猪肺炎支原体P97R1基因在毕赤酵母中的分泌表达及初步应用(英文)

[目的]研究猪肺炎支原体P97R1基因在毕赤酵母中的分泌表达及初步应用。[方法]根据Genbank中猪肺炎支原体P97R1基因序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增出猪肺炎支原体特异性蛋白P97R1基因,克隆入酵母表达载体pPICZα-A,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-P97R1;PICZα-A-P97R1经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株GS115;将PCR鉴定为阳性的酵母转化子经甲醇诱导分泌P97R1蛋白于发酵上清液中,并通过SDS-PAGE电泳以及Western-blotting对其进行鉴定。[结果]P97R1蛋白基因获得了分泌性表达,表达量达499μg/ml,而且具有良好的反应原性;同时用表达蛋白经过各项优化建立了猪肺炎支原体间接ELISA检测方法,经检测该方法具有良好的特异性和重复性。[结论]该研究为猪肺炎支原体免疫检测试剂盒和基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

猪α干扰素在毕赤酵母中的分泌表达

利用PCR技术从长白猪全血基因组DNA中扩增出猪α干扰素的成熟肽(mPoIFN-α)基因,并将其亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母(Pichia pastoris)-大肠杆菌(Escherichia coli)穿梭质粒pPIC9K载体中,构建分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFN-α。将SalⅠ线性化的pPIC9K-mPoIFN-α电转化毕赤酵母GS115株(组氨酸缺陷型),使重组表达载体与酵母染色体发生同源重组。转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后,得到的阳性菌株再以G418抗性梯度法筛选多拷贝重组子。该多拷贝菌株经1%甲醇诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,结果表明,猪α干扰素在毕赤酵母中成功地获得了分泌表达,并具有免疫活性,表达产物约为19kD,这为进一步研究猪α干扰素的功能奠定了基础。     

带有组氨酸标签的蛇毒基因在毕赤酵母中的表达

[目的]通过巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达带有组氨酸标签的蛇毒基因。[方法]利用基因重组技术,以海蛇基因为材料,通过PCR技术在N末端添加一个六聚组氨酸纯化标签,并将重组质粒导入菌株GS115,用1%甲醇诱导后,分泌表达了重组蛋白。[结果]测序结果显示该标签已成功插入,SDS-PAGE检测到分子量为28.5 kD的目的蛋白。[结论]成功表达了带有组氨酸标签的蛇毒蛋白,其具有良好的降纤活性。     

猪α干扰素在毕赤酵母中的高效表达和纯化

为了研制新型的猪用抗病毒制剂,开展了猪α干扰素（PoIFNα）在毕赤酵母中的表达和产物纯化研究。将PCR扩增的PoIFNα基因插入pPIC9k的SnaBⅠ和EcoRⅠ位点,构建了表达转移载体pPIC9k/PoIFNα;经酶切和测序鉴定,转移载体构建正确。pPIC9k/PoIFNα以限制性内切酶SalⅠ线性化后电转化毕赤酵母GS115菌株,经抗性筛选获得4拷贝PoIFNα基因的重组菌株GS115/PoIFNα;重组菌株经BMMY培养基诱导后上清中有目的蛋白,表达量达136 mg/L。表达产物经过SP-Sepharose 阳离子交换层析,可以得到纯度较高的rPoIFNα,纯化产物在MDBK细胞上抑制VSV的活性高达2.27×108 U/mg。     

猪表皮生长因子在毕赤酵母中的表达及鉴定

 【目的】猪表皮生长因子（pEGF）具有刺激静止期猪卵母细胞的成熟以及刺激仔猪胃肠上皮细胞成熟的功能，从而可以提高母猪繁殖率和降低断奶仔猪的应激。因此开发猪表皮生长因子具有重要意义。【方法】用人工合成的pEGF 基因为模板，用PCR扩增获得pEGF-6His片段，将其克隆到载体pPIC9构建重组质粒pPIC9-pEGF并电转化毕赤酵母。用斑点杂交法筛选多拷贝整合转化子即基因工程菌，用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白，纯化产物用抗His-tag 的单克隆抗体进行蛋白质免疫印迹、氨基端测序鉴定、体外生物活性检测。【结果】斑点杂交法筛选中信号越强的转化子，甲醇诱导表达的目的蛋白含量越高。免疫印迹中可以观察到印迹条带。氨基端氨基酸测序发现纯化的表达产物含有2条肽链，其N-端15个氨基酸的序列分别与天然的pEGF以及Glu-Ala -pEGF的序列相同。体外生物活性检测结果表明，纯化的表达产物对BALB/c 3T3细胞具有显著的增殖作用。【结论】本研究获得了能高效表达具有生物学活性的重组猪表皮生长因子的基因工程菌。     

猪IFN-α在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

为了获得高效抗病毒活性的猪α-干扰素蛋白,采用PCR法扩增获得猪α-干扰素基因完整的开放阅读框(ORF),构建重组表达质粒pPICZαC-IFN,电击转化毕赤酵母感受态细胞X33.挑阳性菌落诱导表达,离心取上清,SDS-PAGE和Western-blotting分析,可见1条相对分子质量约19 400的清晰蛋白条带,与理论值相符,表明表达产物为猪α-干扰素.在Vero细胞上检测该干扰素抗VSV的活性为4.04×106IU/L.     

猪肺炎支原体P97基因抗原决定簇R1区的克隆与表达

通过引物定点突变PCR法,扩增了猪肺炎支原体(Mhp)168株黏附因子P97基因抗原决定簇R1区基因片段,并将该基因片段插入表达载体pET-32 a( )中构建重组质粒,再将该重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)。DNA序列分析结果表明所构建的重组质粒含有正确的目的基因。经0.1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)37℃诱导4 h,重组质粒表达的目的蛋白量可达到总蛋白的23%。W estern b lotting和ELISA试验结果证明所表达的重组蛋白具有猪肺炎支原体抗原性。     

牦牛IFN-β基因在毕赤酵母中的分泌表达

用真核表达引物从pGEM-yakIFN-β重组质粒中扩增出牦牛IFN-β基因,将目的基因和真核表达载体pPIC9K连接转入E.coli的JM109中,得到pPIC9K-yakIFN-β重组表达质粒.通过电击法将经SalⅠ线性化的pPIC9K-yakIFN-β质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中,采用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,利用甲醇诱导表达,分泌表达产物用MTT法检测其生物学活性.经SDS-PAGE电泳分析表明:表达出约22ku大小分泌于胞外的牦牛IFN-β蛋白分子量,比理论值稍大;MTT结果表明:纯化的重组yak-IFN-β蛋白具有促进淋巴细胞增殖的活性.     

猪肺炎支原体P36蛋白间接ELISA检测方法的建立

将已构建的含有猪肺炎支原体P36基因的酵母表达质粒pPICZα-A-P36在酵母菌X-33里进行表达,并对表达的蛋白进行Western-blotting鉴定。将其作为包被抗原包被酶标板,用羊抗猪IgG-HRP作为酶标二抗,并分别对抗原浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度以及作用时间等进行了优化,最终建立了稳定的抗猪肺炎支原体IgG的间接ELISA检测方法。应用该方法检测猪鼻支原体、猪絮状支原体、猪圆环病毒阳性血清等都是阴性,说明该方法具有良好的特异性。批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数均小于8%,说明该方法具有良好的重复性。利用该方法检测猪肺炎支原体活疫苗(168株)免疫猪血清中IgG的动态变化,结果表明,免疫猪血清中的IgG在免疫后分泌逐渐增加,直至免疫后8周,而经强毒攻毒后抗体滴度明显增高。     

猪肺炎支原体168弱毒株P46基因的克隆和鉴定

猪肺炎支原体的表面抗原基因Ｐ４６基因可引起宿主早期特异性免疫反应,其分子量约４６ｋＤａ,根据ＧｅｎＢａｎｋ公布的Ｐ４６序列设计１对能扩增１３７７ｂｐＰ４６结构基因的引物作ＰＣＲ,成功地从猪肺炎支原体１６８弱毒株染色体ＤＮＳＡ中扩增出目的基因。ＰＣＲ产物克隆于ｐＵＣ１９质粒中,部分测序表明克隆基因与Ｊ株基因因同源性达９６％。     

黑曲霉GAⅠ基因的克隆及在P.pastoris中的分泌表达

采用RT-PCR技术,从黑曲霉的菌丝体RNA中扩增出葡萄糖淀粉酶GAI的结构基因,将其连接到pPICZαA载体中,转入巴斯德毕赤酵母GS115中,获得8株重组酵母;甲醇诱导目的蛋白分泌表达,葡萄糖淀粉酶酶活最高达174 U/mL,占上清液蛋白的36%.     

猪肺炎支原体P46基因的克隆及表达

参考GenBank登录的猪肺炎支原体(Mhp)P46基因序列,利用Primer 5.0软件设计合成引物,通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)对猪肺炎支原体P46基因的3个位点进行定点突变,将此突变基因插入到表达载体pET-32a( )中,经IPTG诱导后成功地在大肠杆菌Rosetta(DE3)宿主菌中表达分子量约为63 500的融合蛋白.Western blotting分析表明,该融合蛋白具有较好的免疫原性.为猪肺炎支原体抗体ELISA检测方法的建立奠定了基础.     

猪视黄醇结合蛋白在毕赤酵母中的表达及检测

采用RT-PCR技术从猪的肝脏中扩增到RBP基因,将其与巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαC重组构建了重组表达载体pPICZαC-RBP,测序正确后将其用SacⅠ内切酶线性化后采用电穿孔法转化巴斯德毕赤酵母菌GS115,经ZeocinTM抗性筛选高拷贝重组菌株后用甲醇诱导表达,Western Blot分析结果表明,诱导表达的培养上清液中表达出具有生物活性的RBP重组蛋白。     

环糊精酶基因在毕赤酵母中的组成型表达

为实现环糊精酶在毕赤酵母中的高效表达,以优化合成的环糊精酶基CGT2为基础,构建组成型表达质粒pGAPZαA-CGT2,运用电转化方法将目的基因整合进酵母染色体,构建环糊精酶酵母工程菌X33/pGAPZαA-CGT2,经摇瓶发酵120h后,CGT2活力达0.21 U·mL~(-1);进一步对工程菌进行摇瓶发酵条件优化,确定其最优发酵条件为:pH6.5、28℃、200r·min~(-1)、每24h补加2.5%的甘油,120h后其胞外酶活力达到0.36U·mL~(-1),是优化前的1.7倍,实现了环糊精酶在毕赤酵母中的组成型表达。     

Lactobacillus reuteri PYR8亚油酸异构酶基因在毕赤酵母中的表达

以Lactobacillus reuteri PYR8菌株基因组DNA为模板,利用PCR方法扩增出亚油酸异构酶(linoleate isomerase,LI)基因,将其克隆至酵母表达载体pPIC9K中,电转化至毕赤酵母GS115中.重组菌株GS115/pPIC9K-LI经1%甲醇诱导后,SDS-PAGE电泳表明该基因在酵母中得到表达,即分子量约为67 kD的重组LI蛋白.经SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析、Phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析纯化获得了纯度为95%的重组LI蛋白样品.气相色谱分析表明,纯化的重组LI具有亚油酸异构酶的活性,酶的比活力为6.8 U·mg-1.     

人源明胶基因在毕赤酵母中的表达

[目的]利用毕赤酵母重组获得明胶蛋白。[方法]构建基因工程菌,利用甲醇诱导表达。[结果]LC-MS/MS检测到了明胶蛋白。[结论]微生物重组表达特定分子量大小的明胶是可行的。     

S-腺苷甲硫氨酸合成酶在毕赤酵母中的分泌表达

S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）是甲硫氨酸（Met）的活性形式。生物体内,SAM由S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）[EC2．5．1．6]催化L．甲硫氨酸（L．Met）和A11）反应而合成。酿酒酵母细胞中有2种SAM合成酶的同工酶,即SAMS1和SAMS2,分别由基因saml和sam2编码,二者氨基酸序列的同源性高达92％。在过量L-Met存在下,saml的转录受到抑制;已有酶促法合成研究显示sam2编码的合成酶没有产物抑制现象。笔者将sam2基因连接于毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,并通过同源重组整合到酵母染色体上,以实现SAM合成酶的分泌性表达,为开发和建立酶促法生产SAM工艺奠定基础。