱氢酶（CsADH1）基因进行克隆测序分析,结果表明,CsADH1 的 CDS 序列长为 1 143 bp,编码 380 个氨基酸。蛋白质结构预测显示,CsADH1 含有乙醇脱氢酶 GroES（ADH_N）和 ADH_zinc_N 保守结构域。进化树分析显示,CsADH1 蛋白与拟南芥、蓖麻和中国莲的 ADH 蛋白亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示,CsADH1 蛋白定位在细胞质中。以感病‘晚锦橙’的根和叶脉为材料,qPCR 分析显示 CsADH1 在感病根和叶脉中均上调表达,且根中的表达水平是叶脉中的 10 倍。离子胁迫试验和外源植物生长调节剂诱导试验表明,Zn、水杨酸（SA）、生长素（IAA）和脱落酸（ABA）均显著诱导 CsADH1 上调表达,并且根中的表达水平明显高于叶中。本结果表明,CsADH1 可能在柑橘根响应黄龙病菌侵染中起着重要作用。     

柑橘响应黄龙病侵染的韧皮部蛋白2基因CsPP2B15的克隆与表达分析

黄龙病病原菌诱导柑橘筛孔胼胝体过度积累是其致病的一个重要因素。柑橘韧皮部蛋白（Phloem Protein,PP）在筛孔胼胝体积累中起着重要作用。为研究柑橘韧皮部蛋白响应黄龙病亚洲种（Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas）侵染的功能,克隆获得了一个响应黄龙病侵染差异表达的PP基因CsPP2B15的编码区和长1.5 kb的启动子序列,并以高感品种锦橙和耐病品种酸柚老叶和嫩叶为材料,进行基因表达分析。结果发现,CsPP2B15在高感品种锦橙嫩叶中受CLas诱导显著上调表达,而在耐病品种酸柚嫩叶中受CLas诱导显著下调表达,且在叶肉中的表达量显著高于叶脉。嫩叶和嫩梢被认为是柑橘响应黄龙病侵染的早期原初侵染部位。因此,CsPP2B15可能在CLas侵染柑橘早期中起重要作用。CsPP2B15启动子的顺式作用元件预测分析发现,CsPP2B15启动子含有许多与逆境和激素有关的顺式作用元件。进一步构建了CsPP2B15启动子控制GUS报告基因的植物表达载体,转化枳[Poncirus trifoliata（L.）Raf.]上胚轴。GUS组织化学染色和GUS酶活性测定均表明,CsPP2B15启动子具有较强的韧皮部组织特异性。     

柑橘响应溃疡病菌转录因子基因CsAP2-09的克隆与功能分析

对柑橘中AP2转录因子进行注释,并克隆柑橘溃疡病相关的Cs AP2-09,研究外源水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯利、机械损伤以及溃疡病菌对该基因的诱导表达,确定其表达模式。从柑橘全基因组公共数据库一共注释出12个AP2成员,据系统发育和结构可以将其分为4个亚类;可能与抗、感溃疡病相关的Cs AP2-09基因全长4 159 bp,开放阅读框1 467 bp,编码488个氨基酸,具有典型的AP2结构,同时也具有一些结构特殊性;该基因在细胞核中优势表达,与定位信号预测结果吻合;上游启动子元件含多个与植物逆境或激素应答相关的顺式作用元件,如BOX-W1、CGTCA-motif、TCA-element、WUN-motif等;诱导结果表明Cs AP2-09对外源水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯利及机械损伤均有响应;柑橘溃疡病菌侵染可诱导抗病品种四季橘中此基因明显上调表达,而在感病品种纽荷尔中变化趋势不显著。上述研究表明Cs AP2-09是一个响应溃疡病菌侵染的,可作为研究柑橘抗溃疡病的候选基因。目前已将其在锦橙中超表达,共筛选出8个转基因植株,后期将对其进行抗病性评价以确定其分子育种价值。     

柑橘AOS1-2的克隆及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

对柑橘中茉莉酸（Jasmonic acid,JA）生物合成途径中的关键限速酶丙二烯氧化物合酶AOS家族基因进行注释,确定其受溃疡病菌Xanthomonas citri subsp. citri(Xcc)诱导的表达模式。从甜橙数据库中共注释出3个AOS家族成员,其中CsAOS1-2对溃疡病菌响应最强烈;CsAOS1-2在‘晚锦橙’（甜橙,易感溃疡病）和‘金弹’（金柑,抗溃疡病）中均受病原菌诱导,但在‘晚锦橙’中表达量上调幅度远高于金弹;CsAOS1-2全长2 656 bp,开放阅读框1 599 bp,编码532个氨基酸,分子量为59 499.81,为非分泌性蛋白,其349～510 aa为典型的P450功能域;Cs AOS1-2的表达无组织特异性;‘晚锦橙’和‘金弹’的AOS1-2启动子均含有参与植物激素和逆境应答的顺式作用元件,但在数量和类型上存在差异;烟草瞬时转化亚细胞定位分析显示CsAOS1-2定位在叶绿体中。CsAOS1-2强烈响应柑橘溃疡病菌的侵染,推测其与柑橘溃疡病敏感性具有密切的关系。     

柑橘中黄龙病菌效应子SDE70的表达特征及寄主互作蛋白解析

柑橘黄龙病菌主要致病种亚洲种（‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,Las）具有完整的Sec依赖型分泌系统,可分泌致病因子（效应子）作用于寄主靶标蛋白或基因,调控寄主的抗（感）病反应。为了研究黄龙病菌Sec依赖型效应子在柑橘中的致病机理及其寄主靶标基因,本研究中从感病‘锦橙’中克隆了Las病原菌Sec依赖型效应子基因SDE70（CLIBASIA_02470）。生物信息分析显示,SDE70蛋白全长132个氨基酸,N端20个氨基酸为典型信号肽。大肠杆菌碱性磷酸酶活性分析显示,该信号肽具有胞外分泌功能。亚细胞定位显示,SDE70::GFP融合蛋白在洋葱细胞质和细胞核中积累。定量PCR分析发现,耐黄龙病酸柚显症叶脉中SDE70表达量显著低于未显症叶脉,相反,易感黄龙病‘锦橙’显症叶脉中表达显著高于未显症叶脉;‘锦橙’根中SDE70表达量显著高于叶脉,而幼叶叶脉中显著低于老叶。SDE70在不同品种不同症状发育时期以及不同组织中表达差异显著。利用酵母双杂交试验筛选获得26个与SDE70互作的柑橘蛋白。GO富集分析表明,42.3%的蛋白质与细胞内生物合成过程有关;65.4%的靶标蛋白位于细胞质或质膜上;34.6%的靶标蛋白具有核糖核苷酸结合的分子功能。进一步酵母点对点杂交试验验证3个与SDE70效应子强相互作用的靶标蛋白（CsTRAPP、CsARF、CsRub1）,其主要参与植物囊泡转运、类泛素化等过程,暗示SDE70效应子极有可能调控柑橘信号转导和胞质运输途径影响寄主抗（感）病反应。     

响应黄龙病侵染的柑桔韧皮部蛋白2基因筛选及表达分析

为了探索柑桔韧皮部蛋白2(Phloem Protein 2,PP2)在寄主与黄龙病菌互作中的功能,以嫁接传毒后的高感种质锦橙Citrus sinensis和耐病种质酸柚Citrus grandis病枝叶片为材料,通过实时荧光定量PCR方法从全基因组水平初步筛选到6个响应黄龙病侵染诱导的PP2基因,并比较了其在锦橙和酸柚中的相对表达量。结果表明,CsPP2B15可能与耐病有关,CsPP2B2和CsPP2B10可能与感病相关。采用生物信息学的方法对6个基因编码氨基酸序列从结构组成、基本理化性质、亲疏水性进行分析并构建了系统发育树,发现在柑桔中CsPP2B15和CsPP2A与拟南芥PP2的亲缘关系较近,而CsPP2B2、CsPP2B10、CsPP2B12-1、CsPP2B12-2与大豆PP2亲缘关系较近,CsPP2A与拟南芥PP2的亲缘关系最近。     

茉莉酸、水杨酸类激发子外源诱导的茶树挥发物比较

为比较茉莉酸类和水杨酸类激发子外源诱导的茶树挥发物,选用茉莉酸（JA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）、水杨酸甲酯（MeSA）等4种激发子喷施茶树,用动态顶空法和气相色谱质谱联用仪收集分析茶树挥发物。4种激发子均可提高茶树挥发物组分数及总量。对照茶树仅释放2种物质,总量低于0.01 ng ? h-1 ? g-1;JA可诱导新释放9种物质,总量可达4.37 ng ? h-1 ? g-1,80%以上为(E)–β–罗勒烯、(E)–4,8–二甲基–1,3,7壬三烯（DMNT）、苯乙醛等萜类及芳香族化合物;MeJA可诱导新释放27种物质,总量可达95.41 ng ? h-1 ? g-1,80%以上为(E)–β–罗勒烯、DMNT、(E,E)–α–法尼烯等萜类化合物;SA可诱导新释放苯甲醚、苯酚、MeSA等3种芳香族化合物,总量可达191.21 ng ? h-1 ? g-1,90%以上为MeSA;MeSA仅诱导新释放MeSA,总量可达507.5 ng ? h-1 ? g-1。激发子浓度提高,茶树挥发物中主要组分释放量或组分数增加。主成分分析与层次聚类分析显示,4种激发子诱导的茶树挥发物得分数差异显著,但JA与MeJA、SA与MeSA诱导的茶树挥发物各聚为一类。综上,JA、MeJA、SA、MeSA等4种激发子均可显著增加茶树挥发物释放,茉莉酸类与水杨酸类激发子诱导的茶树挥发物差异大,而同类激发子诱导的茶树挥发物相似。本研究结果对进一步揭示茉莉酸类和水杨酸类激发子诱导茶树挥发物的生理机制及抗虫功能具有重要意义。     

黄龙病菌胁迫下‘锦橙’CsCalS5表达和胼胝质沉积的初步分析

胼胝质合成酶是控制胼胝质合成的关键酶,在植物生长发育和抗逆胁迫中具有重要作用。克隆并分析‘锦橙’胼胝质合成酶基因CsCalS5及其启动子序列,实时荧光定量PCR检测CsCalS5的组织表达模式以及植物生长调节剂、黄龙病菌和柑橘溃疡病菌的诱导表达模式,并通过组织切片观察感染黄龙病和柑橘溃疡病‘锦橙’叶脉胼胝质的沉积。结果显示,CsCalS5启动子序列中含有脱落酸和病原菌的响应元件;CsCalS5编码1 952个氨基酸含有保守结构域FKS1和β–1,3–葡聚糖合成酶功能域的跨膜蛋白;CsCalS5在‘锦橙’的茎中高表达,且受脱落酸的诱导;黄龙病菌侵染后叶脉韧皮部的胼胝质沉积明显,患病叶片CsCalS5的表达量是健康对照的4.02倍;柑橘溃疡病菌侵染叶片后,叶脉韧皮部胼胝质沉积无明显增加,且CsCalS5的表达量与健康对照无显著差异。综上,黄龙病菌可能通过上调‘锦橙’CsCalS5的表达促进韧皮部胼胝质的沉积,从而增强其防御能力,且这种抗性可能受到脱落酸的调控。     

不同柑橘砧木对锦橙果实品质的影响

 2006—2008年连续3年研究11种砧木对铜水72-1锦橙果实品质的影响。结果表明：不同砧木对果实颜色和内在品质均有影响,其中以卡里佐枳橙为砧的果实亮度最好,黄色度值最高,果实最大,果皮最薄;以路比枳为砧的果实红色度值和固酸比（TSS/TA）最高,果皮最厚;以沃尔卡姆为砧的亮度最差,黄色度值、单果质量和可食率最低,中心柱最小;以C35枳橙为砧的中心柱最大且维生素C含量最低;以光皮酸橙为砧的果实红色度最低而可食率最高;以里其16-6枳为砧的果实可溶性固形物（TSS）含量最高;以孙楚沙橘为砧的果实可滴定酸（TA）和维生素C含量最高,而TSS/TA最低;果实TSS和TA最低的砧木为枸头橙。品质综合评价,性状表现较好的为孙楚沙橘、卡里佐枳橙和C35枳橙,而表现较差的为兰普莱檬和沃尔卡姆柠檬。     

柑橘黄龙病病原菌Las在叶圆片嫁接接种的‘锦橙’中早期扩散研究

为了探究黄龙病（Citrus Huanglongbing,HLB）病原菌在柑橘韧皮部的早期运动情况,以柑橘黄龙病亚洲致病种Candidatus Liberibacter asiaticus（Las）为毒源,黄龙病高感品种‘锦橙’实生苗为受体材料进行叶圆片嫁接传毒。利用定量PCR技术对嫁接口处近端主脉、远端主脉、叶柄以及缘周叶组织进行了为期84 d的菌量测定。结果发现,病原菌在近端主脉中积累最快,其次是远端主脉、叶柄和缘周叶组织。以近端主脉为原初侵染部位,Las在嫁接叶片中1 ~ 84 d的早期运动可分为潜伏期（1 ~ 42 d）、指数期（43 ~ 70 d）和稳定期（71 ~ 84 d）。在早期侵染过程中,Las病原菌主要沿叶主脉从原初侵染部位由近向远扩散,其扩散趋势与症状从原初侵染部位向外扩散紧密相关。证实叶圆片嫁接法可作为柑橘HLB一种有效的传毒方式。     

不同砧木上沙田柚、晚白柚和五布柚的早期表现

对嫁接在29种砧木上的沙田柚、晚白柚及五布柚(共66个砧穗组合)的早期表现进行了比较研究。结果表明,以酒饼簕和枳为砧能使柚矮化;以某些柚和酸橙为砧使柚乔化;对其他一些砧木不同柚品种的反应各异。以枳橙为砧的晚白柚和五布柚生长中庸,嫁接后第3年便开花结果,由此认为枳橙为有希望的早结柚类砧木。     

溃疡病菌侵染早期柑橘细胞程序性死亡的响应特征及机制

为进一步研究柑橘溃疡病抗性与细胞程序性死亡的关系， 以高感品种晚锦橙（甜橙类，Citrus sinensis Osbeck）和高抗品种金弹（金柑类，Fortunella crassifolia Swingle）为试材，从抗性特征、发病早期的相关信号变化、抗氧化酶活性和基因表达变化等方面探讨柑橘细胞程序性死亡响应溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri）侵染的特征及机制。接种溃疡病菌后，晚锦橙叶片出现明显的海绵状凸起，为典型的溃疡病症状；而金弹则出现超敏化反应细胞坏死症状。接种前，过氧化氢（H2O2）在金弹中的基础水平较晚锦橙高；接种后，两品种的H2O2含量均上升，但金弹上升幅度高于晚锦橙。随着H2O2水平升高，代表膜脂过氧化程度的丙二醛（MDA）含量在两个品种中均增加，但金弹中增加幅度更大。抗氧化酶系统中的超氧化物歧化酶（SOD）活性在晚锦橙和金弹叶片中均呈下降趋势；过氧化氢酶（CAT）活性在两个品种中均提高且差异不大；过氧化物酶（POD）活性在两个品种中均提高，但晚锦橙的上升更快，且提高程度低于对照。参与细胞程序性死亡正调控的基因CsCEP1-1、CsCEP1-2和CsMCA1在两个品种中均受溃疡病菌诱导上调表达，但金弹中的表达水平显著高于晚锦橙；参与细胞程序性死亡负调控的CsDAD1-1、CsDAD1-2、CsMLO2和CsMLO3的转录水平在晚锦橙中变化不大，而金弹中随着接种时间的延长逐渐降低。结果表明，溃疡病菌胁迫下晚锦橙和金弹在发病早期均启动了超敏化反应，但在金弹中更为强烈，有助于诱导发生细胞程序性死亡，而限制病原菌的生长，这可能是金弹抗病性强的内在原因之一。     

柑橘叶脉开裂症与矿质营养的关系

 柑橘叶脉开裂症属于多病因的病症,缺Mg或缺B均可导致发病。对‘纽荷尔’脐橙[Citrus sinensis（L.）Osbeck‘Newhall’]的缺Mg叶脉开裂症病株,在生长季4月采用1.0%硝酸镁叶面喷施矫治2 ~ 3次,可有效降低病叶发生。通过福建柑橘产区普查,由缺Mg引起叶脉开裂症占86.2%,其次为B与Mg共同缺乏,缺B仅占2.3%。不同品种缺Mg叶脉开裂的感病顺序为：纽荷尔脐橙＞琯溪蜜柚,其它发病品种还有金柑、早熟温州蜜柑、瓯柑。采用易感品种纽荷尔脐橙与抗性品种椪柑互为中间砧高接比对发现,纽荷尔脐橙对Mg和B的吸收能力低于椪柑,对K的吸收高于椪柑,这可能是纽荷尔脐橙易患叶脉开裂症的原因。缺Mg和缺B病症的最显著的区别为,缺Mg叶脉开裂多位于叶片顶部“∧”形黄化部位;缺B叶脉开裂症病叶呈绿色不黄化;Mg、B缺乏症的病叶主脉和侧脉明显开裂与全叶黄化,或叶脉开裂达基部“∧”形绿色区域。     

用电导法配合Logistic方程测定若干甜橙品种的抗寒性

用电导法配合logistic方程,测定了18个甜橙(Ciruus sinensis Osb.)品种的半致死温度。初步认为,桃叶橙18号、斯卡格斯·朋娜脐橙、福罗斯特脐橙、改良橙和脐血橙等品种稍耐寒,锦橙、哈姆林甜橙等对低温较敏感。