苹果MdCBL家族基因表达分析及MdCBL1的功能鉴定

利用生物信息学的方法,对10个苹果MdCBLs家族蛋白的功能域进行预测,并与拟南芥AtCBLs家族的10个蛋白进行了系统进化分析,同时对苹果MdCBLs基因进行了系统的命名。利用qRT-PCR,检测了苹果MdCBLs基因在不同组织的表达及对非生物胁迫(包括盐、低温、ABA、干旱)的响应,结果表明,MdCBLs在苹果不同组织及非生物胁迫中起重要作用。另外,通过遗传转化苹果愈伤组织鉴定了MdCBL1在盐胁迫中的功能,MdCBL1过量表达明显提高了转基因愈伤组织的盐胁迫抗性。     

苹果MdMYB2基因对非生物胁迫的响应

为阐明苹果(Malus×domestica)R2R3-MYB转录因子基因MdMYB2在非生物胁迫条件下的生物学功能,对MdMYB2的启动子序列进行分析,发现其含有非生物胁迫相关顺式作用元件,且MdMYB2的表达量受外源ABA、聚乙二醇(PEG)和4℃低温的诱导。在不同处理对MdMYB2过表达拟南芥植株和MdMYB2过表达苹果愈伤组织的试验中发现,外源ABA处理抑制了MdMYB2转基因拟南芥种子的萌发,且转基因幼苗提高了对ABA的敏感性、耐旱性和抗冷性。同时,过表达MdMYB2的苹果愈伤组织也表现出对ABA敏感、耐旱和抗冷的表型。以上结果说明MdMYB2在植物的逆境胁迫响应中发挥重要作用。     

苹果MdMYB2基因的克隆及功能鉴定

以‘嘎拉’苹果为材料,采用同源克隆和PCR技术分离了苹果基因MdMYB2(基因序列号:MDP0000823458)。MdMYB2的开放阅读框(ORF)长度为873 bp,编码含有290个氨基酸的蛋白,预测其蛋白质分子量为32.92 kD,等电点为4.91。系统进化树分析显示,苹果MYB2与梨MYBL2亲缘关系最近,同源性最高。组织表达分析表明,MdMYB2在苹果的各个组织均有表达,在茎和果实中表达相对较高。MdMYB2的表达明显受盐胁迫的诱导。构建了MdMYB2的表达载体,并通过农杆菌介导的遗传转化得到了转基因苹果愈伤和转基因拟南芥植株。抗性试验表明,过量表达MdMYB2明显提高了转基因苹果愈伤对盐胁迫的抗性。此外,异位表达MdMYB2也能提高拟南芥对盐胁迫的抗性,以上试验结果表明MdMYB2在植物盐胁迫响应中发挥重要作用。     

苹果U-box型E3泛素连接酶MdPUB24的耐盐性和ABA敏感性鉴定

从‘皇家嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆了一个E3泛素连接酶基因(序列号:MDP0000199588)。基因序列测序发现,该基因包含长为1 212 bp完整的开放阅读框,编码404个氨基酸。系统进化树分析表明,这一E3泛素连接酶与拟南芥At PUB24同源序列相似性最高,因此将其命名为MdPUB24。利用Plant Care数据库进行启动子顺式作用元件预测分析表明,MdPUB24启动子序列中含有与脱落酸、光、茉莉酸及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdPUB24在‘皇家嘎拉’苹果的不同组织中均有表达,且在叶片中最高;外源ABA、NaCl和低温胁迫处理能够抑制‘皇家嘎拉’苹果组培苗中MdPUB24的表达。MdPUB24过量表达的‘王林’苹果愈伤组织和异位表达的拟南芥幼苗在盐胁迫条件下,生长势与野生型相比明显变弱,表明MdPUB24负调控盐胁迫。相反,在外源ABA处理条件下,MdPUB24过量表达苹果愈伤和异位表达拟南芥与对照相比,生长势明显增强,表明MdPUB24对ABA不敏感。     

MdMYB73的分子克隆及其在苹果愈伤组织和拟南芥幼苗中的盐抗性功能鉴定

从‘嘎拉’苹果中克隆了一个MYB转录因子基因(序列号:MDP0000894463)。该基因包含长为729 bp完整的开放阅读框,编码243个氨基酸,预测其蛋白质分子量为26.34 kD,等电点为9.29。系统进化树分析表明,这一MYB转录因子与拟南芥AtMYB73同源序列相似性最高,因此将其命名为MdMYB73。功能域分析表明,MdMYB73蛋白含有保守的R2R3-typeMYB绑定域。荧光定量PCR分析表明,MdMYB73在苹果的各个组织均有表达,在叶片和花中表达相对较高;MdMYB73的表达明显受盐胁迫的诱导。将异位表达MdMYB73的拟南芥幼苗进行抗盐鉴定,结果表明MdMYB73负调控拟南芥盐胁迫抗性;同时,AtSOS1,AtSOS3和AtNHX1抗盐相关基因的表达水平显著降低,表明MdMYB73可能负调控SOS反应,影响拟南芥抵抗高盐胁迫过程。将MdMYB73基因遗传转化苹果愈伤组织,抗盐表型分析表明,MdMYB73过量表达也明显降低了转基因愈伤组织对盐胁迫的抗性。     

苹果MdCYP707A家族基因表达分析和MdCYP707A1的功能鉴定

对苹果Md CYP707A家族4个成员的蛋白序列进行比对,并进行保守结构域分析发现,MdCYP707A家族成员都含有细胞色素P450单加氧酶结构域。利用荧光定量PCR检测其在苹果不同组织(根、茎、叶、花、果实、种子)中的表达,4个基因在种子中的表达量最高,并且在果实发育不同时期的表达量有明显差异。在苹果种子吸水膨胀和层积过程中的表达分析表明,MdCYP707A家族成员参与了种子萌发过程中ABA的降解。通过检测MdCYP707A基因对不同非生物胁迫(干旱、盐、渗透胁迫)和对ABA的响应,初步认为其在种子萌发中有重要作用,其中,MdCYP707A1对ABA的响应最为明显。另外,利用农杆菌介导的遗传转化的手段,鉴定了MdCYP707A1基因在苹果愈伤组织和拟南芥中的功能,过表达MdCYP707A1能够降低对非生物胁迫的抗性,说明其可能参与ABA的降解过程,同时在拟南芥中异源表达MdCYP707A1能够提高拟南芥种子的萌发率。     

苹果细胞分裂素氧化酶基因MdCKX7.2的克隆及抗性鉴定

采用同源克隆和PCR技术从‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆细胞分裂素氧化酶基因MdCKX7.2(基因序列号:MDP0000279125)。该基因含有1 542 bp的完整开放阅读框,编码513个氨基酸。利用Plant CARE数据库对MdCKX7.2启动子顺式作用元件进行预测分析,发现MdCKX7.2启动子序列中存在光、干旱、脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯等响应元件。基因表达分析发现,‘嘎拉’幼苗中MdCKX7.2的表达明显受干旱和ABA的诱导。通过农杆菌介导的遗传转化获得MdCKX7.2转基因拟南芥植株。抗性试验表明,异位表达MdCKX7.2基因明显提高了拟南芥对干旱胁迫的抗性。拟南芥种子萌发试验表明,在拟南芥中异位表达MdCKX7.2提高了植株对ABA的敏感性,种子萌发率和幼苗鲜质量明显下降,与种子萌发相关基因的表达量明显上调。以上试验结果表明,MdCKX7.2在植物非生物胁迫响应中发挥重要作用。     

垂丝海棠MhMYB114-Like的克隆及其在苹果愈伤组织中的抗缺铁功能鉴定

从苹果砧木垂丝海棠(Malus halliana Koehne)中克隆得到了Mh MYB114-Like基因(序列号:LOC103405832)。该基因包含全长为602 bp的完整开放阅读框,编码200个氨基酸,蛋白质等电点为9.38。系统进化树分析表明,Mh MYB114-Like与野草莓该家族蛋白亲缘关系最近。分析Mh MYB114-Like的启动子区域发现包含干旱、光、生长素和黄化响应等顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,在缺铁胁迫下Mh MYB114-Like在垂丝海棠叶和根中表达水平显著上升,Mh MYB114-Like的表达明显受缺铁胁迫的诱导。将Mh MYB114-Like遗传转化‘王林’苹果愈伤组织,通过测定相关生理指标进行抗性分析发现,过量表达Mh MYB114-Like可明显提高转基因愈伤组织对缺铁胁迫的抗性。结果表明Mh MYB114-Like可响应缺铁胁迫,在抵抗缺铁胁迫中具有重要作用。     

苹果6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶Md6PGDH6基因的功能鉴定

【目的】探究苹果6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶Md6PGDH6基因的性质及其生物学功能。【方法】利用PCR技术得到MDP0000235230(Md6PGDH6)基因的全长,进行相关生物信息学分析,利用qRT-PCR技术研究其时空表达模式,利用农杆菌介导的转化方法获得Md6PGDH6转基因‘王林’愈伤组织,以及异源表达Md6PGDH6基因的拟南芥和烟草。【结果】MDP0000235230基因与拟南芥AT4G29120.1(At6PGDH6)归为一类,将MDP0000235230命名为Md6PGDH6基因。Md6PGDH6基因包含一个942 bp开放阅读框。在线网站预测发现,Md6PGDH6蛋白整体表现为亲水性。启动子分析发现,其含有分生组织、激素响应、环境因子和非生物胁迫响应顺式作用元件。Md6PGDH6基因在茎、果皮、果肉和种子中表达量较高,在根、叶和花中表达量较低。Md6PGDH6基因促进‘王林’愈伤组织、拟南芥和烟草的生长。【结论】Md6PGDH6在果肉中表达量较高,Md6PGDH6基因有助于‘王林’愈伤组织的生长。     

过表达苹果多肽激素基因MdCEP1促进花青苷积累

以‘王林’苹果(Malus×domestica‘Orin’)愈伤组织为试材,初步探讨苹果多肽激素Md CEP1(C-TERMINALLY ENCODED PEPTIDE1)在调控花青苷合成方面的作用。分析显示Md CEP1位于苹果第15号染色体,只有1个外显子。蛋白序列比对显示不同物种中CEP结构域非常保守。启动子分析表明,Md CEP1启动子序列包含多个顺式作用元件,包括与分生组织有关的CAT-box元件、赤霉素响应元件(P-box)、光响应元件(MNF1)和与类黄酮合成相关的MYB类蛋白结合位点(MBSI)。通过农杆菌介导的遗传转化获得Md CEP1转基因苹果愈伤组织,进一步分析发现过表达Md CEP1能够明显促进愈伤组织花青苷积累,并且促进花青苷合成相关基因的表达。Md CEP1在拟南芥中异位表达,同样能够促进拟南芥中花青苷的积累,并且促进拟南芥花青苷合成相关基因的表达。研究结果表明,Md CEP1能够正调控苹果花青苷的合成。     

苹果生长素阻遏蛋白基因MdIAA26的分子克隆与功能鉴定

从‘皇家嘎拉’苹果（Malus × domestica Borkh.）中克隆了一个生长素阻遏蛋白家族基因（基因序列号MDP0000164095）。测序发现,该基因包含长为978 bp完整的开放阅读框,编码325个氨基酸。系统进化树分析表明,这一生长素阻遏蛋白与拟南芥IAA26同源序列相似性最高,因此将该基因命名为MdIAA26。利用PlantCare数据库进行基因启动子顺式作用元件预测分析发现,MdIAA26启动子序列中含有与脱落酸（ABA）、赤霉素（GA）、水杨酸（SA）及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdIAA26在苹果的各组织中均有表达,在根和叶片中表达量相对较高;苹果组培苗中MdIAA26的表达明显受到ABA和IAA的诱导。MdIAA26过量表达的苹果愈伤组织在外源ABA处理下和MdIAA26异位表达拟南芥在外源ABA、PEG和IAA处理条件下,生长势均明显比野生型对照强,表明MdIAA26降低了对ABA和IAA的敏感性和对干旱的抗性。     

苹果6–磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因Md6PGDH1的克隆和功能分析

以‘嘎拉’苹果为材料,克隆了6–磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因Md6PGDH1(序列号:MDP0000279299)全长。序列分析显示,该基因包含一个长为1 047 bp完整的开放阅读框,编码347个氨基酸,分子量为36.430 k D,预测等电点为9.24。同源性分析表明Md6PGDH1还有另外3个同源基因;功能域分析表明Md6PGDH蛋白含有两个保守的绑定域;亚细胞预测表明Md6PGDH定位存在差异。分析Md6PGDH1启动子发现存在多个响应非生物胁迫的顺式作用元件。定量分析显示,Md6PGDH1在苹果的不同组织中都有表达,且受非生物胁迫诱导。原核诱导Md6PGDH1蛋白并进行蛋白酶活的测定,为后续蛋白功能鉴定奠定了基础。Md6PGDH1在苹果愈伤组织中过量表达,提高其抗盐胁迫的能力。     

红肉苹果冷信号基因MdICE1的表达及其蛋白与MdMYB的互作

根据拟南芥AtICE1蛋白序列在苹果基因组中Blast比对得到苹果同源蛋白序列,利用DNAMAN软件设计特异性引物并克隆苹果冷信号基因（MDP0000662999）,暂命名为MdICE1。以从新疆红肉苹果与‘富士’杂交F1代中选出的‘紫红3号’叶片诱导出的红色愈伤组织为试材克隆MdICE1,测序发现该基因的开放阅读框长度为1 626 bp,编码541个氨基酸。进化树分析表明,MdICE1与AtICE1在同一进化支上,推测它们具有相似的功能。氨基酸序列比对发现,MdICE1存在bHLH基序。低温处理有利于苹果愈伤组织花青苷的累积;与培养在24 ℃下的愈伤组织相比,低温（8 ℃）诱导苹果愈伤组织冷信号基因MdICE1以及花青苷合成相关转录因子基因MdMYB10和MdbHLH3的表达。酵母双杂交试验证明MdICE1可以与MdMYB10相互作用;亚细胞定位发现MdICE1蛋白存在于细胞核内;转化大肠杆菌并诱导获得了MdICE1的重组蛋白,为进一步研究MdICE1蛋白在花青苷代谢途径中的功能奠定了基础。     

苹果MdNAC143的克隆及其在苹果愈伤组织的抗盐功能鉴定

从‘嘎拉’苹果中克隆了一个NAC转录因子基因MdNAC143(序列号:MDP0000334047),其开放阅读框为924 bp,编码308个氨基酸,预测蛋白质的分子量为35.59 k D,等电点为6.32。结构域分析表明,MdNAC143蛋白N端含有保守的NAC结构域。酵母双杂交结果表明MdNAC143的全长及C端具有转录激活活性。荧光定量PCR分析表明,MdNAC143在苹果的各个组织均有表达,其中在叶片和花中表达相对较高;MdNAC143的表达明显受盐胁迫的诱导。将MdNAC143遗传转化‘王林’苹果愈伤组织,进行抗盐表型鉴定后发现,MdNAC143在愈伤组织中过量表达后能明显提高对盐胁迫的抗性。