PRRSV重组N蛋白的抗原性分析及其特异性抗体制备

利用大肠杆菌表达技术和亲和层析法纯化出重组PRRSV N蛋白 ,用间接ELISA法和Western blot分析 ,证明其具有较好的抗原性。将该纯化蛋白采用大剂量长程免疫法免疫家兔 ,制备了兔抗重组N蛋白抗体 ,用Western blot分析和竞争抑制试验证明其具有很高的特异性 ,ELISA效价达 1∶32 0 0以上。     

用重组核衣壳蛋白ELISA检测PRRSV抗体的研究

ＰＲＲＳＶ重组Ｎ蛋白ＥＬＩＳＡ检测人工感染猪血清７５份,与ＩＤＥＸＸ公司ＥＬＩＳＡ试剂盒及ＩＦＡ的符合率分别为９７．３％和１００％。检测疫苗免疫猪血清,阳性率１００％。在免疫后６ｄ就能检出抗体,比ＩＦＡ敏感。检测８５份我国田间猪血清,阳性率１８．８％。     

PRRSV抗体竞争ELISA检测方法的建立与标准化研究

以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核衣壳蛋白(N蛋白)基因的原核表达产物重组N蛋白为包被抗原,利用兔抗重组N蛋白血清和PRRS猪血清竞争该抗原,建立间接竞争ELISA方法检测PRRS抗体。经研究确定重组N蛋白的包被浓度为0·3μg/mL,检测血清不用稀释,兔抗重组N蛋白血清的工作浓度为1∶3000,酶标抗体的工作浓度为1∶10000,包被液为0·05mol/L、pH9·6的碳酸盐缓冲液。该方法特异性强,稳定性和重复性好,整个检测过程可在3h内完成。以IDEXX试剂盒的检测结果为参照标准,该方法的敏感性为79·76%,特异性为90·9%,符合率为83·59%。将该方法按试剂盒要求标准化,4℃放置5个月,检测效果不变。     

单抗捕获ELISA检测PRRSV抗体的方法的建立

以国内刚刚研制出的ＰＲＲＳＶ单克隆抗体为基础，建立了检测ＰＲＲＳ病毒抗体的单克隆抗体辅获抗原的ＥＬＩＳＡ法，其单抗包被浓度为１．１６μｇ／ｍＬ，粗提病毒反应浓度为１６．５０μｇ／ｍＬ，血清稀释度为１：４０。经与中和试验以及进口ＥＬＩＳＡ试剂盒比较，证明该法敏感性高，特异性良好，是一种有应用前景的方法。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白的高效表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 美洲株 ATCC VR2332 的 N 蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,用RT-PCR方法从PRRSV Hn-1/06株中克隆了大小为372 bp的 N 蛋白基因(EU025136).将 N 蛋白基因亚克隆到原核表达载体pET-32a中构建了重组表达质粒pET-N,在IPTG的诱导下成功表达了相对分子质量约为33 000的可溶性融合蛋白N-His;经SDS-PAGE和凝胶薄层扫描分析,融合蛋白的表达量约占细菌总蛋白量的29%.将融合蛋白加入镍琼脂糖凝胶树脂层析柱,经300 mmol/L咪唑磷酸盐缓冲液洗脱,其纯度可达,91%.用Western blotting分析纯化后的融合蛋白,显示良好的生物学活性.利用纯化融合蛋白作包被抗原及优化ELISA反应条件,建立了可检测抗PRRSV N 蛋白抗体的间接ELISA方法(N-ELISA),并将所建立的N-ELISA与国外进口的PRRS检测试剂盒IDEXX-ELISA对200份临床送检血清进行平行检测,阳性符合率为92.7%.结果表明,本试验建立的N-ELISA与IDEXX-ELISA具有同样高的特异性.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Resp株单克隆抗体的研制

利用Marc1 4 5细胞增殖和凝胶层析纯化的猪繁殖与呼吸综合征 (PRRSV)Resp株 ,建立了酶联免疫吸附试验 (ELISA)单克隆抗体筛选技术。在猪肺泡巨噬细胞 (PAM)上增殖、浓缩、纯化PRRSV并免疫Balb/c小鼠 ,用PEG - 1 50 0进行细胞融合。结果表明 ,细胞融合率为 70 6 % ,初检PRRSV抗体阳性率为 6 3 %。经 2次亚克隆获得了 2株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,其单抗间接荧光抗体试验 (IFA)可用于检测细胞培养物中的PRRSV抗原 ,为研究PRRSV分离株免疫特性和改进PRRSV检测技术奠定了一定基础     

1株抗欧洲型和美洲型PRRSV核衣壳蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

利用RT-PCR方法扩增出欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SS-6毒株的核衣壳(N)蛋白基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1上,构建了重组表达质粒pGEX-N,并将其转化到大肠杆菌BL21中,在诱导剂IPTG的诱导下获得高效表达,重组蛋白的分子量约为40 ku。用纯化的重组N蛋白免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体。经细胞融合获得一株可稳定分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,命名为1 B6,将其连续培养20代后仍能稳定分泌抗体。亚型鉴定结果为IgG1型,其轻链为κ链;间接免疫荧光试验和免疫印迹试验均证明,1B6单抗既能与欧洲型PRRSV反应,也能与美洲型PRRSV反应;ELISA检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1:640,腹水的效价为1:256 000,为猪繁殖与呼吸综合征的诊断奠定了基础。     

PRRSV GP5和M抗原中和表位的融合表达与纯化以及间接ELISA检测方法的建立

为建立检测猪血清中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)中和抗体的间接ELISA方法,分析了PRRSV结构蛋白GP5和M的二级结构抗原指数、抗原性、亲水性、表面可及性以及潜在中和表位等参数,选取GP5的47～61、143～156和186～199位氨基酸,M蛋白的63～70、133～146和156～169位氨基酸作为免疫原...     

抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以大肠埃希菌表达的与GST融合的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白为抗原,免疫Balb/c小鼠,经细胞融合、克隆后,获得1株能稳定分泌抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为52-C.52-C杂交瘤细胞染色体平均数为90条(86～96);经间接ELISA鉴定,单抗52-C为IgG2a亚型;腹水效价为100×27;与伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、圆环病毒(PCV)、猪瘟病毒(CSFV)和口蹄疫病毒(FMDV)无交叉反应;不能中和PRRSV.以表达的GP5不同突变体为抗原经间接ELISA和Western blot证实,单克隆抗体52-C针对的表位位于GP5蛋白的胞内区.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

试验通过RT-PCR法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)核衣壳蛋白(N蛋白)基因并克隆到原核表达载体pet-30a中,转入到BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达,使用SDS-PAGE和Western blotting分析表达产物的特性。利用Ni柱纯化该重组蛋白,采用NC膜皮下包埋法免疫Balb/C小鼠,取免疫后的脾细胞与SP2/0细胞进行融合后筛选杂交瘤细胞株,检测杂交瘤细胞株的特性并制备单克隆抗体。SDS-PAGE和Western blotting结果表明,该重组蛋白表达正确,约为20 ku,能被抗PRRSV的阳性血清特异性识别。超声后用Ni柱纯化,经SDS-PAGE分析可得单一的目的条带。NC膜皮下包埋法免疫效果良好,通过细胞融合、ELISA筛选获得3株能稳定分泌抗PRRSV N蛋白抗体的杂交瘤细胞株(H7、F7、C8),制备出高特异性的针对N蛋白的H7单抗。IFA与Western blotting结果显示制备的单抗可与病毒N蛋白产生特异性反应。亚型鉴定为IgG2b型,染色体分析证实杂交瘤细胞染色体数目正确。结果成功实现了N蛋白的原核表达,并获得高特异性的单克隆抗体,为PRRSV N蛋白抗原的检测奠定基础。     

3种ELISA试剂盒检测抗牛支原体抗体的比较

为比较3种抗牛支原体(M.bovis)血清抗体的ELISA试剂盒检测效果,本实验应用3种检测M.bovis血清抗体ELISA诊断试剂盒对38份阳性样品(自然感染19份,人工感染18份)和37份阴性样品进行检测.结果表明:本实验室制备的HVRI试剂盒与商品化试剂盒Kit 1的检测结果和综合检测结果符合率分别达到92%和96%;而商品化试剂盒Kit 2的检测结果与综合检测结果符合率仅为74.67%.一致性检验结果显示:HVRI试剂盒与Kit 1的一致性较高;Kit 2与HVRI试剂盒、Kit 2与Kit 1有中度的一致性.此外,3种试剂盒对牛传染性胸膜肺炎国际标准血清(PS2)的检测结果显示HVRI试剂盒和Kit 1均为为阴性,Kit 2为阳性.因此,HVRI试剂盒与Kit 1更适于M.bovis检测和开展流行病学调查.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组结构及检测技术研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒是引起母猪繁殖障碍性疾病的主要病原体之一,本文对猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因组、编码结构蛋白、非结构蛋白、血清学诊断方法及分子生物学检测技术方面的研究进展予以综述,以期为进一步研究奠定基础.     

Detection of pseudorabies virus antibody in swine serum and oral fluid specimens using a recombinant gE glycoprotein dual-matrix indirect ELISA

Pseudorabies (Aujeszky disease) virus (PRV) was eliminated from domestic swine in many countries using glycoprotein E (gE)-deleted vaccines and serum antibody gE ELISAs, but PRV continues to circulate in some regions and in most feral swine populations in the world. We created a dual-matrix (serum and oral fluid) indirect IgG gE ELISA (iELISA) and evaluated its performance using samples from 4 groups of 10 pigs each: negative control (NC), vaccination (MLV), PRV inoculation (PRV), and vaccination followed by challenge (MLV-PRV). All serum and oral fluid samples collected before PRV challenge and all NC samples throughout the study were negative for gE antibodies by commercial blocking ELISA (bELISA) and our iELISA. Nasal swab samples from 9 of 10 animals in the PRV group were gB quantitative PRC (qPCR) positive at 2 days post-inoculation (dpi). The oral fluid iELISA detected a significant S/P response in the PRV (p = 0.03) and MLV-PRV (p = 0.01) groups by 6 dpi. ROC analyses of serum bELISA (n = 428), serum iELISA (n = 426), and oral fluid iELISA (n = 247) showed no significant differences in performance (p > 0.05). Our data support the concept of PRV surveillance based on oral fluid samples tested by an indirect gE ELISA.     

猪蓝耳病病毒抗体双抗原夹心ELISA方法的建立及初步应用

根据PRRSV VR-2332株序列设计了1对扩增PRRSV N蛋白基因的特异性引物,从PRRSV北方株感染细胞中提取总RNA,通过RT-PCR获得长约372 bp的N蛋白编码基因片段。将其克隆到pGEX-6p-1质粒,构建了原核表达载体pPRRS-N。重组基因在大肠杆菌中表达出相对分子质量约为41 000的融合蛋白,目的蛋白表达量约占菌体蛋白的28.5%。利用此重组融合N蛋白建立了一种检测PRRSV特异性抗体的双抗原夹心ELISA,并通过与商品化试剂盒的应用比较对本方法进行了系统评价。分析了来自北京、山东、河南、河北4省区13个养猪场的260份血清,结果表明,本方法的敏感性和特异性分别为93.5%和86.7%,与IDEXX PRRSV抗体检测试剂盒检测结果的符合率达到91.5%。     

蛋白营养粉对断奶仔猪生长性能和蓝耳病毒抗体效价的影响

选取160头23日龄断奶仔猪,随机分成A、B、C、D 4组,每组4个重复,每个重复10头,A组为对照组,饲喂基础日粮,B、C、D组为试验组,分别饲喂用蛋白营养粉以1%、2%、3%的添加量等比例替代基础日粮中鱼粉的日粮,研究蛋白营养粉替代鱼粉对仔猪生长性能和蓝耳病毒抗体效价的影响。试验期21 d。试验结果表明:试验前期(1～10 d),对照组平均日增重、料重比均优于各试验组,其中料肉比显著低于2%替代组(P<0.05);试验后期(11～21 d),1%替代组的平均日增重、平均日采食量、料重比等指标均优于对照组(P>0.05),2%替代组的平均日增重、平均日采食量、料重比较对照组差,但差异不明显(P>0.05);全期试验中,1%、2%替代组仔猪生长性能与对照组无显著差异(P>0.05),试验组腹泻率较对照组无显著差异(P>0.05),试验组的蓝耳病毒抗体阳性率和抗体效价较对照组均有所提高。     

美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白中和活性单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

为制备具有中和活性的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究利用PRRSVSD53株的超离病毒作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠并进行细胞融合。采用PRRSVSD53株和真核表达的PRRSV各结构蛋白作为检测抗原,应用间接免疫荧光试验(IFA)筛选到一株稳定分泌抗SD53株GP4蛋白的杂交瘤细胞株(LM26)。抗体亚类鉴定其为IgG2a,轻链为κ链。原核表达一系列截短的GP4蛋白鉴定LM26的抗原表位结果显示,LM26识别的抗原表位序列为57VVLQDI^62,此抗原表位在美洲型PRRSV中相对保守。病毒中和试验结果显示,MAb LM26仅针对PRRSV SD53株具有中和活性,中和效价最高为1∶50,对其它美洲株PRRSV均不具有中和活性。该MAb的制备为进一步研究PRRSVGP4蛋白的结构和功能奠定了基础。     

犬瘟热病毒重组核蛋白间接ELISA方法的建立

将已构建成功的重组质粒pGEX-4T-1-N转化大肠杆菌BL21株,在最佳诱导条件下获得犬瘟热病毒(CDV)重组N蛋白。将表达产物纯化后进行SDS-PAGE和W estern-b lot分析,与CDV标准阳性血清呈阳性反应。本研究初步建立了以纯化的N蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,经初步试验证实,该方法敏感、特异。试验结果表明,大肠杆菌中表达的CDV N蛋白在免疫原性上与天然核衣壳蛋白具有较高相似性,可作为诊断用抗原。     

Establishment and Application of an Indirect ELISA with Recombinant N Protein of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

To establish a sensitive,specific and efficient method of antibody detection for porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV),PRRSV N protein was expressed through prokaryotic expression system and purified by affinity chromatography to act as a coating antigen.Then an indirect ELISA detection method for serum PRRSV antibody was finally set up after the optimization of reaction conditions.Besides,the research also involved cross reaction,repeated experiments,and comparison with other ELISA kits.It was determined that the optimum concentration of coating antigen was 2 μg/mL and that the dilution ratio for serum was 1:100,with 30 min of incubation and 10 min of chromogenic reaction.With this method,positive serum samples of five common swine pathogens,including classical swine fever virus（CSFV),porcine circovirus（PCV）and porcine pseudorabies virus（PRV）and so on,were tested,and the results were negative.Both intra-assay and inter-assay coefficients of variation were below 10%,and the comparison with commercial ELISA kits indicated that its accuracy was 94.7%.So this indirect ELISA,which had been established in this research,could provide a rapid diagnosis for swine infected by wild PRRSV and applied in epidemiological investigation,as a convenient and efficient serological antibody detection method.     

猪流行性腹泻病毒N蛋白阻断ELISA抗体检测方法的建立及初步应用

旨在建立一种猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白阻断ELISA抗体检测方法.本研究将纯化的N蛋白作为包被抗原,通过棋盘滴定法优化ELISA反应条件,建立了检测PEDV抗体的阻断ELISA方法,并对其进行特异性、敏感性和重复性试验.对140份临床血清样品进行检测,并将检测结果与市售IDvet PEDV间接ELISA抗体检测...     

两种不同ELISA法在检测猪繁殖与呼吸综合征抗体中的选择与应用

猪繁殖与呼吸综合征（简称猪蓝耳病）是引起母猪繁殖障碍和仔猪、育成猪呼吸道症状的一种高度接触性传染病。本文比较了两种常用的检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的ELISA方法,确定IDEXX猪蓝耳病抗体ELISA检测试剂盒适合蓝耳病感染抗体的检测和早期诊断;LSI猪蓝耳病抗体ELISA检测试剂盒适合蓝耳病免疫抗体的监测。两种ELISA方法在应用范围和诊断意义方面完全不同,因此在日常监测中,应根据监测目的合理选择猪蓝耳病抗体检测试剂盒。