百子莲开花相关基因ApFT的克隆及表达分析

采用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）方法得到了百子莲（Agapanthus praecox ssp. orientalis）FT基因cDNA全长序列,命名为ApFT,GenBank登录号为KC951108。序列分析表明,百子莲ApFT基因cDNA全长815 bp,其中开放阅读框534 bp,编码177个氨基酸,5′非编码区（5′UTR）和3′非编码区（3′UTR）分别为89 bp和192 bp。ApFT编码的蛋白有一个单一而非常保守的PEBP（Phosphatidylethanolamine-binding protein,PEBP磷酸乙醇胺结合蛋白）结构域,与玉米（MFT2）、拟南芥（AtFT）和温州蜜柑（CuMFT1）等植物的FT蛋白有较高的相似性,同源性均在50%以上。系统进化树分析表明,百子莲ApFT与玉米（MFT2）聚类关系最近。实时荧光定量qRT-PCR结果显示,整个花芽分化过程中ApFT在叶片中表达量高,茎尖中表达量低。随着花芽分化的进程,在叶片中ApFT表达量逐渐降低,而茎尖中ApFT的表达量在诱导期均高于营养期和花芽分化期,推测该基因可能在调节百子莲花芽分化过程中发挥重要作用。     

百合肌动蛋白基因lilyActin 的克隆与表达分析

 为了在百合功能基因表达研究中选择一个理想内参基因,依据岷江百合cDNA 文库所获得的百合肌动蛋白（Actin）基因的EST 序列,采用RACE 技术进行该基因cDNA 全长克隆,并利用实时荧光定量PCR 分析其在不同组织中的表达模式,获得百合肌动蛋白基因cDNA 全长序列（GenBank 登录号：JX826390）,命名为lilyActin。该基因cDNA 全长1 367 bp,其中,5′非编码区91 bp,3′非编码区233 bp,开放读码框1 134 bp,编码377 个氨基酸。序列比对发现,该基因与其它15 种植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性均在80%以上,氨基酸序列的相似性达98%。进化分析显示,百合肌动蛋白与郁金香肌动蛋白的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR 结果显示,该基因在百合的花蕾、叶片和鳞片组织中恒定表达,表明相对于其他物种的内参基因,lilyActin 更适宜作为百合属植物的内参基因。     

侵染广东辣椒的辣椒脉斑驳病毒的分子特征

辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus,ChiVMV）是引起广东辣椒病毒病的主要病原之一,为了明确侵染为害广东辣椒的ChiVMV分子特征,采用分段RT-PCR和RACE扩增方法克隆了ChiVMV广东分离物（ChiVMV-GD）的基因组全序列,结果表明,除poly（A）尾外,ChiVMV-GD基因组大小为9 721 nt,编码一个大小350.44 kD多聚蛋白（位于167 ~ 9 436 nt）,5′–非编码区（5′-UTR）和3′–非编码区（3′-UTR）分别含有166和285 nt,5′–末端结合病毒基因组连接蛋白（VPg）,3′–末端含有poly（A）尾。序列同源性分析结果表明：ChiVMV-GD与ChiVMV其他分离物的基因组序列同源率为79.1% ~ 96.9%,其中与来自中国海南分离物（登录号：GQ981316.1）的同源率最高（96.9%）。系统进化分析结果显示,ChiVMV-GD与海南分离物聚集在一个小分支,说明与海南分离物亲缘关系最近。     

牡丹查耳酮合酶基因Ps-CHS1的克隆及其组织特异性表达

以牡丹（Paeonia suffruticosa）品种‘彩绘’为试材,采用RT-PCR和RACE方法从花瓣中获得了一个牡丹查耳酮合酶（chalcone synthase,CHS）基因cDNA全长,命名为Ps-CHS1,GenBank登录号为GQ483511。序列分析结果表明,Ps-CHS1全长1 475 bp,包含82 bp的5′非编码区、208 bp的3′非编码区和一个长度为1 185 bp编码394个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列分析显示该基因编码的蛋白具有CHS家族保守存在的所有功能活性位点和特征多肽序列。序列比对和系统进化分析表明,Ps-CHS1与杨柳科、锦葵科、蔷薇科等植物的CHS亲缘关系较近,相似性达90%以上。相对荧光定量PCR分析表明,Ps-CHS1在花瓣中的表达量最高,其次是萼片,再次是叶片和雄蕊,在心皮中表达量最低。     

杧果Rab蛋白基因MiRab11的克隆及表达分析

根据前期对杧果（Mangifera indica L.）胁迫差异分析中获得的Rab11 片段,采用RT-PCR结合RACE 技术,从‘四季杧’混合组织材料（叶、茎、花和果实）中克隆了一个Rab11 完整编码区序列,命名为MiRab11。其cDNA 全长902 bp,包含完整开放阅读框657 bp,编码218 个氨基酸。同源性分析表明MiRab11 与葡萄和柑橘的同源性最高（相似度均为97%）。实时荧光定量检测结果表明：MiRab11在杧果叶、茎、花和果实中均有表达,在嫩茎和花后70 d 的成熟果实中的表达较高;在果实形成及发育初期表达量略有下调,但在果实成熟过程中表达量明显上调;逆境胁迫（低温、盐、干旱）处理可引起在叶或茎中上调表达;不同信号物质（脱落酸、水杨酸、双氧水）刺激均可引起叶中的表达上调。结果表明,MiRab11 可能在杧果果实成熟和胁迫反应中发挥重要作用。     

马铃薯C-8,7甾醇异构酶基因(StSI1) cDNA克隆及表达

 以拟南芥C-8, 7甾醇异构酶的氨基酸序列为信息探针搜索GenBank数据库, 对高度同源的马铃薯EST序列进行拼接、引物设计和RT2PCR扩增, 扩增产物测序结果证实获得一个马铃薯C-8, 7甾醇异构酶基因(StSI1) 的全长cDNA序列。序列分析结果显示, StSI1全长886 bp, 包含59 bp的5′非编码序列、161 bp的3′非编码序列和一个长度为666 bp编码221个氨基酸的开放阅读框, 分子量约为25 kD。氨基酸结构分析显示该蛋白的N端含有一个长度由35个氨基酸残基组成的信号肽, C端成熟肽区域含有典型的类EBP结合域。氨基酸比对分析表明, StSI1与已知C-8,7甾醇异构酶同源性介于32.9% ～61.3%之间, 与拟南芥AtSI1相似性最(61.3% ) 。RT-PCR 表达谱分析显示, StSI1在马铃薯的块茎芽眼和表皮组织中均能表达, 并且该基因的表达水平受贮藏温度升高和光照增强的正向调节。     

杧果MiCO基因的克隆与表达模式分析

【目的】克隆杧果(Mangifera indica L.)MiCO基因并探讨其表达模式,为深入研究该基因的功能奠定基础。【方法】根据从杧果转录组测序数据中获得一个MiCO基因全长序列信息,设计基因全长引物,克隆具有不同开花习性的‘四季杧’和‘紫花杧’2个品种的MiCO基因全长序列,对其序列进行生物信息学分析,并利用荧光定量PCR技术对MiCO基因在杧果不同组织以及年周期的表达情况进行分析。【结果】序列分析显示,2个杧果品种的MiCO基因c DNA全长均为1 150 bp,都包含1个966 bp的开放阅读框,编码322个氨基酸,等电点为5.8,‘四季杧’品种的MiCO蛋白分子质量为35.30 ku,‘紫花杧’品种的MiCO蛋白分子质量为35.22 ku;MiCO基因编码的蛋白具有典型的CO同源蛋白结构,包括B-box1、B-box2和CCT结构域;系统进化树表明,杧果MiCO蛋白属于第一类CO蛋白,与拟南芥(Arabidopsis thaliana)At COL4相似性最高而聚类到一起。基因表达分析表明,MiCO基因在杧果不同组织中均表达,但不同组织的表达水平存在差异。年周期表达分析表明,MiCO基因在杧果成花转变期高度表达,而且在来年的5—6月还存在一个小的表达高峰期,但2个品种不同组织中MiCO基因表达存在差异。【结论】克隆获得杧果MiCO基因全长序列,发现2个具有不同开花习性的杧果品种的MiCO基因核苷酸和氨基酸序列高度同源,只存在少许差异。MiCO基因在杧果成花转变期高度表达,说明MiCO基因与杧果成花关系密切。     

川乌头F3′5′H 基因的cDNA 克隆与表达分析

 利用RT-PCR 结合RACE 技术,从川乌头（Aconitum carmichaeli Debx.）花朵中克隆到1 个类黄酮–3′,5′–羟基化酶基因的cDNA 全长序列,全长1 720 bp,包含1 个编码506 个氨基酸的开放阅读框,命名为Ac-F3′5′H（GenBank 登录号：JN635708）。序列分析表明Ac-F3′5′H 编码的氨基酸序列中包含有已确定的保守基序,包括CYP 基序、I 螺旋区和血红素结合区等。氨基酸序列比对显示Ac-F3′5′H 与其它物种的F3′5′H 有很高的序列相似性。以川乌头18S rRNA 基因（FJ748878）为内参,通过半定量RT-PCR对Ac-F3′5′H 的时空表达模式进行了分析,结果显示Ac-F3′5′H 随花朵发育,表达量呈递增趋势,并且在正在开放的花朵中达到最高,而在根、茎、叶中不表达,推测该基因可能在调节川乌头蓝色花朵形成中发挥作用。     

羽衣甘蓝Exo70A1基因的分离及表达分析

 以羽衣甘蓝（Brassica oleracea var. acephala）自交不亲和系（S13-b S13-b）为试材,从柱头中分离Exo70A1基因,命名为BoExo70A1,GenBank登录号为JF919716。BoExo70A1全长cDNA序列为2 184 bp,包含56 bp的5′非编码区,211 bp的3′非编码区和一个长度为1 917 bp的开放读码框（ORF）,对应编码一个含有638个氨基酸残基的蛋白质。氨基酸序列比对分析表明,羽衣甘蓝BoExo70A1与油菜BnExo70A1、拟南芥AtExo70A1的一致性分别为99%和94%;BoExo70A1基因结构含12个外显子和11个内含子,内含子5′供体位点和3′受体位点边界序列符合GU-AG规则;Southern杂交结果显示,BoExo70A1在羽衣甘蓝基因组中存在多拷贝;Northern杂交结果显示BoExo70A1在茎、叶、花瓣、花药、柱头、花柱和子房中表达,而且在叶中的表达量最低。     

野蔷薇（Rosa multiflora）抗白粉病基因RmMlo的克隆与表达分析

以野蔷薇（Rosa multiflora）为试材,采用RT-PCR和RACE方法从叶片中获得了一个Mlo同源基因的cDNA全长,命名为RmMlo,GenBank登录号为JF310747。序列分析结果表明,RmMlo基因cDNA全长为1993bp,包含49bp的5′非编码区、243bp的3′非编码区和一个长度为1700b...     

杧果炭疽病菌内切葡聚糖酶基因CgEg1B克隆与敲除载体构建

为了明确内切葡聚糖酶CgEg1B与杧果炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides致病力的关系,本试验以杧果炭疽病菌DNA为模板,利用同源克隆技术扩增CgEg1B,对其序列特征、蛋白保守结构域进行分析,并借助In-Fusion HD Cloning Kit技术进行敲除载体构建。结果表明,该基因DNA和cDNA全长分别为1 077bp、1 020bp,编码区有内含子(57bp)1个,推测编码339个氨基酸,其分子量约为37.13kDa,等电点PI为5.11。与NCBI网站中已公布的基因进行Blastp比对,发现该序列与鳄梨炭疽菌C.gloeosporioides(EQB54542.1)的内切葡聚糖酶基因相似性为99%;该基因的敲除载体pCgEg1BGH-1构建成功。CgEg1B基因具备真菌内切葡聚糖酶基因家族的序列特征,推测CgEg1B基因可能与杧果炭疽病菌的侵入、定殖和致病性有关。     

牡丹病程相关蛋白1基因的克隆及表达分析

 以牡丹柱枝孢叶斑病病原菌Cylindrocladium canadense处理的牡丹‘鲁菏红’叶片为材料,根据已发表植物PR1的保守区域设计兼并引物,利用RT-PCR和RACE技术,获得病程相关蛋白1基因的cDNA,命名为PsPR1。该序列全长为744 bp,5′和3′非翻译区分别有42 bp和225 bp。该基因有477 bp的开放阅读框（ORF）,编码158个氨基酸,成熟蛋白分子量14.8 kD,等电点（pI）6.19,具有典型的SCP_PR1_like保守结构域。通过Blast比对发现该基因与多种植物病程相关蛋白1基因具有高度同源性。通过实时荧光定量PCR检测,发现该基因在牡丹萼片中相对表达量最高,在正常生长的叶片中最少。该基因受病原菌C. canadense和信号物质SA的显著诱导,分别在处理的24 h和12 h达到最高峰,说明PsPR1可能参与了牡丹的抗病防御过程。     

平邑甜茶MhHSP70的特征及其对镉和渗透胁迫的反应

 以平邑甜茶为试材,通过RT-PCR及RACE技术,获得了一个热激蛋白基因HSP70的全长cDNA序列,命名为MhHSP70,GenBank登录号为HQ876864;该基因全长2 307 bp,序列高度保守,编码650个氨基酸,与苹果、番茄和烟草亲缘关系最近。在根系和叶片中,热激蛋白基因MhHSP70的表达均受镉和渗透胁迫（非热胁迫）诱导,并且随着硫酸镉和氯化钠处理浓度的升高以及聚乙二醇（PEG）处理时间的延长,MhHSP70的表达量逐渐增强。     

牡丹SERK2基因的克隆和花芽休眠进程中细胞分裂频率分析

根据牡丹休眠相关的差减文库中筛选得到的类体细胞胚胎发生受体蛋白激酶基因SERK2的部分cDNA片段,采用RACE技术扩增到5′和3′ cDNA片段,通过拼接得到PsSERK2基因2 374 bp的全长cDNA序列,其中5′非编码区（UTR）为158 bp,3′UTR为341 bp,ORF为1 875 bp,编码625个氨基酸。同源性分析得出其与葡萄VvSERK2蛋白同源性最高,为92.95%。PsSERK2在初花期（大风铃期）茎中表达量最高,叶片中最低。Northern杂交和定量PCR结果均表明PsSERK2在低温解除牡丹花芽休眠前期上调表达,而后降低。低温累积过程中,花芽内各个组织细胞分裂频率逐渐增加。推测PsSERK2上调表达促进了休眠花芽的发育,进而促进内休眠的解除。     

荔枝漆酶基因LcLac 的克隆与表达分析

 为了探明荔枝漆酶基因LcLac的表达与果皮褐变之间的关系,通过筛选‘妃子笑’荔枝果皮cDNA文库和3′-RACE技术,克隆获得了荔枝LcLac全长cDNA序列（EU 527187.1）。该序列全长1 779 bp,5′-UTR长26 bp,3′-UTR长52 bp,含一个1 701 bp的完整开放阅读框,编码含566个氨基酸残基的多肽。该氨基酸残基序列与欧亚槭树等物种的漆酶蛋白相似性较高。荧光定量PCR结果表明,LcLac在荔枝花中表达量最高,果肉中表达量最低。在采后贮藏前期,随LcLac表达量上升果皮褐变指数升高,且褐变指数较高的‘妃子笑’果皮中LcLac表达量高于褐变指数低的‘紫娘喜’果皮。贮藏中后期严重褐变果皮中LcLac表达量比贮藏前期低。采后贮藏前期果皮中LcLac的上调表达可能对其褐变起促进作用。     

甜椒CaHSP26的cDNA克隆与表达

 用RT-PCR技术从热激处理的甜椒(Capsicum annuum L. ) 叶片中克隆了叶绿体小分子量热激蛋白(sHSP) 基因的cDNA序列, 其全长为917 bp, 命名为CaHSP26。Southern杂交分析表明该基因在甜椒基因组中为单基因。Northern杂交结果显示该基因在甜椒根、茎、叶中受高温诱导表达。高温( 50℃)胁迫下, 在大肠杆菌中异源表达CaHSP26可以维持大肠杆菌较高的细胞活力。这些结果表明在高温胁迫下植物叶绿体sHSP对细胞具有保护作用。     

茎瘤芥AP2/EREBP 转录因子基因BjABR1 的克隆和表达分析

 以茎瘤芥（Brassica juncea var. tumida Tsen et Lee）‘永安’为材料,通过RACE 和RT-PCR 技术得到1 个AP2/EREBP 转录因子基因的cDNA 全长序列和基因组DNA（gDNA）序列,该基因与拟南 芥AtABR1 基因的氨基酸序列相似性高达72%,因此命名为BjABR1（GenBank 登录号：JQ713825.1）。BjABR1 基因gDNA 序列含1 个内含子;cDNA 序列全长1 514 bp,含有1 个1 146 bp 的开放阅读框（ORF）,编 码381 个氨基酸;其推定编码的蛋白分子量为41.674 kD,等电点为9.11,具有14 个磷酸化位点,含1 个典型的AP2 DNA 结合域和1 个CMX-1 基序。洋葱表皮细胞的瞬时表达显示,BjABR1 蛋白定位于细 胞核。荧光定量PCR 分析结果表明,该基因在茎瘤芥不同发育时期的根、茎、叶中均有表达,但在根中 表达量极高;在对茎瘤芥组培幼苗进行高盐、渗透压和低温3 种非生物胁迫处理后发现,3 种胁迫均能诱 导该基因表达,但其对高盐的响应更为迅速。     

杧果细菌性角斑病菌phd基因克隆与序列分析

由柑桔黄单胞菌杧果致病变种Xanthomonas citri pv.mangiferaeindicae引起的杧果细菌性角斑病是杧果上一种重要的细菌性病害,严重危害杧果产业发展。本试验获得了柑桔黄单胞菌杧果致病变种菌株Xcm003 phd基因的全序列。序列分析显示,phd基因编码85个氨基酸,其理论分子量9.68 kD,理论等电点为9.39,是一种亲水性蛋白,无信号肽,有6个磷酸化位点以及1个结构域。系统进化树结果显示,该基因的氨基酸序列与X.citri pv.mangiferaeindicae LMG941的Phd蛋白聚为一类。     

香石竹切花水孔蛋白基因DcPIP2的克隆及特征分析

 采用RT-PCR和RACE技术从香石竹（Dianthus caryophyllus L.）叶片中获得质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic protein,PIP）类水孔蛋白（aquaporins,AQP）基因的cDNA全长序列,命名为DcPIP2,GenBank登录号为GU989036。该cDNA全序列长983 bp,包含有858 bp的完整阅读框（ORF）,编码285个氨基酸,分子量约为30.6 kD。克隆相应的DcPIP2基因组全长序列得知,该基因长2 635 bp（GenBank登录号为JF706350?）,包含由3个外显子和2个内含子组成的编码区序列。同源性分析显示,DcPIP2氨基酸序列与陆地棉（Gossypium hirsutum）PIP2;3（ACB42440）、麻疯树（Jatropha curcas）AQP（ABM54183）和巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）PIP2（ACV66986）氨基酸的同源性分别为89%、88%和87%。利用实时荧光定量PCR技术研究表明,DcPIP2基因在香石竹切花的叶片、茎颈部、花瓣、雌蕊、雄蕊和萼片中均有表达,表达量为雌蕊 > 花瓣 > 雄蕊 > 萼片 > 茎颈部 > 叶片。