牛体外受精卵与牛胎儿睾丸支持细胞体外共培养研究

【目的】研究牛胎儿睾丸支持细胞对牛早期胚胎的体外发育是否有促进作用。【方法】从屠宰场采集5~7月龄胎牛睾丸,经原代和传代培养制备牛胎儿睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)饲养层,对比原代和传代胎牛睾丸SCs与牛体外受精卵共培养时受精卵的发育情况;分别以4×104,2×104mL-1两个密度接种传代胎牛睾丸SCs与牛受精卵体外共培养,并以培养液中无牛胎儿睾丸SCs饲养层为对照,研究体外牛胎儿睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)对牛受精卵体外发育的影响。【结果】与牛受精卵体外共培养时,接种密度为2×104mL-1传代胎牛睾丸SCs饲养层共培养组的卵裂率(79.3%)高于原代牛胎儿睾丸SCs饲养层共培养组(69.2%),但差异不显著(P>0.05);囊胚发育率(41.3%)极显著地高于原代SCs饲养层共培养组(16.7%)(P<0.01)。接种密度为4×104mL-1传代牛胎儿睾丸SCs饲养层共培养组的卵裂率大于接种密度为2×104mL-1传代牛胎儿睾丸SCs饲养层共培养组和对照组,但差异不显著;胚胎发育率极显著地低于接种密度为2×104mL-1传代牛胎儿睾丸SCs饲养层共培养组和对照组。【结论】制备的传代牛胎儿睾丸SCs饲养层,能有效促进牛体外受精卵的体外发育,提高囊胚发育率;接种的传代牛胎儿睾丸SCs饲养层密度过大,将严重影响牛体外受精卵的发育。     

牛卵母细胞体外培养成熟前后及体外受精卵SDH的电镜细胞化学研究

本文用Kerple-Fronius和Hajos的电镜细胞化学方法,对牛卵巢2-5mm卵泡中的卵母细胞及体外培养成熟卵和体外受精卵,进行了琥珀酸酶(SDH)定位及活性变化的研究.观察结果培养前的卵母细胞酶活性较明显,主要定位于线粒体膜上,内脊上也有少量的定位.体外培养成熟卵线粒体上的酶活性明显减弱.而体外受精卵在线粒体的膜及内脊上都有很强的酶活性定位.结果表明,牛卵母细胞的SDH活性随卵母细胞的成熟过程减弱,随受精过程增强. 本文还从超微结构角度上,对酶活性变化的原因进行了讨论     

牛卵母细胞体外培养成熟前后及体外受精卵Alpabe的电镜细胞化学研究

本研究用Adams的改良柠檬酸铅法,对牛卵巢2—5mm卵泡中的细胞及体外培养成熟卵和体外受精卵进行了碱性磷酸酶(AIpcse)的电镜细胞化学研究、其Alpase活性有一定的变化规律。培养前的卵母细胞酶活性较强,主要定位于质膜及质膜下颗粒细胞突起膨大部和透明带上。体外培养成熟卯质膜上的酶活性明显减弱颗粒细胞突起已抽回。但是在增宽的卵周隙中有较多的酶反应产物。体外受精卯的酶活性很强,不仅表现在质膜上的酶活性增强,而且还定位于线粒体及一些空泡的膜和细胞基质中。可见,Alpase的活性随牛卵母细胞的成热过程减弱,随受精过程增强。     

小鼠2细胞胚卵裂球电融合的研究

分别用８００ｖ／ｃｍ、４０～８０μｓ的单个电脉冲；８００ｖ／ｃｍ、１６０～３２０μｓ的单个电脉冲；１０００ｖ／ｃｍ、１６０～３２０μｓ的单个电脉冲；１２００ｖ／ｃｍ、１６０～３２０μｓ的单个电脉冲；１０００ｖ／ｃｍ、１６０～３２０μｓ的２个电脉冲所获得的胚胎融合率分别为８４．６％（３３／３９），１００．０％（５９／５９），９７．４％（７４／７６），９５．１％（３９／４１），６４．７％（１１／１７）。融合胚作培养后，２细胞胚的发育率分别为１５．２％（５／３３），３９．０％（２３／５９），４７．３％（３５／７４），４３．６％（１７／３９），１８．２％（２／１１）。以１０００ｖ／ｃｍ，１６０～３２０μｓ的单个脉冲诱导注射ＬＨ３９～４３ｈ，４４～４８ｈ回收的２细胞胚，胚胎融合率分别为１００．０％（２７／２７），９６．４％（２７／２８）；发育率分别为４４．４％（１２／２７），３３．３％（９／２７）。２细胞胚卵裂球融合的适宜条件为１０００ｖ／ｃｍ和１６０～３２０μｓ的单个脉冲。     

小鼠2和4细胞胚卵裂球电融合参数的研究

用80μs和800,1000,1200,1400V/cm的脉冲获得的2细胞胚卵裂球融合率分别为53％(21/40),70％(32/46),82％(36/44),81％(29/36);用1200V/cm和80,160,320μs的脉冲获得2细胞胚卵裂球的融合率分别为82％(36/44),92％(44/48),70％(26/37)。用160μs和1400,1600,1800V/cm的脉冲获得的4细胞胚卵裂球融合率分别为77％(27/35),91％(39/43),79(30/38);用1600V/cm和80,160,320μs的脉冲获得的4细胞胚卵裂球融合率分别为73％(29/40),91％(39/43),77％(27/35)。2,4细胞胚卵裂球融合的适宜条件分别是1200V/cm和160μs,1600V/cm和160μs。     

细胞松驰素B诱导虾夷扇贝多倍体的受精卵染色体分离状况

报道了采用细胞松驰素B（CB）处理虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）受精卵抑制第一极体（PBI）释放的处理组与对照组的细胞染色体分离状况。结果表明，对照组中的受精卵具有19条四分体染色体，经过减数分裂Ⅰ期和减数分裂Ⅱ期，放出PB1和PB2，受精卵的发育具有不同步性。处理组受精卵在第二次减数分裂中出现了特殊的分离类型，即“三级分离”、“联合二级分离”和“独立二级分离”。初步分析了细胞松驰素B抑制第一极体放出的机理。     

牛老化卵体外受精后的胚胎发育速度与细胞遗传学研究

体外成熟培养和牛老化卵受精后发育到囊胚到期速度减慢。囊胚期的发育率分别为22h培养组的35．3％,34h组23．6％,46h组15．4％,胚胎的发育速度随培养时间的延长而明显减慢（P＜0．05）。46h组的囊胚期胚胎的平均卵裂球数明显少于22h组（P＜0．05）,老化组的染色体平均分裂像,分裂指数均明显低于对照组（P＜0．05）。染色体异常发生率46h组高于22h组。     

牛老化卵体外受精后的胚胎发育速度与细胞遗传学研究

体外成熟培养的牛老化卵受精后发育到囊胚期速度减慢.囊胚期的发育率分别为22h培养组为35.3%,34h组23.6%,46 h组15.4%,胚胎的发育速度随培养时间的延长而明显减慢(P＜0.05).46h组的囊胚期胚胎的平均卵裂球数明显少于22h组(P＜0.05),老化组的染色体平均分裂像、分裂指数均明显低于对照组(P＜0.05).染色体异常发生率46h组高于22h组.     

新生牛睾丸支持细胞的体外培养及鉴定分析

为探究支持细胞的体外培养特性,以新生牛睾丸组织为试验材料,利用组合酶消化法将其解离成单细胞悬液,并采用差速贴壁法纯化支持细胞后进行体外培养与鉴定.结果表明:支持细胞体外培养能够传至第20代,并且随着传代次数的增加,支持细胞的增殖速度越来越慢;添加2％血清浓度的DMEM/F-12的培养基即可用于支持细胞的体外培养;免疫组化染色显示,所培养的细胞内波形蛋白呈阳性;RT-PCR检测结果可见支持细胞标志基因SCF和GDNF的表达;第15代的支持细胞内含有正常的二倍体核型.     

细胞松弛素B对牛卵母细胞体外成熟过程中微管、微丝及染色体的影响

细胞松弛素B(Cytochalasin B,CB)是一种抑制微丝聚合的药物,能抑制微丝的组装从而阻止胞质分裂和极体排放,是研究细胞分裂器形成与变化的重要药物。在牛卵母细胞体外成熟培养过程中加入7.5 μg/mL的CB进行处理,分析CB对减数分裂过程中细胞骨架形态、染色体的排列与分离等方面的影响。结果显示,CB处理后卵母细胞第一极体的排放受到了抑制,染色体的排列和分离受到了影响,出现了同源染色体分离不完全或分离不均匀及分离后又聚在一起等异常情况,形成许多二倍体卵母细胞;纺锤体微管的形态发生了变化,出现了两个纺锤体、巨大纺锤体和多极纺锤体等异常结构;微丝的正常分布受到了影响,染色体周围没有或少有微丝分布,皮质下的微丝分布也变得少而不均匀;这说明微丝与微管在减数分裂过程中是协同作用的,CB通过影响微丝的动态变化,改变了纺锤体微管的形态结构,最终抑制了极体的排放。     

Production of early monozygotic twin bovine embryos in vitro by the blastomere separation and coculture technique

The objective of this study was to establish an efficient system of producing early monozygotic twin bovine embryos in vitro using the blastomere separation and coculture technique. In this study, early eight-cell embryos were chosen to optimize the separation method, and multi-coculture tactics were applied to improve the efficiency of this production system. Bovine embryo blastomeres(groups of at least 30 at the eight-cell stage) were separated into eight segments(to regard an eight-cell embryo as a tangerine, a blastomere as one segment) and one, two and four segments(blastomeres) were cultured respectively in microwells on the bottom of the four-well dish(Nunc, Denmark) with 400 μL of culture medium under paraffin oil. Four different types of coculture tactics(cocultured with nothing, intact embryos, bovine cumulus cells(b CCs), intact embryos b CCs) were applied to the group of four segments(blastomeres). Finally, diameter and inner cell mass(ICM):trophectoderm(TE) cell ratio was measured as a criterion to assess the quality of the twin embryos which were derived from bovine separated blastomeres. Our results showed that rate of blastocyst formation of the four segments group was significantly greater than one or two group(P0.05). In addition, rate of blastocyst formation was significantly increased when the four segments were cocultured with intact embryo b CCs(P0.05). Although the ICM, TE and total cells of blastocysts derived from separated blastomeres was less than the control group from intact embryo(P0.05), more important quality indicator of the blastocyst diameter and ICM:TE cell ratio was similar between our experimental group and the control group(P0.05). Thus, these results suggest that combined with intact embryos b CCs coculture system, culturing four isolated segments(blastomeres) per microwell is an efficient system of producing early monozygotic twin bovine embryos. Furthermore, our results also indicate that the quality of blastocysts derived from separated blastomere may be similar to those derived from intact eight-cell embryos.     

牛卵巢内卵母细胞体外成熟与受精的研究

利用屠宰牛的卵巢 ,研究了卵巢内 (IO)卵母细胞体外成熟、受精及发育能力。结果表明 ,成熟培养液中添加FSH (10 μg·mL-1)、hCG (2 0 μg·mL-1)和E2 (1μg·mL-1)等激素对IO卵母细胞受精发育能力有极显著促进作用(P <0 0 1) ;单独添加发情牛血清即可起到相同的效果。IO卵母细胞体外成熟培养 2 1～ 2 4h ,其卵裂率为 34 2 1%～36 80 % ,6～ 8细胞胚发育率为 2 3 6 8%～ 2 4 5 3% ,延长或缩短培养时间都会降低卵裂率 (P <0 0 1)和 6～ 8细胞发育率 (P <0 0 5 )。采用TALP液法处理精子虽与BO液法具有相似的卵裂率 ,但TALP液法能显著提高 6～ 8细胞胚发育率(P <0 0 5 ) ,授精前机械脱除卵丘会显著降低卵裂率和 6～ 8细胞胚发育率 (P <0 0 5 )。成熟培养液中的卵丘细胞与颗粒细胞单层均能显著提高IO卵母细胞受精后 6～ 8细胞胚的发育率 (P <0 0 5 )。     

牛未成熟卵母细胞体外受精及染色体分析

收集不同供体牛的卵母细胞并分成两组。体外成熟培养16h为不完全成熟组；体外成熟培养24h为完全成熟组。结果显示，体外受精48h后，成熟组大部分胚胎发育到8细胞期和16细胞期，不完全成熟组的多数胚胎发育到2细胞期和4细胞期。染色体异常发生率显著高于成熟组。染色体异常表现为单倍体、多倍体和混合倍体。引起染色体异常发生的原因可能是由于精子穿入时透明带或卵母细胞膜的功能障碍所引起。     

铜对牛卵母细胞体外成熟及体外受精胚胎发育的影响

研究了氯化铜对牛卵母细胞体外成熟及体外受精胚胎发育潜力的影响。培养液中铜的浓度以原子吸收光谱法测定。培养液中铜的浓度为0(对照组)、0.46和0.68 mg·L-1。结果表明,试验组在卵母细胞成熟和受精卵发育至2细胞率与对照组差异不显著(P>0.05),但试验组较对照组显著提高了桑椹胚和囊胚的发育率(P<0.05)。在卵母细胞体外成熟培养的0~22 h、受精卵培养的0~48 h、48~96 h、96~144 h和144~192 h,0.46 mg·L-1试验组培养液中铜浓度分别下降了4.3%、8.7%、26.0%、28.3%和30.4%,0.68 mg·L-1试验组培养液中铜浓度分别下降了2.9%、7.4%、23.5%、25.0%和27.9%。培养液中铜对牛早期胚胎培养至桑椹胚和囊胚有重要的作用,早期胚胎发育48 h后对培养液中微量元素铜的需求明显增加。     

牛卵巢卵母细胞体外成熟的研究

研究了卵巢采卵方法以及卵巢保存温度和时间、性周期阶段、激素和培养基对牛卵母细胞体外成熟的影响。结果表明:从屠宰场获取的卵巢,先切剖或抽吸卵泡再切割卵巢,可显著提高可用卵母细胞数。卵巢保存时间在 2 h 以内最好,最长不超过 6 h。30~39 ℃的生理盐水保存卵巢,卵母细胞的成熟率(63.9 %)和卵裂率(34.4 %)均显著高于 2~8 ℃(16.7 %、0 %)和 20~29 ℃(54.1 %、31.7 %)保存的。采集卵母细胞时卵巢所处性周期阶段(卵泡期、黄体期)对卵母细胞体外成熟的影响不大(成熟率分别为 69.2 %、64.3 %)。M199 是牛卵母细胞体外成熟理想的培养基,M199 + 50 IU/mL LH+ 100 IU/mL FSH + 1μg/mL 17?-E2和 M199 + 50 IU/mL GnRH+1μg/mL 17?-E2都是牛卵母细胞体外成熟理想的培养系统(成熟率分别为 69.4 %、67.5 %,卵裂率分别为 35.4 %、42.7 %)。     

生发泡移植过程对小鼠卵母细胞体外受精的影响

为研究生发泡(GV)移植后的重组卵母细胞能充分在体外成熟和发育,本试验比较了GV移植过程及体外成熟对小鼠卵母细胞体外受精的影响。通过透明带切口及GV移植获得的重组GV期卵母细胞的成熟率为87.0%(147/169),体外受精后发育到原核期胚和2-细胞期胚的比率分别为76.2%(112/147)和42.2%(62/147),与仅做透明带切口但不进行GV移植的对照组相似(P>0.05),表明GV移植过程未对卵母细胞体外受精后的早期胚胎发育能力产生不利影响。但与体内成熟的卵母细胞相比,体外成熟卵母细胞的受精率和卵裂率都明显降低,表明其进一步发育的能力受到影响。     

不同洗卵液对猪卵母细胞体外成熟和体外受精后早期发育的影响

探讨不同洗卵液对猪卵母细胞体外成熟和体外受精后早期发育的影响,以便开发出简易、经济的洗卵液。结果表明,使用TL-Hepes液、DPBS液、TCM-199()液和TCM-199()液作为洗卵液,对猪卵母细胞体外成熟和体外受精后的早期发育没有显著影响,说明4种洗卵液均可用于猪卵母细胞的洗涤,但DPBS液配制较简易且价格便宜,是最佳的选择。     

冻精解冻温度、离心速度及精卵共培养时间对延边黄牛卵母细胞体外受精的影响

进行延边黄牛冻精解冻温度、离心速度及精卵共培养时间等因素对延边黄牛体外受精效果影响的研究,旨在找出适用于延边黄牛体外受精的技术体系,为延边黄牛体外胚胎的产业化生产奠定基础．结果表明,在39℃下解冻精子,其顶体反应率和受精率分别为85．47％和75．85％,高于37,38和40℃等处理组,差异显著（P〈0.05）;采用1500r／min离心速度对精子进行离心处理,其顶体反应率和受精率分别为82．47％和72．15％,高于900和1800r／min处理组,但差异不显著（P〉0．05）;精卵共培养24h时卵母细胞受精率为75．33％,高于6和12h组,但差异不显著（P〉0．05）．     

培养条件对绵羊卵巢卵母细胞体外成熟及受精的影响

对绵羊卵巢卵母细胞体外成熟培养及体外受精培养条件进行筛选,结果表明:在基础培养基中添加FCS可以显著提高卵母细胞的体外成熟率,而添加10%、15%和20%FCS的组间,卵母细胞的成熟率差异不明显,表明在基础培养液中添加10%FCS即可使绵羊卵母细胞的体外成熟率达到一个比较高的水平;体外培养时间不同对绵羊卵母细胞的成熟有较大的影响,培养24 h和26 h的卵母细胞成熟率(分别为73.3%和77.5%)显著高于培养18 h和20 h的卵母细胞成熟率(分别为62.5%和65.0%);对活力较低的绵羊精子而言,采用直接上浮法要比离心洗涤法更有利于选取活力较高的精子,并可提高受精卵的卵裂率.     

羔羊超数排卵及体外受精技术研究

用FSH+ PMSG和FSH+LH 2种处理方法,对8只6周龄的高山细毛羊进行超数排卵试验,4只作对照组,并对采集到的卵子进行体外受精,探索羔羊超数排卵的可行性及体外受精的效果.结果表明:2组处理共获得发育卯泡583个,回收卵母细胞255枚.卵母细胞经体外培养24 h后与上游法获能的精子进行体外受精,48 h后2组处理...