秀丽隐杆线虫fat-1基因密码子优化、克隆及家兔表达载体构建

提取秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)总RNA,采用RT-PCR法扩增出fat-1基因cDNA全长.根据家兔基因密码子使用偏好性,对引自GenBank的fat-1 cDNA序列进行密码子优化,通过全基因合成的方法获得优化后的fat-1基因(命名为opfat-1).将扩增的fat-1 cDNA和opfat-1基因分别与pGEM-T Easy和pUC57载体连接,转化大肠杆菌DH5α,获得2种重组克隆子.2种重组子经双酶切后获得的目的片段分别定向克隆入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1中,构建重组表达载体,并对其进行PCR、限制性内切酶酶切分析和测序鉴定,结果表明,成功构建了fat-1基因家兔表达载体pEGFP-opfat-1和pEGFP-fat-1,且读码框正确.     

fat-1基因脂肪组织特异性表达载体的构建及其山羊转基因细胞系的建立

旨在构建一种筛选标记可全部去除的脂肪组织特异性表达fat-1基因的载体,将其转染山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定整合fat-1基因的转基因细胞系。首先将人工合成的fat-1基因连接至L28-Wnt10b载体(1种带有小鼠脂肪组织特异性启动子Fabp4的载体)上,构建成fat-1基因脂肪组织特异性表达载体L28-fat1;同时经多次克隆构建成1种筛选标记可全部去除的骨架载体MCS-3s-LoxP-RFP;然后,利用Hind III和Not I对上述2种载体进行双酶切,接着进行连接,构建出筛选标记可全部去除的脂肪组织特异性表达fat-1基因的表达载体。采用脂质体介导的方法转染山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选转基因细胞。酶切鉴定及PCR检测结果表明,成功构建了3s-LoxP-RFP-FABP4-fat1表达载体,并首次获得了脂肪组织特异性表达fat-1基因的山羊胎儿成纤维转基因细胞系,为将来通过体细胞核移植创制脂肪组织特异表达fat-1基因的优质肉用转基因山羊新材料奠定了基础。     

人α-乳白蛋白质基因的克隆及其在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达

采用PCR方法从人类基因组DNA中扩增hα-LA基因,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,并进行测序验证。通过双酶切法将测序正确的hα-LA亚克隆至真核表达载体pCEP4,构建真核表达载体pCLA并进行酶切鉴定。用脂质体法将pCLA转染至奶山羊胎儿成纤维细胞中,用RT-PCR法检测细胞中hα-LA基因mRNA的表达,用Western-blotting法检测培养上清液中hα-LA蛋白质的表达。结果显示:克隆的hα-LA基因序列完全正确,pCLA酶切鉴定正确,RT-PCR检测到转染细胞中hα-LA基因mRNA的表达,Western-blotting检测到转染细胞培养上清液中hα-LA蛋白质。表明所克隆的hα-LA基因组DNA能够在奶山羊胎儿成纤维细胞中正确转录和翻译。     

利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白转基因猪胚胎的研究

试验对脂质体转染猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选,以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体,以体外成熟卵母细胞为核受体构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎,并对重构胚在体外发育情况以及绿色荧光蛋白表达情况进行了跟踪研究。结果显示,采用4.0μg.mL-1脂质体转染试剂,1.6μg.mL-1质粒DNA,转染6 h可以获得最佳转染效果,转染效率达4.48%;GFP转基因体细胞重构胚体外囊胚发育率为10%,GFP阳性胚胎率为48%。结果表明,脂质体转染试剂可以高效转染猪胎儿成纤维细胞,获得的阳性细胞具有支持猪全程发育的潜能。     

猪胎儿成纤维细胞的分离与基因转染

为利用核移植法获取转基因克隆猪提供供体细胞,体外分离培养猪胎儿成纤维细胞并进行了绿色荧光蛋白基因转染。首先采用组织块贴壁法分离培养猪胎儿成纤维细胞,绿色荧光蛋白表达载体以脂质法介导转染猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,利用荧光显微镜检测荧光蛋白的表达。结果表明,组织块贴壁后9 d可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9 d即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR检测显示荧光蛋白基因整合到细胞基因组中,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,为下一步通过核移植方法获得转基因猪提供了基础。     

山羊α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的构建 及核供体细胞的转染

为了构建α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体及提供山羊乳腺生物反应器α-乳清蛋白核移植供体细胞,提取乳腺组织中的总RNA,采用RT-PCR技术获得α-乳清蛋白基因cDNA,测序酶切后连接乳腺特异性表达载体pBCⅠ-Neo,并对重组载体进行酶切测序鉴定;取重组正确的载体酶切线性化后利用脂质体介导转染至山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选培养转染了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞。结果显示:经过RT-PCR特异性扩增克隆出α-乳清蛋白基因;克隆的基因碱基组成序列经测序与预期完全一致,α-乳清蛋白基因片段正向插入乳腺特异性表达载体;重组载体在山羊胎儿成纤维细胞中稳定转染,转入α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞生长迅速,仍保持原有的细胞生长形态。成功构建了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体,获得稳定转染的山羊胎儿成纤维细胞可用于核移植。     

内蒙古白绒山羊VEGF164基因毛囊特异性表达载体的构建及胎儿成纤维细胞的稳定转染

 【目的】构建绒山羊血管内皮生长因子164（vascular endothelial growth factor 164,VEGF164）基因的毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞,筛选获得稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】以pCDsRed2载体为基本骨架将VEGF164基因亚克隆到KAP6-1启动子下游,接续连接红色荧光蛋白表达元件,构建VEGF164基因毛囊特异表达载体pCDsRed2-KV（6.3 kb）。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】在构建的表达载体pCDsRed2-KV中,VEGF164基因被正确连接在毛囊特异性启动子KAP6-1下游,基因下游按顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因;外源KAP6-1启动子和VEGF164基因整合到细胞基因组中。【结论】成功构建稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164的真核表达载体,稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过克隆技术获得转VEGF164基因绒山羊提供了条件。     

捻转血矛线虫肌动蛋白基因的克隆与表达及其DNA疫苗的构建

根据秀丽新杆线虫等其他几种线虫的肌动蛋白(Actin)开放阅读框(ORF)设计简并引物,以捻转血矛线虫总RNA为模板,合成cDNA,用RT-PCR方法扩增出约为1 100 bp的DNA片段。将该片段克隆到T载体后进行序列测定和分析,结果表明该基因的ORF为1 131 bp,与秀丽新杆线虫、新杆状线虫、肿孔古柏线虫等的同源性高达86%以上,推导出其蛋白质序列含有376个氨基酸,与胎生网尾线虫、秀丽新杆线虫、新杆状线虫、马来丝虫等的肌动蛋白相似性均为98%以上,说明成功克隆了捻转血矛线虫actin基因。将捻转血矛线虫肌动蛋白基因的ORF克隆到pET-28a(+)中,构建了原核表达载体,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析发现,该基因获得了表达,且以包涵体的形式存在,融合蛋白相对分子质量约46×103。以此重组蛋白为抗原,用自然感染捻转血矛线虫山羊血清为第一抗体进行Western blot分析,结果出现1条特异性条带,表明捻转血矛线虫Actin蛋白在自然感染过程中能被宿主的免疫系统识别,可能是一种天然抗原。用纯化重组Actin蛋白免疫小鼠,制备抗血清,以该血清为第一抗体进行Western blot,结果发现该血清能识别捻转血矛线虫成虫蛋白谱中相对分子质量约为42×103的蛋白条带。将捻转血矛线虫actin基因亚克隆到真核表达载体pVAX1中,构建了DNA疫苗pVAX1-ACT,动物免疫试验结果表明该DNA疫苗在机体内获得了表达。     

秀丽隐杆线虫培养特性与保存方法研究

秀丽隐杆线虫作为一种模式线虫,已广泛应用于寄生性线虫基因功能的研究以及寄生性线虫疫苗候选抗原基因的表达。通过对秀丽隐杆线虫形态、培养条件以及保存方面的研究,发现秀丽隐杆线虫在16℃NGM培养基中生长良好,将其放入30%甘油溶液中,在-80℃冰箱中可以保存较长的时间。