2种化学激活方法制备的小鼠孤雌胚胎早期发育指标比较研究

为了寻找一种更健康、更有效地制备孤雌胚胎的方法,进而从根本上提高哺乳动物孤雌胚胎、体外受精胚胎及核移植胚胎成活率并减少孤雌胚胎、核移植胚胎出生后发生潜在疾病与缺陷的几率。通过比较2种不同化学激活方法（试验组I：7%乙醇+2 mmol/L 6DMAP;试验组II：7%乙醇+2 mmol/L 6 DMAP+5 μg/mL CB）制备的小鼠孤雌胚胎由卵母细胞激活到发育至囊胚的时间、囊胚形态及囊胚细胞数目,初步研究了不同化学方法制备的小鼠孤雌胚胎在形态学及细胞水平上的差异性。结果表明：试验组I与试验组II相比,前者比后者卵裂率稍高,桑葚率、不同时间段的囊胚率稍低,但两组间数据差异不显著(64.9 vs73.7,P>0.1;31.7 vs28.8,P>0.1;8.7 vs5.5,P>0.1)。2种方法所得的孤雌囊胚在形态上相似,但是试验组II囊胚细胞数要比试验组I囊胚细胞数稍少(67vs50,P>0.1);两组囊胚的细胞数与受精囊胚相比没有显著差异(67vs50vs65,P>0.1)。选用的2种化学方法制备的小鼠孤雌胚胎,在由卵母细胞发育至囊胚的时间、囊胚形态及囊胚细胞数目方面没有显著差异。     

EGF对牛卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响

在卵母细胞体外成熟液（含FSH）中分别添加10,30,50ng/ml表皮生长因子（EGF）,24h检查成熟率,并进行孤雌激活。结果表明：添加10ng/ml、30ng/ml EGF组牛卵母细胞成熟率较对照组（未添加EGF）无显著差异（79.8% vs 71.5% vs 70.4%,p>0.05）,但EGF添加至50ng/ml时牛卵母细胞第一极体排出率显著提高,达85.4%（P<0.01）;在实验1的基础上,比较培养液中添加10ng/ml、30ng/ml 、50ng/ml EGF对牛孤雌激活胚胎体外发育的影响,结果发现在培养液中添加EGF并不能显著提高牛卵母细胞体外孤雌发育囊胚率（P>0.05）,但可显著提高其囊胚孵化率（P<0.01）。     

血管内皮生长因子对猪卵母细胞体外成熟的影响研究

为了探讨适宜浓度的(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)对猪卵母细胞体外成熟的影响,以提高猪卵母细胞的成熟效果进而促进胚胎的后期发育,以期为进一步改善猪卵母细胞体外成熟体系提供参考。本研究通过在猪卵母细胞体外成熟培养液中添加不同浓度的VEGF,成熟培养液(TCM199+BSA)中分别添加0 ng/mL VEGF对照组、5 ng/mL VEGF试验组Ⅰ、50 ng/mL VEGF试验组Ⅱ、500 ng/mL VEGF试验组Ⅲ的卵母细胞成熟培养后,经孤雌或体外受精和体外培养。结果表明：（1）试验组Ⅰ极显著地提高了猪卵母细胞的成熟率,试验组Ⅱ显著提高了猪卵母细胞的成熟率;（2）成熟的卵母细胞经孤雌激活和体外培养后,试验组Ⅰ极显著提高了孤雌胚胎的卵裂率和囊胚率。试验组Ⅱ显著提高了孤雌胚胎的卵裂率、极显著的提高了囊胚率;（3）成熟的猪卵母细胞经体外受精和体外培养后,试验组Ⅰ显著地提高了体外受精胚胎的卵裂率和囊胚率,试验组Ⅱ显著地提高了体外受精的卵裂率、极显著地提高了囊胚率。5 ng/mL或50 ng/mL的VEGF,有利于促进猪卵母细胞的体外成熟和早期胚胎的发育。     

卵泡液对牛卵母细胞发育潜力的影响

为了确定卵泡液(直径大于10 mm)对卵母细胞成熟的影响,共收集1759枚卵母细胞进行试验。在成熟液中分别添加0%,10%,30%和50%的卵泡液(bFF, bovine follicular fluid ),成熟培养24h后,孤雌激活或者体外受精和胚胎培养;对比10% bFF和10% 胎牛血清（FBS）,以及观察微滴培养对卵母细胞成熟的影响。结果表明,在孤雌激活组中,bFF浓度对卵裂率的影响差异不显著,但胚胎囊胚发育率高于对照组（P<0.05）;在体外受精组中随着bFF浓度增加而卵裂率下降(P<0.01),而且囊胚率也下降(P<0.05)。在10%的bFF组中,孤雌激活囊胚率和体外受精囊胚率分别为47.1% 和38.0%,囊胚扩张率显著高于其它组。从试验得出,添加10% bFF有利于卵母细胞胞质成熟,且不会降低到受精率,而且可以替代FBS;微滴培养不利于卵母细胞成熟。     

组织蛋白酶抑制剂E-64对猪卵母细胞体外发育能力的影响

为探明外源性组织蛋白酶抑制剂(E-64)对猪卵母细胞体外发育能力的影响,通过向成熟液中添加1、5、10μmol/L的外源性组织蛋白酶抑制剂,对猪卵丘-卵母细胞复合体(COCs)进行体外成熟培养46 h,统计第一极体率,随后分别进行体外受精和孤雌激活,统计第2天的卵裂率和第7天的囊胚率。结果表明,成熟液中加入1μmol/L E-64的第一极体排出率显著高于未添加的对照组以及5、10μmol/L E-64的添加组。将体外成熟的卵母细胞进行体外受精及孤雌激活,体外受精后胚胎的卵裂率与囊胚率结果均为成熟液中加入1μmol/L E-64的添加组显著高于对照组以及5、10μmol/L E-64的添加组;孤雌激活后,4组间胚胎的卵裂率差异不显著,囊胚率为10μmol/L E-64的添加组显著低于其他3组。因此1μmol/L E-64能促进猪卵母细胞的核成熟,并能进一步提高其体外受精后的卵裂率和体外培养的囊胚率。     

不同来源牛体外胚胎与牛子宫内膜细胞共培养体系的建立

为了初步建立有效的牛胚胎与子宫内膜细胞的体外共培养体系。本实验分别将体外受精第7天后的胚胎和孤雌激活,与培养7天的胚胎与子宫内膜细胞共培养,在48 h和72 h后分别统计体外受精实验组和孤雌激活实验组的孵化率。实验结果表明：在本实验室培养条件下,在与子宫内膜细胞共培养48 h后,体外受精胚胎和孤雌发育胚胎在孵化率上存在显著差异(40±5)%、(25±5)%,(P＜0.05);与子宫内膜共培养72 h后,孵化率无显著差异(70±8.66)%,(65±5)%,(P＞0.05)。本实验证明了在体外环境下,牛体外胚胎与子宫内膜细胞共培养后能够正常孵化,可以初步建立起牛体外胚胎与子宫内膜细胞的体外共培养体系,并为进一步研究该体系对牛体外胚胎培养质量的影响奠定一些基础。     

X射线灭活活体日本沼虾精子的初步研究

为检测X射线对日本沼虾精子的灭活效果,利用X射线对雄性日本沼虾进行不同时间的照射处理,将处理后的雄虾与刚完成生殖脱壳的雌虾交配。待雌虾产卵后,计数雌虾抱卵天数,并在显微镜下观察卵的畸形情况。X射线管照射强度为100 k V,5 m A,源距10 cm,照射时间为0、30、60、90、120 min。结果发现:照射30 min组的抱卵天数及卵的畸形率较0 min组无变化,卵的畸形率为0,卵能正常发育至孵化出膜。随着照射时间的增加,在30~90 min之间,雌虾抱卵天数逐渐减少,且所抱卵的畸形率呈上升趋势。照射120 min组的抱卵天数较90 min组变化不大,卵的畸形率达100%。在本试验照射时间范围(0~120 min)内,灭活日本沼虾精子遗传物质的最佳照射时间为90~120 min。     

外源性孕酮对牛卵母细胞体外核成熟的影响

了研究外源性孕酮对牛卵母细胞体外核成熟的作用,通过向成熟培养液中添加10 μg/mL FSH +10 μg/mL LH（对照组）和0 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1000 ng/mL的外源性孕酮,对牛卵丘卵母细胞复合体进行体外成熟培养,在培养8 h后用醋酸地衣红染色观察各自的生发泡破裂率,然后在成熟22 h统计第一极体率,体外受精后7~8天统计囊胚率。结果表明,对照组卵母细胞的生发泡破裂率(75.0%)和极体率(79.6%)均明显高于添加不同浓度孕酮的各处理组(P<0.05),而囊胚率各组之间均无显著差异(P>0.05)。因此,外源性孕酮不能促进牛卵母细胞的核成熟,单独添加外源性孕酮不能起到与内源性孕酮相同的作用。     

Ghrelin对小鼠不同来源胚胎体外发育的影响及其受体的表达模式

为探明Ghrelin及其受体Ghsr-1a在早期胚胎发育中的作用,以小鼠体内受精、体外受精和孤雌激活胚胎为研究对象,在其体外发育过程中添加不同浓度Ghrelin,观察胚胎发育效率;通过免疫荧光染色和荧光定量PCR,观察不同时期胚胎中Ghsr-1a的变化。结果表明,体内受精胚体外发育中添加0.1 ng/m L Ghrelin显著降低了囊胚率(P0.05),添加1 ng/m L的Ghrelin显著降低了小鼠体外受精胚的囊胚率(P0.05)。在体内受精胎中,Ghsr-1a的mRNA表达水平在4细胞显著高于其他时期(P0.05);体外受精胚中,Ghsr-1a的mRNA水平在8细胞前无明显差异,桑椹胚和囊胚显著下降(P0.05)。在孤雌激活胚胎中,Ghsr-1a的mRNA表达水平从2细胞到8细胞显著降低,之后到囊胚期开始显著升高,其蛋白表达模式与mRNA表达模式相反。Ghsr-1a在体内受精和体外受精胚胎中的表达相似,囊胚期表达量最低。结果提示,Ghrelin能够抑制体内和体外受精胚的体外发育,不同来源胚胎Ghsr-1a mRNA和蛋白表达模式均不相同。研究结果为进一步探索Ghrelin在胚胎发育中的作用机制提供了试验基础。     

山羊转t-PA突变体基因的体细胞核移植研究

比较了用转t-PA突变体基因的胎儿成纤维细胞和卵丘细胞作供体时核移胚的发育情况。结果表明：卵丘细胞作供体时,核移胚的卵裂率（82.9%）和桑葚胚率（55.9%）均高于胎儿成纤维细胞卵裂率（75.7%）和桑葚胚率（48.7%）,但差异不显著（P＞0.05）;卵丘细胞作供体时的囊胚率（19.7%）则高于胎儿成纤维细胞（11.0%）,差异显著。(P<0.05)。比较了饥饿处理与否对胎儿成纤维细胞作供体时转基因核移胚的发育情况。结果表明：供体细胞饥饿后,其核移胚的卵裂率（75.6%）与供体不饥饿的卵裂率（75.8%）差异不显著;供体细胞饥饿后,其核移胚的桑葚胚率（46.5%）和囊胚率（11.0%）高于供体不饥饿的桑葚胚率（39.3%）和囊胚率（9.0%）,但差异不显著。比较了SOFaa和CR1aa分别添加10%FBS和bFF后,转基因核移胚的发育情况。结果表明：用CR1aa液培养时,添加10%bFF,其囊胚率（9.1%）高于添加10%FBS（4.2%）（P＞0.05）;用SOF液培养时,添加10%bFF,其囊胚率（11.2%）高于添加10%FBS（5.5%）（P＞0.05）。说明用SOF液优于CR1aa液。     

鼠、兔核质杂交及早期胚胎发育的研究

以2~8细胞期鼠胚细胞为供体核,选用注射hCG后15h、17h的兔卵母细胞为受体胞质,施加1.6 kv/cm、160、两次脉冲的电场条件,间隔20min,融合液为含Ca、Mg的0.3mol/L甘露醇,适于鼠、兔种间EOBC的融合激活。小鼠2—细胞、4—细胞期胚细胞与兔去核卵母细胞融合率高于8—细胞期胚细胞,分别为83%、80%及62.5%,桑囊胚发育率差异不显著。体细胞共同培养系统和Taurine能显著提高鼠、兔核质杂交胚的体外发育能力。     

不同培养液对鹅胚胎体外培养的影响

为了探讨不同培养液对鹅胚胎体外培养的影响,本试验分别用鸡、鸭、鹅3种稀蛋白作培养液对90只鹅胚进行体外培养。结果表明：用鹅稀蛋白作培养液优于鸡稀蛋白和鸭稀蛋白。鹅稀蛋白组在第6、15天时鹅胚存活率显著高于鸭稀蛋白组(P<0.05),鹅胚存活率在第6、15天分别为33.33%、20.00%;在第31天时鹅稀蛋白组鹅胚存活率为3.33%,其他两组为0。综上所述,鹅胚体外培养效果因培养液的不同而不同,在鸡、鸭和鹅稀蛋白3种培养液中,以选用鹅稀蛋白为宜。     

猪腔前卵泡卵母细胞体外成熟培养初探

【研究目的】为了进一步挖掘猪的遗传潜力,为体外受精、动物克隆和转基因等胚胎生物技术研究提供大量优质卵源。【方法】以极体排出情况为判断标准,采用一步法和两步法成熟培养猪腔前卵泡卵母细胞,来考察猪腔前卵泡卵母细胞最佳成熟方式。【结果】采用任何一种方法卵母细胞经体外成熟后都没有达到MⅡ。然而,腔前卵泡体外培养5d后,分离出的卵丘卵母细胞复合体再培养12d,卵母细胞平均直径达到102.68μm(102.68±12.21),接近正常成熟卵母细胞的体积,为卵母细胞的成熟创造了条件。【结论】用两步法培养猪的腔前卵泡,其卵母细胞能够达到接近正常成熟卵母细胞的体积,说明采用两步法培养猪腔前卵泡卵母细胞是可行的。     

成熟液中添加白藜芦醇对猪卵母细胞体外发育和抗冻能力的影响

为探究猪卵母细胞成熟培养液中添加白藜芦醇(Resveratrol,RES)对其体外发育与抗冻能力的影响。本试验通过添加不同浓度的RES,观察其对卵母细胞体外发育和相关基因的表达的影响;通过OPS(Open Pulled Straw)玻璃化冷冻和解冻,观察RES对卵母细胞冷冻前后线粒体功能、凋亡和发育能力的影响。结果表明：(1)成熟培养液中添加2 μmol/L RES有利于提高猪卵母细胞的体外成熟和发育能力,提高RES浓度至10 μmol/L时则表现为细胞毒性作用;(2)添加2 μmol/L RES可显著提高卵母细胞Sirt1,MATER,SOD1和Bcl2基因的表达量,并显著降低c-mos,MAPK和Mfn2的表达;当RES添加量增至10 μmol/L时,卵母细胞凋亡相关基因的表达呈现出促凋亡状态;(3)添加RES后,成熟卵母细胞在冷冻前后的ROS水平均要低于未添加组,ATP含量和线粒体膜电位值则高于未添加组;(4)成熟液中添加RES后,卵母细胞冻后FDA染色存活率和孤雌激活卵裂率均高于未添加组,,早期凋亡率则低于未添加组,其中FDA染色存活率差异显著。综上所述,2 μmol/L的RES在猪卵母细胞成熟液中添加,可通过改善其发育和凋亡相关基因的表达,提高线粒体功能,达到提高卵母细胞发育和抗冻能力的目的。     

Effect of genotype and light intensity on somatic embryogenesis and plant regeneration in melon (Cucumis melo L.)

The efficiency of 14 commercial cultivars of melon (Cucumis melo L.) for callus induction, plant regeneration and somatic embryogenesis under different photosynthetic photon flux densities (PPFDs) (150 or 50μmol m^?2 s^?1) was investigated. Cotyledonal explants were cultured on a Murashige and Skoog (MS) medium supplemented either with 9.0 μM 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and 23.2μM kinetin or with 0.05 μM 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and 0.26 μM 6-benzyladenine for the induction of somatic embryogenesis and shoots, respectively. For embryo maturation and root induction, growing callus tissues were transferred on growth regulator-free MS medium. Both genotype and the intensity of light significantly affected the rate of somatic embryo-genesis, embryo maturation and plant regeneration. On average, 12–47 primary globular-stage embryos were produced per mm² of explant surface. Fully developed, cotyledonary-stage somatic embryos were obtained from only three cultivars. Relatively high root induction rates were observed both on the shoot induction medium (11 cultivars) and on growth regulator-free medium (seven cultivars). In contrast, only six cultivars responded positively to the shoot induction treatment. Callus growth and somatic embryogenesis were significantly improved if cultures were incubated under higher PPFD values, although plant regeneration from all cultivars was significantly reduced under the same conditions.     

5-氮杂胞嘧啶核苷降低小麦成熟胚再生频率

为了研究组蛋白乙酰化对小麦再生的影响,以CB037、Fielder和中国春(CS)的成熟胚为外植体,在培养基中添加不同浓度的5-氮杂胞嘧啶核苷(5-azaC),分析了胚性愈伤组织诱导率、愈伤组织分化率和绿芽诱导率.结果表明,添加50 μmol/L 5-azaC,CB037绿芽诱导率为54.72％,与对照79.62％相比...     

EGF和GSH对牛卵母细胞体外受精的影响

研究了牛卵泡卵母细胞体外受精时向成熟液中加入EGF(表皮生长因子),受精液中加入GSH(谷胱甘肽)对受精率和囊胚率的影响。成熟液以M-199为基础液并加入一定浓度的促性腺激素和OCS,作为成熟液的对照组,试验组加入不同浓度的EGF。受精液以改良TALP为基础液并加入一定浓度的BSA、肝素和咖啡因,作为受精液的对照组,试验组加入不同浓度的GSH。早期胚胎培养液为SOFaa。在成熟液中加入10ng/mlEGF和50ng/ml EGF组时,试验组与对照组的受精率分别为76.00%(114/150)、76.71% (112/146)和60.70%(85/140);囊胚率分别为23.68%(27/114)、24.11%(27/112)和17.64%(15/85);在受精液中加入1mMGSH和10 mM GSH组时,试验组与对照组的受精率分别为71.66%(86/120)、63.28%(81/128)和76.00%(114/150);囊胚率分别为34.88%(30/86)、24.69%(20/81)和23.68%(27/114)。结果表明,成熟液中加入EGF对牛卵母细胞的体外成熟和受精后的早期胚胎的发育都有促进作用,在一定范围内增加EGF浓度,不会 提高受精率和囊胚率;受精液中加入一定浓度GSH能够提高受精率和囊胚率,但是在高浓度的GSH时则影响受精率。     

蓖麻标雌/单雌/两性系花序MSAP反应体系的建立

为了建立Lm型雌性系蓖麻不同发育时期的标雌/单雌/两性系花序MSAP反应体系,提取不同类型不同发育时期的花序基因组DNA,混合成基因池;用EcoRⅠ和HpaⅡ/MspⅠ的组合,12 h可将DNA酶切完全;16℃条件下,将酶切产物与EcoRⅠ、HpaⅡ/MspⅠ接头过夜连接;连接产物用于预扩增。优化后的预扩增反应体系为10×PCR Buffer 2.5μL、d NTPs(10 mmol/L)2.5μL、Mg2+(25 mmol/L)2.0μL、模板2.0μL、E0扩增引物(10pmol/μL)1.5μL、H0扩增引物(10 pmol/μL)1.5μL、LA Taq(5 U/μL)0.25μL、dd H2O 12.75μL。预扩增产物稀释10倍后用于选择性扩增。优化后的选择性扩增体系为10×PCR Buffer 2.5μL、d NTPs(10 mmol/L)2.0μL、Mg2+(25mmol/L)4.0μL、模板3.0μL、EX扩增引物(10 pmol/μL)1.0μL、H/MX扩增引物(10 pmol/μL)1.0μL、LA Taq(5U/μL)0.30μL、dd H2O 11.2μL。