利用实时荧光PCR 方法检测香蕉软腐细菌

 由Dickeya spp.引起的香蕉细菌性软腐病是近年来在中国广东发生的一种严重危害香蕉的病 害,检测方法的建立和应用是防止病害传播和实时防治的重要手段。依据报道的Dickeya spp.通用引物, 建立了用于香蕉细菌性软腐病发病植株和带菌土壤检测的实时荧光PCR 方法。优化后的检测体系对香蕉 软腐细菌（XJ8-3-3）靶片段克隆质粒DNA 的检测灵敏度可达到2.4 × 10^-5 ng · μL^-1,对菌悬液的检测灵敏 度可达到4.0 × 10² cfu · mL^-1,而常规PCR 对其检测的灵敏度为2.4 × 10^-3 ng · μL^-1 和4.0 × 10⁴ cfu · mL^-1, 实时荧光PCR 的灵敏度比常规PCR 高100 倍。利用实时荧光PCR 能够快速的检出香蕉细菌性软腐病发 病植株和带菌土壤中的病原菌量,对梯度稀释的菌悬液接种的带菌土壤检测结果表明,可检测到病菌DNA 最低含量为0.35 pg · L^-1。该方法适用于对香蕉软腐病菌的检测和监控。     

番茄黄化曲叶病毒的实时荧光定量PCR 检测

番茄黄化曲叶病毒病（Tomato yellow leaf curl virus disease,TY LCVD）是目前为害番茄生
产的重要病害,准确检测TYLCV 含量是深入研究该病毒致病机理以及抗病育种的基础。根据TYLCV 的
DNA 保守序列设计引物,基于SYBR Green I 检测模式,构建了TYLCV 实时荧光定量PCR 检测体系,并
且对接种病毒30 d 后的感病番茄植株中的TYLCV 进行检测。结果显示,1ng·μL^-1 感病番茄总DNA 中
约含有3.47×10⁶ 个病毒拷贝。利用实时荧光定量PCR 法比普通PCR 法的灵敏度提高100 倍。     

番茄枯萎病菌RT-PCR检测技术的建立与应用

根据番茄枯萎病病原菌尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,FOL)蛋白激酶基因序列,设计1对番茄枯萎病特异性引物209F/361R,构建番茄枯萎病菌的RT-PCR(real-time PCR)检测体系,并利用该体系定量检测盆栽番茄茎基部病原菌。RT-PCR结果表明该引物只对番茄枯萎病菌有唯一产物吸收峰,对其他供试菌株都未检到荧光信号。利用该引物建立的RT-PCR检测体系线性关系良好,灵敏度为5.76×10³ copies·μL^-1,是普通PCR的10倍。人工接种番茄枯萎病菌定植后7 d即可在茎基部检测到病原菌;田间采集的24个自然发病样本中有16个能够检测到番茄枯萎病菌。基于RT-PCR技术构建的番茄枯萎病菌快速检测方法检测速度快、灵敏度高、特异性强、重现性好,能够为该病的早期诊断和流行监测提供理论依据。     

辣椒疫霉菌RT-PCR检测技术的建立及应用

根据辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici Leonian）与致病疫霉菌（Phytophthora infestans）及其他8种常见土传病害病原菌Actin基因序列差异,设计并筛选出辣椒疫霉菌的特异性引物YM2F/YM2R,建立辣椒疫霉菌的实时荧光定量PCR检测体系,并利用该体系定量检测人工模拟带菌样品及田间发病土壤样品中的辣椒疫霉菌。试验结果表明,利用该引物建立的实时荧光定量PCR检测体系线性关系良好,灵敏度为1 × 10-1 pg ? μL-1,是普通PCR的100倍。该体系无需病原菌的分离培养即可对土壤中的辣椒疫霉菌进行快速、特异且定量检测。对田间土壤样品的检测结果表明,在一定范围内病害发生、流行程度与病原菌密度成正比,从而为该病的流行监测和早期防控提供科学依据。     

甘肃地区番茄细菌性斑点病菌的鉴定与检测

从番茄病果上分离纯化的细菌菌株,经致病性测定、形态特征、培养特性观察及16S rDNA
序列测定,鉴定为番茄细菌性斑点病菌Pseudomonas syringae pv. tomato（Okabe）Young,Dye et Wilkie。
利用特异性引物对已鉴定菌株及番茄发病组织进行PCR 扩增,均扩增出530 bp 左右的特异性片段,印证
了可利用特异性引物MM5F/MM5R 对分离菌株或番茄发病组织进行PCR 扩增以检测番茄细菌性斑点病菌。     

番茄细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌的四重PCR检测方法

针对引起番茄细菌性病害的细菌性斑点病菌（Pseudomonas syringae pv. tomato,Pst）、溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis,Cmm）、青枯病菌（Ralstonia solanacearum,Rs）以及疮痂病菌（Xanthomonas campestris pv. vesicatoria,Xcv）,建立了四重PCR检测技术,为病害的快速、准确诊断提供技术支持。根据gap1基因设计Pst特异性引物BW-F/BW-R,经PCR条件优化,扩增出了375 bp的特异性片段。将设计的引物与已报道的3种细菌特异性引物组合,通过设定不同的退火温度、引物浓度、循环次数以及延伸时间,探索影响四重PCR扩增的因素,优化了其反应体系。四重PCR反应体系中的引物对BW-F/BW-R、Fan1/Fan2、RS-1-F/RS-3-R和XCVF/XCVR可分别扩增出细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌长度为375、146、716和517 bp的特异性目的片段,反应体系退火温度为57.1 ℃,4对引物的终浓度分别为0.24、0.16、0.16和0.08 μmol ? L-1,延伸时间45 s,35个循环。该四重PCR反应体系可快速检测田间番茄发病植株中的细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌,灵敏度达到10-1 ng ? μL-1。     

番茄细菌性溃疡病菌的定性PCR检测方法

以2个番茄溃疡病菌株和其它6种植物病原菌为试验材料,以micA、cytC、TomA等3个特异性基因为检测靶标,采用检测引物设计与优化、特异性测试、灵敏度测试等方法,研究建立番茄溃疡病菌的定性PCR检测方法。结果表明:依据这3个基因建立的PCR检测方法可特异、精准检测番茄溃疡病菌,其中,以TomA基因为检测靶标的方法灵敏度可达到5copy/μL或103 cfu/mL,优于另外2种方法,为番茄溃疡病菌的早期诊断提供了快速、准确的技术手段。     

平菇细菌性褐斑病病原菌RT-PCR检测方法的建立及其应用

 平菇细菌性褐斑病是一种严重危害平菇生产的病害,早期监测和防治是关键。采用平菇细菌性褐斑病病原菌托拉斯假单胞杆菌（Pseudomonas tolaasii）毒素基因的特异性引物（Pt-1A）/（Pt-1D1）,通过扩增条件优化,建立了该菌的实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction）检测及富集方法,并利用该方法完成了该菌在平菇表层的动态监测。试验结果表明,实时荧光定量PCR对托拉斯假单胞杆菌的检测范围为10² ~ 10⁹ cfu ? mL^-1,在经过选择性培养基富集后,检测灵敏度进一步提高了100倍。利用选择性培养基富集及荧光定量PCR检测方法,可在病害症状未显现之前检测到病原菌,为平菇细菌性褐斑病的流行监测和早期防治奠定了技术支持。     

一种新的西瓜果斑病种子带菌检测方法

通过采用病原菌分离、培养基富集培养与 PCR 技术建立了一套西瓜果斑病菌检测方法。结果表明,MOPS 缓冲液对西瓜种子所带病菌分离效果最佳,且利用 WFB1/WFB2引物对富集到的病菌进行 PCR 检测,都产生了预期360 bp 片段;对 BFB 纯菌液和模拟带菌种子浸提液的最低检测限为1.0×102 cfu/mL。利用 OD 值法结合平板涂布记菌落数方法绘制西瓜细菌性果斑病病原菌浓度梯度标准曲线：Y=3.9841x+0.0881,R2=0.9991（Y×108 cfu/mL）。该检测方法的建立,为西瓜生产中果斑病防治提供了重要技术支持。     

土壤中梨火疫病菌实时荧光定量PCR检测及动态分析

【目的】利用实时荧光定量PCR检测土壤中梨火疫病菌(Erwinia amylovora)浓度，明确梨火疫病菌在土壤中的动态变化规律。【方法】2021年3—11月采集库尔勒市发病香梨园810份土壤样品，应用所建立的实时荧光定量PCR检测体系，测定土壤中的梨火疫病菌浓度，同时对梨园发病率及病情指数进行调查。【结果】土壤中梨火疫病菌浓度值变化趋势与梨园病情指数变化趋势一致，4—5月梨园病情指数快速升高至最高值，随着果树生长期延长，病情指数逐渐降低。土壤中梨火疫病菌浓度值从4月逐渐升高，6月平均浓度值为914 CFU·g-1,7月平均浓度值最高为965 CFU·g-1，随后逐渐降低；6月土壤带菌率为42.2%，浓度值≥103CFU·g^-1的土样13份；7月土壤带菌率为44.4%，浓度值≥10³CFU·g^-1的土样26份；6月、7月土壤中梨火疫病菌浓度显著高于4月、10月、11月，致病风险较高。【结论】6月和7月土壤中梨火疫病菌浓度值最高，主要与4月、5月大量病花病果掉落造成病原菌积累有关。加强花期病害防治和梨园病残体清理可有效降...     

高质量提取柑橘样品中病原总核酸方法的建立

针对柑橘老熟组织中富含多糖、多酚、色素和其它次生代谢产物的特点,以柑橘老叶老皮为试材,在传统CTAB提取法的基础上通过添加增效剂并优化配方,建立了一种快速、简便的提取植物老熟组织及其内部病原总核酸的CTAB-Triton提取法。新的提取液对细胞的裂解能力更强,且解决了传统CTAB溶液因低温析出而致DNA得率损失的弊端。比较了该法和微量葡聚糖柱纯化法制备模板时韧皮部杆菌的检出率,并用该法制备模板,分析了韧皮部杆菌在柚子叶片中的分布情况,及对其它几种柑橘病原菌进行PCR/RT-PCR检测。结果表明,CTAB-Triton方法能有效提取柑橘老熟叶片的DNA,所得DNA质量高,产量比商品化试剂盒大,提高了韧皮部杆菌的检出率,且可用于柑橘其他病原真菌、细菌,以及DNA或RNA病毒病害的PCR/RT-PCR检测,也可用于定量PCR检测和病原种群多态性分析。     

番茄过表达SlMYB102对种子萌发及生长的影响

番茄（Solanum lycopersicum L.）基因组中已鉴定到121个R2R3-MYB转录因子,但其中绝大多数的生物学功能仍然未知。为探究R2R3-MYB转录因子基因SlMYB102的功能,从‘Micro-Tom’番茄中,利用PCR技术克隆了SlMYB102的编码区,全长为1 089 bp。保守结构域和系统进化树分析显示,SlMYB102蛋白包含两个保守的MYB结构域,与马铃薯的StMYB34同源性最高。亚细胞定位结果显示,SlMYB102编码的蛋白定位于细胞核中。SlMYB102在根、茎、叶、花和未绿熟、红熟果实中均有表达,在茎、叶、花中表达量较高。利用农杆菌介导,将35S::SlMYB102转入番茄,获得了两个过表达株系。与野生型相比,过表达株系种子萌发速率明显升高,而植株高度、叶面积、地上部及地下部的鲜质量均显著降低。显微观察结果表明,与野生型相比,过表达株系叶片表皮细胞面积大小并没有变化,推测过表达SlMYB102是通过减少细胞分裂来抑制番茄植株的生长。     

基于计算机视觉技术的番茄叶部病害识别

以计算机视觉技术为手段,结合图像处理和模式识别技术,研究了番茄早疫病、晚疫病、叶霉病和棒孢叶斑病等4种叶部病害的自动识别方法。建立了一套适用于室内操作的图像采集处理系统,可进行病害样本图像的采集、预处理和病斑区域的分割。提取了每个病斑区域的9个颜色参数、5个纹理参数和4个形状参数,同时采用逐步判别与贝叶斯判别相结合和主成分分析与费歇尔判别相结合的两种方法实现特征参数的提取和判别模型的构建。逐步判别从提取的18个特征参数中选择了12个参数用于构建贝叶斯判别模型,结果对训练样本和测试样本的识别准确率分别达到100%和94.71%。主成分分析则将18个特征参数综合成2个新变量,构建的费歇尔判别函数对样本的总体识别准确率为98.32%。两种方法均获得了较好的分类效果,说明利用计算机视觉技术可以实现对番茄叶部病害的快速、准确识别,为实现番茄病害的田间实时在线检测提供了可能。     

番茄灰霉病和叶霉病拮抗细菌WXCDD51的筛选鉴定及其生防促生作用

从健康番茄植株根际土中分离筛选得到对番茄灰霉病菌和番茄叶霉病菌均有较强拮抗作用的生防细菌WXCDD51,通过形态特征、生理生化特征和16S r DNA序列分析鉴定其属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。菌丝生长试验研究结果表明,该菌株的无菌滤液可以显著抑制番茄灰霉病菌和番茄叶霉病菌菌丝生长,抑制率分别为94.29%和94.06%;盆栽试验结果表明,该菌株可以有效防治番茄灰霉病和番茄叶霉病,防效分别为66.23%和69.45%;拮抗试验显示,该菌株对10种植物病原真菌均有不同程度的抑制作用,抑菌率在53.04%~94.59%;促生试验表明,该菌株对番茄种子萌发及幼苗生长均具有一定的促进作用,用浓度为10~6 cfu·mL~(-1)的菌液浸种处理,种子发芽率、胚根长度与对照相比分别增加80.0%和62.57%。用菌液(10~7 cfu·mL~(-1))灌根处理的番茄幼苗,其各项生理指标均显著高于对照;用菌液(10~7 cfu·mL~(-1))浸泡番茄果实可防止腐烂且对果实营养品质无不良影响。     

应用DTBIA技术快速检测柑橘黄龙病菌研究

柑橘黄龙病病原菌为韧皮部限制性寄生菌Candidatus Liberibacter,迄今为止尚未成功获得离体纯培养。因此基于特异性抗体的高通量血清学检测技术迄今尚未开发。本实验室前期研究利用异源表达重组黄龙病菌外膜蛋白Omp_(CLas)免疫动物,制备并获得了特异性多克隆抗体(Anti-Omp_(CLas)-Pab)。本研究利用直接组织印迹免疫法(Direct tissue blot immunoassay,DTBIA)技术对获得的多克隆抗体的检测效果进行了初步评价,证实该抗体可以特异性识别中国不同地理来源的柑橘黄龙病菌分离物;柑橘叶柄、叶片中脉、枝条、根部、果梗和种子中均存在黄龙病菌,其中根部和种子中的病菌含量相对较低,枝条和叶片中脉中的含量较高。该多克隆抗体的获得为后续快速检测试剂盒或试纸条的研发奠定了基础。     

哈茨木霉诱导番茄叶片光合生理变化的研究

 采用室内对峙培养筛选与田间防效比较相结合的方法,对哈茨木霉抑制番茄叶霉病菌的机 制进行了研究。对峙培养结果显示,5 个木霉菌菌株均覆盖或侵入了病原菌菌落,其中菌株TH16 和TH54 对病菌的抑制作用较强。田间防效试验表明,木霉菌TH16 和TH54 孢子悬浮液浓度在108 个 · mL-1 时防 效最好,分别为69.4%和60.0%。接种木霉后,番茄植株的净光合速率（Pn）、胞间CO2 浓度（Ci）、气孔 导度（Gs）、CO2 光饱和同化速率（Asat）、Rubisco 最大羧化（Vcmax）、RuBP 最大再生速率（Jmax）及Rubisco、 FBPase 活性均明显增加。而接种叶霉病菌导致光合速率下降的同时伴随着Vcmax 和Jmax 的下降。预接种木 霉菌能将叶霉病菌导致的Pn、Asat、Vcmax、Jmax 抑制消除并恢复到对照水平。接种木霉能显著增加光合相 关基因的表达量,FBPase、FBPA、SBPase 和TPI 分别较对照增加了6.53 倍、3.51 倍、5.17 倍和7.81 倍。 研究结果表明木霉菌通过激活与光合相关酶活性及基因表达缓解了叶霉菌对番茄光合生理的抑制作用。     

我国6个省份番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒复合侵染率及序列系统发育分析

于2017～2019年在我国6个省份的番茄主产区，采集疑似番茄褪绿病毒（tomato chlorosis virus，ToCV）和（或）番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）侵染的番茄样本，利用特异性引物进行RT-PCR 或PCR 扩增，将符合预期条带大小的PCR 产物测序后进行系统发育分析。结果表明，我国6 个省份番茄ToCV 和TYLCV 的复合侵染率为25.29%，其中山东省两种病毒复合侵染率最高，为46.43%。序列分析结果表明，测定的ToCV CP 基因序列与已报道的对应序列同源性在98.30% 以上，ToCV CP 基因序列没有发生明显的遗传分化；TYLCV 基因组部分序列与已报道的对应序列同源性在96.00% 以上，没有发生明显的遗传分化。