红肉脐橙番茄红素β-环化酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的功能表达

以'红肉脐橙'(Citrus sinensis Osbeck'Cara Cara')果实中分离的mRNA为模板,经RT-PCR扩增到约1.6 kb的番茄红素β-环化酶(lycopene β-cyclase,Leyb)cDNA片段.序列分析表明,该cDNA长1 654 bp,包含两个转录本Lcyb1和Lcyb2,最大开放读码框均为1 512 bp,可编码504个氨基酸.通过PCR方法获得红肉脐橙Lcyb1和Lcyb2 cDNA编码区全长,构建了Lcyb1和Lcyb2的原核表达载体pET-CitL-cyb1和pET-CitLcyb2,并通过颜色互补试验证实表达的融合蛋白6×His-Lcyb1和6×His-Lcyb2均可将番茄红素转化为β-胡萝卜素.     

红色和橙黄色果肉西瓜番茄红素和β–胡萝卜素代谢基因的表达分析

以橙黄色果肉西瓜‘WM-Clr-2’及红色果肉西瓜‘PI 179881’为试材,采用HPLC法分析其番茄红素及β–胡萝卜素在7个发育时期的积累情况,同时采用q RT-PCR技术分析番茄红素和β–胡萝卜素代谢途径中8个关键酶基因(PSY1、PSY2、PDS、ZDS、CRTISO、LCYB、NCED1和NCED7)的表达量。结果显示,随着果实的发育,番茄红素和β–胡萝卜素含量均不断增加,且在同一时期,红色果肉‘PI 179881’中的含量始终大于‘WM-Clr-2’。q RT-PCR结果显示PSY1在‘PI 179881’中的表达量高于‘WM-Clr-2’,LCYB和NCED1在‘WM-Clr-2’中的表达量高于红色果肉‘PI 179881’。分析番茄红素及β–胡萝卜素的积累规律与相关基因表达规律说明PSY1的大幅上调表达,LCYB的下调表达及NCED1的低表达可能是红色果肉‘PI 179881’中番茄红素和β–胡萝卜素大量积累的主要原因。PSY1的低表达水平,LCYB和NCED1的高表达水平可能是橙黄色果肉‘WM-Clr-2’中番茄红素及β–胡萝卜素积累量少的主要原因。     

红肉脐橙番茄红素β-环化酶基因的克隆及在大肠杆菌中的功能表达

以'红肉脐橙'（Citrus sinensis Osbeck 'Cara Cara'）果实中分离的mRNA为模板,经RT-PCR扩增到约1.6 kb的番茄红素 β-环化酶（lycopene β-cyclase,Lcyb）cDNA片段。序列分析表明,该cDNA长1654 bp,包含两个转录本Lcyb1和Lcyb2,最大开放读码框均为1512 bp,可编码504个氨基酸。通过PCR方法获得红肉脐橙Lcyb1和Lcyb2 cDNA编码区全长,构建了Lcyb1和Lcyb2的原核表达载体pET-CitLcyb1和pET-CitLcyb2,并通过颜色互补试验证实表达的融合蛋白6×His-Lcyb1和6×His-Lcyb2均可将番茄红素转化为β-胡萝卜素。     

超表达草生欧文氏菌crtB基因促进转基因番茄类胡萝卜素合成的研究

利用重组PCR 技术,将草生欧文细菌八氢番茄红素合成酶基因crtB 与豌豆质体定位序列ts-rbcS 融合,插入质粒载体PMV 中,构建了植物表达载体pBI-ts-rbcS-crtB,并通过根瘤农杆菌EHA105介导转化番茄。PCR 检测、Southern 杂交和RT-PCR 分析表明,外源基因crtB 已整合到番茄基因组中,并在转基因植株中得到表达。转基因番茄果实中的类胡萝卜素总量增加1.3 ~ 2.5 倍,八氢番茄红素、番茄红素、β–胡萝卜素和α–胡萝卜素分别增加了4.3、1.8、2.2 和2.3 倍。转化株系中内源类胡萝卜素合成基因的表达也受到广泛的影响。crtB 基因过量表达有效促进了番茄果实中类胡萝卜素的合成和积累。     

杏香气形成特异基因PaCCD1的克隆与功能分析

以‘轮台小白杏’果实为材料,利用转录组测序筛选获得的类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD1基因片段设计特异引物,使用 RACE技术克隆全长cDNA序列,命名为PaCCD1。该基因长为1 885 bp,开放阅读框（ORF）1 644 bp,编码547个氨基酸残基,蛋白质分子量为61.699 kD。氨基酸序列比对发现,PaCCD1与甜瓜等其他已知功能的CCD1相似,具有4个保守的组氨酸残基、2个半保守的谷氨酸残基和1个天冬氨酸残基。活性位点分析表明,PaCCD1编码的蛋白存在多个糖基化位点和磷酸化位点。进化树分析表明,PaCCD1与AtCCD1（拟南芥）及碧桃等的CCD1在同一分支上,其中与PpCCD1（碧桃）和CmCCD1（甜瓜）的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,PaCCD1在杏幼果中表达量最高,在花中表达量次之,而在根、叶和1年生枝条中不表达,具有组织表达特异性。杏果实发育和成熟过程中,果皮和果肉中PaCCD1的表达均显著上调,主要类胡萝卜素β–胡萝卜素和叶黄素的含量显著下降,而脱辅基类胡萝卜素类香气物质二氢–β–紫罗兰酮、β–紫罗兰酮和β–大马酮的含量显著增加。将目的基因通过转化大肠杆菌,获得了体外表达蛋白,饲喂类胡萝卜素的底物特异性测定发现,PaCCD1蛋白能较快吸收β–胡萝卜素产生二氢–β–紫罗兰酮和β–紫罗兰酮,能吸收叶黄质产生β–大马酮。据此推测PaCCD1是控制杏果实脱辅基类胡萝卜素类香气物质形成的关键基因。     

超量表达欧李ChPSY基因促进转基因番茄类胡萝卜素合成的研究

将从欧李果实中分离的ChPSY cDNA经过序列分析、酶切之后,连接到植物表达载体PMV,构建了植物重组载体pBI-ChPSY,并通过根瘤农杆菌EHA105介导转化番茄,获得了12株抗性植株。PCR检测和Southern杂交结果显示,12株抗性植株均为阳性,说明外源基因ChPSY整合到转化植株的基因组中。RT-PCR分析表明,ChPSY基因在转化植株果实中得到表达。HPLC分析表明,转ChPSY基因番茄果实中总类胡萝卜素含量增加了1.62 ~ 3.04倍,八氢番茄红素、番茄红素、β–胡萝卜素和α–胡萝卜素含量分别增加了4.87、2.10、2.59和3.25倍。转化植株中内源类胡萝卜素合成基因的表达也受到广泛的影响。ChPSY基因超量表达有效促进了番茄果实中类胡萝卜素的合成和积累。     

利用CRISPR/Cas9技术创制高番茄红素番茄新材料

以大果型栽培番茄资源“T048”为材料,利用CRISPR/Cas9技术对滞绿基因SlSGR1进行定向编辑。对19株转基因阳性株系进行靶位点序列分析发现,共有10株发生了编辑事件,编辑效率为52.6%。通过测序分析发现,编辑类型涉及碱基的缺失、插入及替换,多数发生在PAM序列上游3～4 bp碱基处,同时也发现了两个编辑位点间共565 bp的序列倒位。表型分析发现,T1代纯合编辑株系叶片衰老减缓,果实表现为铁锈色,且番茄红素、叶绿素及β–胡萝卜素含量显著提高。对类胡萝卜素合成关键基因进行分析发现,纯合编辑株系果实中的SGR1表达量显著降低,而PSY1表达量显著提高。结果表明,通过CRISPR/Cas9技术对滞绿基因SlSGR1进行定向编辑可有效提升番茄果实中番茄红素、β–胡萝卜素等类胡萝卜素含量,进而为番茄营养品质育种提供新种质。     

芹菜中类胡萝卜素合成相关番茄红素ε–环化酶基因AgLCYE的克隆与表达分析

番茄红素ε–环化酶(lycopene epsilon cyclase,LCYE)是类胡萝卜素合成途径中的关键酶。从‘津南实芹’中克隆获得番茄红素ε–环化酶基因AgLCYE。序列分析结果显示,AgLCYE包含1个1 590bp的开放阅读框,编码529个氨基酸。氨基酸序列多重比对表明,芹菜和其他物种的LCYE同源性为77.68%,AgLCYE和同属伞形科的胡萝卜LCYE氨基酸序列同源性高达98.07%。AgLCYE蛋白与胡萝卜LCYE蛋白进化关系最近。AgLCYE蛋白属于亲水性蛋白,预测的蛋白质三级结构中有9个α螺旋和18个β折叠。无序化分析结果表明,AgLCYE编码的氨基酸序列有4个无序化区域。用UPLC方法对30、45和60 d龄芹菜叶中叶黄素和α–胡萝卜素的含量进行测定,30 d时叶黄素含量最高,45 d时最低,45和60 d时无显著性差异,叶片中的叶黄素含量均高于叶柄。芹菜叶片和叶柄中均没有检测到α–胡萝卜素的存在。荧光定量表达分析结果显示,随着生长期的增加,叶片中AgLCYE的相对表达量逐渐升高;叶柄中逐渐降低。     

荔枝类甜蛋白基因的克隆与表达分析

以‘妃子笑’荔枝（Litchi chinenesis）为试材,通过PCR方法克隆了荔枝类甜蛋白基因LcTLP（登录号JF682821）的cDNA全长和完整开放阅读框（ORF）对应的gDNA序列。序列分析表明：该基因无内含子,cDNA序列含有一个672 bp的ORF,编码223个氨基酸残基序列。荧光定量PCR结果表明：LcTLP在花中表达量最高,其次是果皮,在果肉中表达量最低;在果实发育过程中,果皮中LcTLP表达量先上升后下降,采后果皮中的表达量高于采前,炭疽菌侵染诱导LcTLP的表达,失水和低温能抑制LcTLP的表达。     

红肉脐橙果肉中番茄红素和β - 胡萝卜素含量的变化及外源ABA和GA3 对其的影响

 用高效液相色谱法测定了红肉脐橙果实发育期间果肉中番茄红素和β - 胡萝卜素含量的变化,并对果实转色期用不同浓度的外源ABA和GA3 处理后主要色素的含量进行了测定。结果表明: 果肉中番茄红素和β - 胡萝卜素的含量在果实成熟期( 12月21日) 达到最大值(分别为26.79和9.21 μg·g^{- 1}FM) , 分别在果实膨大期和果实成熟期迅速积累, β - 胡萝卜素的合成较番茄红素滞后; 外源ABA处理促进番茄红素的积累, 但不一定促进β - 胡萝卜素的积累; 较高浓度的GA₃ 在一定程度上抑制番茄红素和β - 胡萝卜素的积累, 但低浓度的GA₃ (如50 mg·L ^{- 1} ) , 则能明显促进果肉中番茄红素的积累。     

两种不同肉色枇杷果实类胡萝卜素积累及合成#br# 相关基因的表达

 以‘早钟6 号’（黄肉）和‘白玉’（白肉）两类枇杷为材料,测定不同发育阶段果实果皮 和果肉中类胡萝卜素含量,并对15 个生物合成相关基因的表达进行了分析。随着果实发育成熟,β–胡 萝卜素含量在黄肉‘早钟6 号’果皮和果肉中增加,到成熟期达到最高值,分别为68.53 和11.92 μg ? g-1 FW; 在白肉的‘白玉’果皮中也呈增加趋势,到成熟期最高,为38.89 μg ? g-1 FW,但果肉中略有下降,从最 初的0.47 μg ? g-1 FW 降低至0.29 μg ? g-1 FW。两个品种果皮和果肉的β–隐黄质含量表现为持续增加,均 在成熟期达到最高值。叶黄质含量在‘早钟6 号’果皮中表现为下降,在果肉中则持续上升;在‘白玉’ 果皮中表现为先降后升,在果肉中变化不大,维持较低水平。‘早钟6 号’进入转色期后,与‘白玉’相 比,在果皮中的PSY 和CYCB 表达量较高,而在果肉中CYCB 和BCH 的表达量较高,提示枇杷不同发育 阶段类胡萝卜素的积累主要受PSY、CYCB、BCH 基因的共同调控。     

番茄果实特异性LYC-B 干扰载体的构建及在不同颜色果实中的表达特异性验证

为了研究番茄LYC-B 干扰对类胡萝卜素合成主要酶和主要代谢产物的影响，构建了果实特异性的番茄红素β- 环
化酶LYC-B 干扰载体，并验证了其在不同颜色番茄果实中的有效性。依据X13437.1 扩增番茄果实特异启动子E8，构建了果
实特异性载体E8-pBI121，其在粉色、红色、绿色和紫色的番茄果实中均能表达。依据X86452.1 扩增番茄LYC-B 从61～861
bp 间长度为801 bp 的片段LYC-B1 和从 480～781 bp 间长度为302 bp 的片段 LYC-B2，构建了以CaMV 35S 为启动子的LYC-B
干扰表达载体pBI121-B1B2，以E8 替换CaMV 35S，构建了果实特异性干扰载体E8-pBI121-B1B2。采用农杆菌注射法分别
侵染番茄叶片和果实，GUS 染色显示，pBI121-B1B2 在叶片、果实和种子中均表达，E8-pBI121-B1B2 只在果实和种子中表达。     

Expression of lycopene cyclase genes and their regulation on downstream carotenoids during fruit maturation of Guoqing No. 1 Satsuma mandarin and Cara Cara navel orange

Lycopene β-cyclase (LCYb) and lycopene ?-cyclase (LCYe) are believed to be crucial genes to lycopene cyclization and downstream carotenoid accumulation. To illuminate the gene expression profiles and their regulation on downstream carotenoids, expression profiles of these two genes and contents of several corresponding carotenoids were determined by real-time PCR and HPLC, respectively, in relative shorter intervals during breaker and maturation stage of Guoqing No. 1 satsuma mandarin (Citrus unshiu Marcow) and Cara Cara navel orange (Citrus sinensis Osbeck). Data showed that the expression profiles of these two cyclase genes and their relative expression levels between the peels and the pulps at the same stage all varied with cultivars. But in general, accumulation of lutein and β-carotene experienced a similar tendency in both cultivars and were up-regulated by expression of LCYb and LCYe in spite of poor correlation in the pulps. Meanwhile, lycopene abundance was negatively correlated with the expression of LCYe as expected, but hardly correlated with LCYb in the pulps of Cara Cara navel orange, indicating that LCYe might exert a more prominent influence on lycopene cyclization and downstream carotenoids formation. Results of carotenoids accumulation suggest that the biosynthetic process of carotenoids would shift from upstream β, ?- or β, β-carotenoids such as lutein and β-carotene to downstream β, β-carotenoids during fruit development.     

宫内伊予柑果实发育期间色泽和色素的变化

 以宫内伊予柑为试材, 对果实发育期间色泽、色素种类及含量, 尤其是类胡萝卜素组分进行了研究。结果表明, 幼果中高含量的叶绿素使果实呈现青绿色, 采前8周起类胡萝卜素开始积累, 采前4周起随叶绿素含量下降黄色得以显现。果实类胡萝卜素主要存在于果皮中, 成熟果实果皮类胡萝卜素含量达囊瓣的16.62倍, 总量占整果的83.62%。用高效液相色谱—二极管阵列检测(HPLC - PDAD) 技术,对采前12周至采收期的果皮类胡萝卜素组成进行了分析, 共分离出类胡萝卜素组分23种, 其中7种得到鉴定。在采收期果皮中, 已鉴定的类胡萝卜素中以β - 隐黄质和玉米黄素较丰富, 占总类胡萝卜素的8.00%和6.78%; β - 胡萝卜素不足总类胡萝卜素的1% , 没有检测出α - 胡萝卜素和番茄红素。果实成熟过程中β - 隐黄质及玉米黄素含量上升, 并伴随α - 胡萝卜素、叶黄质和β - 胡萝卜素含量下降, 暗示类胡萝卜素的β主链合成能力和β环羟化活性急剧增强, 与此同时, 阿朴类胡萝卜素的出现则表明类胡萝卜素的裂解能力随果实成熟而上升。     

胡萝卜中类胡萝卜素积累与主要合成基因转录水平相关性分析

以胡萝卜白色野生资源‘松滋野生’和欧洲橘色栽培品种‘Amsterdam’及其回交重组自交系（BILs）中的5个不同根色株系为试材,研究其根和叶中α–胡萝卜素、β–胡萝卜素合成途径分支点上LCYE、LCYB1、CHXE、CHXB1基因转录表达与类胡萝卜素含量之间的关系。cDNA测序结果表明,松滋野生和Amsterdam之间存在多个SNP变异位点。类胡萝卜素测定发现,Amsterdam叶中α–胡萝卜素含量（87.3 μg ? g-1）显著高于松滋野生（2.8 μg ? g-1）,而其β–胡萝卜素含量（122.7 μg ? g-1）显著低于松滋野生（237.9 μg ? g-1）。qRT-PCR结果显示,LCYE、LCYB1、CHXE和CHXB1在不同材料的根和叶中均表达,其中LCYE与根中α–胡萝卜素、β–胡萝卜素及总类胡萝卜素含量之间呈显著正相关;与叶中叶黄素和总类胡萝卜素含量之间呈显著负相关,说明LCYE对类胡萝卜素积累起着关键性作用。     

不同倍性西瓜内源激素与番茄红素积累的相关性研究

以同基因型不同倍性（2x、3x、4x）的西瓜品种‘蜜枚’为材料,采用分光光度计法和酶联免疫法对西瓜果实发育过程中果肉番茄红素含量以及IAA、ABA、GA、ZR、BR等5种激素含量进行测定,以探究番茄红素积累与这5种激素之间的关系。结果显示：不同倍性的西瓜果实在授粉后25 ~ 30 d时都达到成熟果实的大小。不同倍性西瓜果实番茄红素含量在授粉后25 d时开始迅速增加,并且一直表现为三倍体 > 四倍体 > 二倍体;整个果实发育期,IAA的含量表现为多倍体大于二倍体,在授粉后15 d和25 d时,三倍体西瓜果实中IAA的含量远高于其它倍性;ABA的含量没有明显的规律,不同发育时期各个倍性中ABA的含量差异各不相同;不同倍性西瓜果实中GA的含量整体上表现为逐渐降低的趋势,均为发育前期最大;不同倍性西瓜果实中ZR的含量差异不明显,在授粉后25 d时有一个较小的峰值;不同倍性西瓜果实中BR的含量相对较少,整个发育时期都维持在5 ~ 15 ng ? g-1FW。不同倍性西瓜果实中番茄红素和GA的积累均呈负相关,其它激素和番茄红素的积累均无相关性。