黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶多克隆抗体的制备

利用纯化的黄海黄杆菌海洋低温碱性蛋白酶（Marine Low-temperature Alkaline Protease,MLAP),采用背皮内多点注射和皮下组织注射免疫相结合的方法对新西兰白兔进行免疫,制备了多克隆抗体,并对多克隆抗体进行了纯化。用ELISA的方法对其效价检测表明,其效价为128000。作者所做的Western印迹实验证明了抗原抗体的结合具有高度的特异性。     

三疣梭子蟹多克隆抗体与4种经济蟹类血细胞交叉反应的研究

采用激光共聚焦扫描显微镜技术、免疫印迹技术和流式细胞术3种方法对鼠抗三疣梭子蟹血细胞多克隆抗体与黄道蟹、日本蟳、中华绒螯蟹、勘察加帝王蟹血细胞的免疫交叉反应进行分析。激光共聚焦扫描显微镜结果表明,该抗体与黄道蟹、日本蟳、勘察加帝王蟹、中华绒螯蟹血细胞均发生了免疫交叉反应,且发生反应的抗原决定簇均位于细胞膜上;流式细胞术测定该抗体与黄道蟹颗粒血细胞和透明血细胞交叉反应阳性率最高,分别为99.45%、98%,与中华绒螯蟹颗粒血细胞和透明血细胞交叉反应阳性率最低,阳性率分别为81.34%、78.56%;免疫印迹结果显示该抗体与日本蟳血细胞结合的蛋白分子量是80、38.5ku;与勘察加帝王蟹血细胞结合的蛋白分子量是80、93ku;与中华绒螯蟹血细胞结合的蛋白分子量是82、41、30ku;与黄道蟹血细胞结合的蛋白分子量是70、43ku。     

鲤细胞因子多克隆抗体的制备及检测

为从蛋白质水平研究细胞因子在鲤体内免疫应答过程中的合成变化,本研究采用PCR技术克隆TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β基因含有部分抗原决定簇的片段,引入双酶切位点Bam HⅠ和HindⅢ后连接至p ET-32a/21a,构建相应的表达载体,制备多克隆抗体。采用ELISA检测抗体效价,并以此作为实验工具,检测经嗜水气单胞菌感染后鲤血清中炎性细胞因子的合成变化。结果显示,基因TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β融合蛋白分子量分别约为31.8、31.7、35.3、32.5、18.0和33.6 ku;抗体效价达到2.4×106;在病原菌感染后的不同阶段,促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和抗炎细胞因子IL-10、TGF-β呈现出不同的合成变化。研究表明,制备的抗体具有较高的效价、亲和力和特异性,可用于鲤细胞因子的定量研究,该抗体的获得为鲤免疫应答与细胞因子合成的系统研究奠定了基础。同时,获取的鲤细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β的抗体亦可用于其他鱼类细胞因子蛋白质水平的定量研究。     

鲤irisin多克隆抗体的制备及应用

为进一步研究鱼类糖代谢与鸢尾素(irisin)之间的关系,亟需制备irisin抗体并检测其应用可靠性。本实验通过构建Rosetta-irisin表达载体,经蛋白纯化、透析、超滤后免疫小鼠,获得相应多克隆抗体并检测其特异性和抗体效价。建立irisin检测方法,检测口服葡萄糖耐量(OGTT)、RNAi实验后鲤血清irisinA和irisinB的含量变化。免疫荧光检测鲤脑、肠道、心脏、肝胰脏irisin的表达及OGTT后,检测上述组织irisin含量变化。检测鲤肌细胞分化前后FNDC5 mRNA表达差异及irisin含量变化。结果显示,Rosetta-irisin表达载体在IPTG诱导4 h对鲤irisinA/B蛋白表达较BL21-irisin表达载体提高2.3/1.6倍;irisinA和irisinB抗体效价分别为9.0×10⁴和2.7×10⁵,不存在交叉反应,可分别对鲤血清irisinA和irisinB进行测定;OGTT后,irisinA和irisinB呈现出不同的合成变化;RNAi后,irisin含量显著降低;免疫荧光结果显示,irisin在脑中表达最高,肝胰脏次之,心脏、肠道中相对较少;OGTT后,脑、肠道、心脏和肝胰脏中irisinA和irisinB荧光强度显著增加。荧光定量表达分析与免疫荧光结果显示,鲤肌细胞分化后,FNDC5和irisin含量显著降低。综上,本实验制备了高亲和力和特异性的鲤irisinA和irisinB抗体,并检测其应用可靠性。该抗体的获得为系统研究irisin对鲤糖代谢的调控机制奠定基础。同时,鲤irisin检测方法可普遍用于其他鱼类irisin蛋白质水平的定量研究。     

中华鳖StAR基因的克隆、表达及多克隆抗体制备

为探索StAR基因在中华鳖性腺发育过程中的作用,利用RACE技术克隆获得中华鳖StAR基因全长cDNA,qRT-PCR分析其在不同组织及胚胎不同发育时期的表达情况,并制备多克隆抗体,采用Western blot检测StAR在不同组织中的表达情况,通过免疫组化进行定位,同时检测来曲唑处理雄性中华鳖后StAR在精巢中的表达情况。结果显示,该基因全长2 377 bp,开放阅读框903 bp,编码300个氨基酸。氨基酸序列比对及系统进化分析表明,中华鳖StAR与龟类亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,StAR基因在精巢中表达量最高,显著高于其他组织;StAR基因于中华鳖胚胎发育16期已有表达,早于性腺分化启动时期;来曲唑处理的中华鳖精巢中,StAR表达量先上调后回降。本研究利用原核表达系统构建中华鳖StAR基因原核重组表达载体,经蛋白纯化后免疫小鼠,获得中华鳖StAR多克隆抗体。Western blot检测结果显示StAR在不同组织中的表达量与荧光定量结果一致。免疫组化结果显示,StAR蛋白在卵巢间质细胞、精巢间质细胞,精原细胞及胞质中表达。综上所述,StAR基因可能是中华鳖性腺分化关键...     

黄鳝血清转铁蛋白多克隆抗体的制备及检测

为实现黄鳝血清转铁蛋白基因的原核表达并制备其多克隆抗体,利用基因特异性引物从黄鳝肝脏cDNA中扩增黄鳝转铁蛋白的C端序列,亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建pET/Tf-C重组表达载体;转化大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导。利用Ni离子亲和层析技术纯化Tf-C蛋白,并免疫新西兰兔制备多克隆抗体;通过间接ELISA技术和组织蛋白印迹对制备的多克隆抗体进行检测。试验结果表明,成功构建pET/Tf-C原核表达载体,并实现了蛋白的表达和纯化;制备的多克隆抗体效价大于1∶25 600,并能特异性地识别来源于黄鳝不同组织的血清转铁蛋白。研究结果对黄鳝血清转铁蛋白功能的研究奠定了基础。     

亚甲基蓝多克隆抗体的制备与鉴定

为建立检测水产品中亚甲基蓝及其代谢物残留的酶联免疫吸附检测方法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),以亚甲基蓝代谢物天青C(azure C)为亚甲基蓝的半抗原,采用戊二醛法,将azure C上的氨基与蛋白上的羧基进行偶联,制备免疫原azure C-BSA和包被原azure ...     

虹鳟IL-17多克隆抗体的制备及初步鉴定

本研究根据NCBI已发表序列设计引物,提取经植物血凝素刺激后的虹鳟Oncorhynchus mykiss头肾细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增IL-17成熟肽基因,测序结果表明所获得的序列与发表序列相一致。将该基因重组至原核表达载体pET32a中,并转化大肠杆菌Escherichia coli Rosetta,进行诱导表达。SDS-PAGE电泳结果表明:目的蛋白以包涵体形式表达,大小约为32k Da,重组蛋白经Ni-NTA系统纯化、复性后纯度达90%以上,以其免疫小鼠制备虹鳟IL-17多克隆抗体。ELISA结果显示其效价为1∶25 600,而间接免疫荧光结果显示所制备的多克隆抗体能够特异性地识别真核细胞中瞬时表达的虹鳟IL-17。本研究成功制备虹鳟IL-17多克隆抗体,为下一步IL-17在虹鳟黏膜免疫中的作用及其佐剂效应研究奠定基础。     

草鱼干扰素3蛋白多克隆抗体制备及其应用

为探讨干扰素3(Interferon 3,IFN3)在抗病毒免疫应答中的作用,以草鱼(Ctenopharyngodon idella)巨噬细胞cDNA为模板,PCR扩增IFN3成熟肽基因序列,制备草鱼IFN3蛋白的多克隆抗体,同时研究了IFN3在草鱼不同免疫组织中的蛋白表达,以及草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)感染草鱼肾细胞系(Ctenopharyngodon idella kidney,CIK)后不同时间点的表达。结果显示,细菌表达的重组IFN3大小约为45 kD,主要以包涵体形式存在;抗体效价约为1∶3 200,制备的多克隆抗体既能识别原核表达的重组蛋白,也能识别个体水平上和细胞水平上的内源蛋白。草鱼主要免疫组织中,肝胰腺和皮肤检测到相应条带。CIK细胞感染病毒后12 h开始检测到IFN3蛋白,随感染时间的延长,IFN3蛋白表达量有所增加。蛋白水平上检测IFN3的表达,为深入研究草鱼的抗病毒免疫机制奠定了基础。     

一株大黄鱼虹彩病毒的分离鉴定及多克隆抗体的制备

2021年7月,浙江省象山某养殖场养殖的大黄鱼（Larimichthys crocea）出现类似大黄鱼虹彩病毒引起的疾病。采用鲤上皮瘤细胞培养和病毒主要衣壳蛋白测序分析的方法,从患病的大黄鱼中分离到一株病毒。该病毒接种到鲤上皮瘤细胞（EPC）后出现空斑、脱落的细胞病变症状。根据虹彩病毒MCP和ATPase基因保守序列设计特异性引物对病毒组织样本进行PCR扩增,得到分别为1 367 bp和740 bp的目的基因片段。将MCP基因扩增片段测序,经BLAST对比及系统发育树聚类分析,确定该分离的病毒属虹彩病毒科细胞肿大病毒属。通过蔗糖密度梯度离心纯化,用透射电镜观察该病毒粒子呈正六边形,直径为120～150 nm。用纯化病毒作为抗原免疫小鼠获得抗大黄鱼虹彩病毒的多克隆抗体,效价为1∶7 000;通过SDS-PAGE和Western blotting初步确定3个免疫蛋白。本研究为大黄鱼虹彩病毒纯化提供一种新方法,并初步分离出免疫蛋白,为该病毒相关分子生物学研究、蛋白研究以及疫苗制备等提供理论依据。     

牙鲆秦皇岛弧菌HQ010712-1外膜蛋白及其抗原性分析

采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)和苯甲基磺酰氟(PMSF)2种方法提取秦皇岛弧菌HQ010712-1(Vibrio qinhuangdaora sp.nov.)外膜蛋白,结果显示 Sarkosyl法提取效果较好,且所提取的主要外膜蛋白分子量为102kD、45 kD、39 kD、36 kD、30 kD、28 kD、24 kD、22 kD;为比较该菌株与弧菌属其他细菌外膜蛋白组分及抗原性异同,以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻胶弧菌(Vibrio alginolyticus)为对照,电泳图谱显示4种弧菌外膜蛋白的分子量主要集中在22～48 kD之间;利用抗秦皇岛弧菌HQ010712-1血清的免疫印迹表明菌株HQ010712-1外膜蛋白中分子量为45 kD、36 kD的蛋白条带呈现阳性反应,其他3种弧菌外膜蛋白中均有与该抗血清反应的条带,且分子量为36 kD的反应带为菌株HQ010712-1、副溶血弧菌、溶藻胶弧菌共有.本研究旨在为进一步筛选和研究致病性弧菌的共同保护性抗原提供参考.     

Antibacterial abilities of intestinal bacteria from larval and juvenile Japanese flounder against fish pathogens

The present study was undertaken to examine the antibacterial abilities of intestinal bacteria isolated from juveniles and larvae of Japanese flounder Paralichthys olivaceus . Newly hatched larvae of flounder were held in a 100 L plastic circular tank and fed rotifiers, Artemia nauplii and commercial feeds, depending on the developmental stage of the fish. Genera Aeromonas , Moraxella and Vibrio were predominantly isolated from the intestinal tracts of Japanese flounder at larval and juvenile stages, whereas Aeromonas , Bacillus , coryneforms, Moraxella , Pseudomonas and Vibrio were detected at high densities in live diets and artificial feeds. Antibacterial bacteria accounted for 1.7–24.3% of the intestinal isolates against Lactococcus garvieae , Pasteurella piscicida , Vibrio anguillarum and V. vulnificus . In particular, as much as 53.3% of Vibrio spp. other than Vibrio -swarmer isolated from 197-day-old juveniles inhibited the growth of P. piscicida . These results suggest that intestinal bacteria having antibacterial activity play a role in the prevention of infectious diseases.     

方斑东风螺吻管水肿病病原菌的初步研究

从患病方斑东风螺(Babylonia areolata)分离到一株致病菌Balo001,运用生理生化方法并结合分子生物学方法对病原菌进行分类鉴定,并对病原菌进行药敏分析及半致死剂量(LD50)测定.结果表明:致病菌Balo001为哈氏弧菌(Vibrio harveyi),它对东风螺的LD50值为6.8×105 CFU/g;该菌对氟哌酸、氟苯尼考、复方新诺明等抗菌药有较高的敏感性.     

杂色鲍哈维弧茵耐药质粒的鉴定和分析

文章对引起杂色鲍（Hallotis diversicolor）肌肉萎缩症的病原菌哈维弧菌（Vibrio harveyi）质粒上的磺胺耐药基因进行研究,结果显示,该菌株对复方新诺明完全耐药,其质粒上含有sulⅡ耐药基因。接合转化试验显示该质粒具可转移性,可使受体菌对磺胺制剂复方新诺明产生耐药性,鉴定为耐药质粒,并测定了该耐药质粒的全基因组序列,序列总长为10 940 bp,初步分析显示有7个具有一定功能的ORF框。进一步构建重组表达质粒pR-SET-A-sulⅡ,表达了目的蛋白（31 kDa）。     

Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒VP4、VP35蛋白多克隆抗体制备及其免疫原性分析

为建立针对Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的血清学检测方法,分别构建了GCRV JX02株外衣壳蛋白VP4、VP35的原核重组表达质粒PGEX-4T-3-S6、PGEX-4T-3-S11,用纯化的重组蛋白r VP4、r VP35分别免疫小鼠制得相应的多克隆抗体,用间接ELISA方法测定2种抗体的效价,用Western Blot鉴定抗体的特异性。SDS-PAGE分析细菌表达的r VP4、r VP35大小分别约为98ku和61ku,且都主要以包涵体的形式存在;间接ELISA方法测定制备的抗体效价分别约为1:4×105和1:106;Western Blot结果显示,制备的2种多克隆抗体都既能够识别原核表达的重组蛋白,又能够识别JX02毒株上的对应蛋白,并且发现感染JX02的草鱼血清中存在结合VP4、VP35的相应抗体。本研究制备的2种多克隆抗体都具有良好的生物学特性,并且这2种重组蛋白作为相应抗体捕获原可以用于通过检测抗病毒抗体来确诊草鱼是否感染Ⅱ型GCRV。本研究将为GCRV主要流行株血清学检测方法的建立以及VP4、VP35蛋白相关功能研究奠定基础。     

牙鲆鱼腹水病病原菌的理化特性研究

对河北省地区危害严重的牙鲆鱼(Paralichthys olivaceus)腹水病进行详细研究,经系统鉴定,发现了该病的病原菌为致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila),并对病原菌的生长特性进行详细研究,该病原菌菌体呈短杆状、两端钝圆、单个或成对排列、菌体大小为(0.5~1.0)μm×(1.2~2.8)μm、极生单鞭毛、运动活泼、无芽孢、无荚膜、革兰氏染色阴性。该菌最适生长环境为:温度28℃,pH值7.5~8.6,盐度30‰~40‰;并提出综合防治措施。     

Identification and characterization of pathogenic bacteria isolated from dead masu salmon Oncorhynchus masou masou and antibacterial activity of probiotic Lactococcus lactis subsp. lactis strain K-C2 against isolated pathogens

We focused on developing an epidemic prevention method for circulating masu salmon aquaculture using the probiotic Lactococcus lactis strain K-C2. This study aimed to evaluate the antibacterial activities of strain K-C2 against pathogens isolated from dead Yamame and masu salmon. First, we identified pathogenic bacteria that were isolated from dead masu salmon based on phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene sequence and biological and biochemical characterization. The antibacterial activity of strain K-C2 against seven pathogenic strains isolated from dead masu salmon in this study and two strains of Aeromonas salmonicida previously isolated from dead Yamame was tested using a double agar plate method. The results of a BLAST search using 16S rRNA partial sequence data (1200–1300 bp) revealed that six of the former strains and one of the latter strains showed high similarity to Vibrio anguillarum and Tenacibaculum maritimum, respectively. Strain K-C2 showed antibacterial activity against all pathogenic bacteria. In this study, pathogenic bacteria were newly isolated from dead seawater-acclimated masu salmon, and strain K-C2 was found to have antibacterial effects against these pathogens.

     

杀鲑气单胞菌一新亚种的生物学特性及系统发育学分析

从石鲽（Kareius bicoloratus L．）细菌性败血感染症的病鱼（濒死及死亡不久）中分离到相应病原菌，进行形态特征、理化特性等较系统的表观分类学指征鉴定及代表菌株DNA中G＋Ct001％的测定。同时，选择代表菌株进行16S rRNA基因的分子鉴定，测定16S rRNA基因序列、分析相关细菌相应序列的同源性，构建系统发生树。结果表明，分离鉴定的60株菌为杀鲑气单胞菌的一个新亚种（subsp．nov．），定名为杀鲑气单胞菌杀鲽亚种（Aeromonas salmonicida subsp．flounderacia subsp．nov．）。代表菌株HQ010320-1及HQ010320-5的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的杀鲑气单胞菌的同源性在99％和100％。     

斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白抗体的制备

将含有斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）神经坏死病毒（orange-spotted grouper nervous necrosis virus，OGNNV）的主衣壳蛋白（main capsid protein，MCP）基因的重组质粒pET32a-MCP转入大肠杆菌BL21后，用异丙基硫代-β-半乳糖苷（IPTG）诱导表达，用柱层析纯化表达的融合蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔，制备抗MCP融合蛋白的血清。用ELISA方法检测抗血清的效价，用Western—blot检测抗血清的特异性。结果显示，获得的抗血清稀释1：22000倍时仍呈阳性，并能有效中和OGNNV，实验组的相对存活率达54．50％。这说明，本研究用纯化的MCP融合蛋白制备兔抗OGNNVMCP抗体是成功的，并证实了OGNNV主衣壳蛋白的免疫原性。本研究旨为重组表达主衣壳蛋白基因制备抗OGNNV疫苗提供科学依据，并为进一步研究提供重要的实验材料。