玉米赤霉烯酮化学发光免疫分析检测系统设计

为了保障粮食安全,该研究根据玉米赤霉烯酮抗原抗体反应,以及辣根过氧化物酶催化鲁米诺过氧化氢反应产生化学发光,设计一款应用于粮食行业的玉米赤霉烯酮检测系统。采用侧窗型高精度光电倍增管MD983以及16位AD转换芯片,实现化学发光强度信号的准确测量;步进电机驱动旋转精密转台,通过优化步进电机的S型脉冲驱动控制曲线参数,完成转台的高精度定位控制,实现光电倍增管的测试窗口和化学发光孔精确对准;通过精密直线导轨滑台驱动加样器的进给,实现反应液微米量级的准确微量加样。利用竞争性免疫分析方法,使得赤霉烯酮毒素为0 μg/kg情况下,化学发光反应具有最大发光量,解决真菌毒素低浓度情况下的检测精度难题。经过试验验证,系统检出限为0.1 μg/kg,样品加标回收率在90%以上,标准曲线决定系数为0.996 5,系统检测玉米赤霉烯酮的线性范围为0~60 μg/kg。研究表明建立的玉米赤霉烯酮检测系统满足国家粮食行业对于粮食中玉米赤霉烯酮含量检测要求,为真菌毒素检测仪器的国产化提供参考。     

玉米赤霉烯酮降解酶基因（ZEN-jjm）的克隆、表达及活性分析

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是世界上污染范围最广泛的一种镰刀霉毒素,能导致人或动物不孕、流产等症状,损害内脏器官并促进癌细胞的生长.本文通过设计1对特异性引物,从粉红螺旋聚孢霉(Gliocladium roseum)中克隆获得大小为795 bp的DNA片段(ZEN-jjm),通过构建E. coil原核表达载体进行表达.经HPLC检测证实,IPTG诱导后的细胞裂解上清能在3 h内完全降解液体中1μg/mL的ZEN.序列分析结果表明ZEN-jjm与zhd101存在9个碱基的差异,ZEN-jjm编码的ZEN降解酶与文献报道的乳糖水解酶存在3个氨基酸的差异,但ZEN毒素降解实验证实二者活性相似.     

高速液相色谱法测定玉米中玉米赤霉烯酮（ZEA）残留

本文介绍了一种快速高效液相色谱法定量测定玉米中真菌毒素玉米赤霉烯酮的方法。样品用甲醇,乙腈,水混合液提取,提取液经液－液分配萃取,硅镁吸附剂柱层析纯化后,用反相柱ＯＤＳ－Ｈｙｐｅｒｓｉｌ分离,流动相为甲醇或者甲醇与水混合液。     

解淀粉芽孢杆菌NS2降解玉米赤霉烯酮的研究

为了丰富玉米赤霉烯酮(ZEN)解毒菌种库,通过采集湖南省邵阳市等7个省市粮食样品,筛选获得1株能够高效降解ZEN的解淀粉芽孢杆菌NS2。采用高效液相色谱法检测降解前后ZEN的含量发现,液态发酵72 h,该菌对5 mg·L^-1 ZEN标准品的降解率高达96.0%,固态发酵72 h,菌株对玉米粉中2.5 mg·L^-1 ZEN标准品的降解率高达88.2%。采用高效液相色谱与四级杆飞行时间质谱联用技术检测该菌处理后的ZEN降解产物,未检测出具有毒性作用的α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)、β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL)等ZEN的类似物。此外,抗菌活性试验与木聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶活性试验显示降解菌NS2还能通过产生具有抗菌作用的次生代谢产物,抑制病原微生物大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的生长。上述结果表明,解淀粉芽孢杆菌NS2可以高效降解ZEN,具有潜在应用前景,为ZEN解毒产品的开发与应用奠定了材料基础。     

拉曼光谱法检测玉米中黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮

为提高激光拉曼光谱技术对不同霉变程度玉米中的黄曲霉毒素B1(AFB1)和玉米赤霉烯酮(ZEN)检测的准确率,本试验以6个不同霉变等级的玉米样品为研究对象进行拉曼光谱检测.首先采用迭代多项式拟合基线校正方法对原始拉曼光谱进行基线校正,去除荧光背景;然后采用多元散射校正(MSC)、标准正态变量变换(SNV)和高斯-洛伦兹混...     

一株高效降解玉米赤霉烯酮的耐酸耐高温枯草芽孢杆菌的研究

为寻求更高效、实用的生物脱毒制剂,提高其应用范围,通过采集酸性、高温的温泉环境样品,筛选获得1株高效降解玉米赤霉烯酮(ZEN)的细菌菌株Y-33,并对该菌株生长和降解特性进行分析。结果表明,菌株Y-33在50℃、pH值5.0条件下孵育36 h,菌液对2 μg·mL^-1 ZEN的降解率高达93.79%,对20 μg·mL^-1 ZEN的降解率也达82.40%。从形态、生理生化特性及16S rDNA序列对菌株Y-33进行分析,初步鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该菌株发酵上清液在28℃条件下对ZEN降解率为62.02%。金属离子Mn²⁺能明显增强菌株Y-33发酵上清液对ZEN的降解能力,降解率达81.17%,而Zn²⁺严重抑制了Y-33发酵上清液对ZEN的降解能力,降解率仅为5.42%。本研究结果为ZEN解毒菌剂的开发与应用奠定了理论基础。     

玉米赤霉烯酮降解酶基因zlhy-6在枯草芽孢杆菌中的表达

玉米赤霉烯酮(ZEN)是具有雌激素作用的次生代谢产物,可以被来源于Gliocladium roseum的内酯水解酶降解为无毒物质。为了实现玉米赤霉烯酮降解酶基因zlhy-6在枯草芽孢杆菌中的表达,获得不含抗生素抗性基因的食品级重组枯草芽孢杆菌,本研究采用一步克隆及重叠延伸PCR的方法构建了单启动子和包含Hpa Ⅱ和P43双启动子的表达质粒,将质粒转化到枯草芽孢杆菌中,获得重组菌株168/pMA5-zlhy-6和168/pMA5-P43-zlhy。然后构建了重组整合载体amy-p43-zlhy,将zlhy-6基因整合到枯草芽孢杆菌168的基因组中。通过Cre/lox系统敲除抗生素抗性基因,获得整合了P43-zlhy表达盒的食品级重组枯草芽孢杆菌BZ-zlhy。将构建的3个重组菌株在37℃、pH值7.5条件下培养36 h,结果显示,双启动子表达载体重组菌株的最高酶活性为2.2 U·mL^-1,是单启动子菌株的1.2倍。双启动子重组菌株表达的降解酶对ZEN(4 μg·mL ^-1,30 min)的降解率为65.1%。重组菌株枯草芽孢杆菌BZ-zlhy表达水平最低(0.4 U·mL^-1)。本研究实现了玉米赤霉烯酮降解酶在枯草芽孢杆菌中表达,同时构建了不含抗生素抗性基因的食品级重组枯草芽孢杆菌,为玉米赤霉烯酮降解酶的工业化生产奠定了基础,也为解决粮食储藏和饲料生产中的ZEN污染提供了思路。     

60Co-γ辐照模式下玉米中赤霉烯酮和品质的变化及对绵羊定时人工授精的影响

为研究经赤霉烯酮(ZEN)自然污染与⁶⁰Co-γ辐照处理后的玉米对绵羊定时人工授精中澳洲白种公羊、湖羊母羊的生殖性能的影响,本试验选取含ZEN玉米样本,分别用0、3、5、8、10 kGy剂量的⁶⁰Co-γ辐照,并测定辐照后玉米主要营养成分变化。然后分别将未污染玉米(Ⅰ对照组)、经10 kGy ⁶⁰Co-γ辐照的污染玉米(试验Ⅱ组)、污染玉米(试验Ⅲ组)饲喂定时人工授精的绵羊,检测澳洲白种公羊的精液质量,测定湖羊母羊的繁殖性能指标。结果表明,未经⁶⁰Co-γ辐照的玉米含ZEN 2 153 μg·kg^-1,在10 kGy ⁶⁰Co-γ辐照剂量下,玉米中ZEN降解率为83.7%;当⁶⁰Co-γ辐照剂量低于10 kGy时,玉米淀粉表面结构无变化,主要营养成分无显著变化。试验Ⅱ组澳洲白种公羊的采精量、精子活力、精子密度与试验Ⅲ组相比显著升高(P<0.05),与Ⅰ对照组相比无显著差异(P>0.05);试验Ⅲ组澳洲白种公羊第30天精子畸形率与试验Ⅱ组、Ⅰ对照组相比均显著升高(P<0.05),显微镜下观察可见双尾精子、双头精子、无尾精子等现象,其中双尾精子头部、尾部不完整;试验Ⅱ组湖羊母羊同期发情率、受胎率、产羔率和羔羊始重等指标与试验Ⅲ组相比显著升高(P<0.05),与Ⅰ对照组无显著差异(P>0.05)。综上,使用经10 kGy ⁶⁰Co-γ辐照后ZEN含量低于2 153 μg·kg^-1的玉米饲喂繁育绵羊,对绵羊定时人工授精无不利影响。本研究结果为⁶⁰Co-γ辐照模式下玉米中赤霉烯酮和品质的变化对绵羊定时人工授精的影响研究提供了理论依据。     

玉米脱镁叶绿酸氧化酶基因ZmPAO表达与叶绿素含量动态变化的关联分析

【目的】分析玉米脱镁叶绿酸氧化酶基因ZmPAO序列多态性,并挖掘该基因与玉米成熟后期穗位叶叶绿素组分含量相关的功能位点,为基于ZmPAO开发功能标记提供结构信息,有助于对玉米成熟后期叶绿素代谢遗传机制的理解。【方法】以141份具有广泛遗传变异的玉米自交系为试验材料组成关联群体,以2个环境7个时间点的叶绿素组分含量为表型数据,利用Tassel 5.0通过混合线性模型 (MLM,mixed linear model) 开展玉米脱镁叶绿酸氧化酶基因 (ZmPAO) 与成熟后不同时期叶绿素组分变化的相关变异位点的关联分析,并对性状的有效关联位点进行单倍型分析。【结果】在玉米生长后期大部分取样时间点的叶绿素组分含量变异较大,叶绿素a普遍低于叶绿素b的含量,最终总叶绿素 (叶绿素a与叶绿素b的和) 有下降趋势。结果共鉴定ZmPAO中19个有效功能位点,其中4个处于外显子区,1个位于UTR区域,其他均位于内含子区域;功能位点对叶绿素组分含量变异的表型解释率在3.89%～16.57%,总表型效应在5.24%～41.78%。来自第6个内含子的位点S3235对于Yang-chlb6有高达16.57%的表型解释率;第7外显子S3675分别解释了Yang-chla1和Yang-chlb1表型变异的12.16%和14.14%。性状显著单倍型中有利位点和关联分析的变异位点偏好相似。【结论】有效功能位点挖掘和性状单倍型分析表明,ZmPAO外显子发生了2个氨基酸变异,均由疏水氨基酸转化为亲水氨基酸,说明该基因可能通过蛋白结构的变异进行调控,但较多关联位点处于非编码区,说明该基因也受转录水平的调控。转录水平受环境影响较大,故导致该基因出现不同地点因播期和生育期的不同找到的关联位点并不一致,但有效变异位点的存在具有普遍性。     

时间分辨同步荧光法同时检测水中硫酸新霉素和磺胺二甲基嘧啶含量

为探究同时检测水中的硫酸新霉素(NEO)和磺胺二甲基嘧啶(SM2)的新方法,根据NEO和SM2在2-巯基乙醇的存在下可与邻苯二甲醛生成具有荧光特性的衍生物,建立时间分辨同步荧光法同时检测水中NEO和SM2的含量。通过研究不同组分的时间分辨同步荧光光谱,确定NEO与邻苯二甲醛衍生物、SM2与邻苯二甲醛衍生物的同步激发特征峰分别为335和291 nm波长处,最佳采集时间分别为1和80 min,最佳同步波长差分别为120和150 nm;采用单因素试验考察邻苯二甲醛溶液、2-巯基乙醇溶液和BR缓冲液的加入量对荧光强度的影响,确定最优的加入量:邻苯二甲醛溶液1.0 mL、2-巯基乙醇溶液0.25 mL、BR缓冲液0.025 mL;据此建立NEO浓度与荧光强度的线性关系,在0.5~14.0 mg·L^-1范围内,得到其线性方程为Y=14.73X+6.14;建立SM2浓度与荧光强度的线性关系,在0.25~9.0 mg·L^-1范围内,得到其线性方程为Y=13.86X+21.49。NEO和SM2的检出限分别为0.5和0.25 mg·L^-1,训练集决定系数(RC2)分别为0.997 5和0.966 9,水中NEO和SM2含量的真实值与预测值之间的预测集决定系数(RP2)分别为0.998 2和0.988 9,预测集均方根误差(RMSEP)分别为0.380 3和0.257 5 mg·L^-1,回收率分别处于101.8%~114.0%和92.3%~115.8%之间,相对标准偏差(RSD)分别为4.0%~8.4%和3.6%~6.6%。本方法线性关系良好,可实现水中NEO和SM2的同时测定。     

免标记型生物传感器比色法快速检测癌胚抗原

为了快速的检测癌胚抗原(CEA),将胶体金与适配体室温孵育后加入CEA以及氯化钠溶液,随着CEA浓度的增加,分析胶体金溶液颜色的变化情况。结果表明,试验中含有2种不同核酸适配体(18个碱基和19个碱基)的胶体金溶液,其颜色都是随着CEA浓度增加均呈梯度变化,颜色梯度为从酒红色到深蓝色。实际样品的检测结果也呈现出良好的颜色梯度变化,CEA检测限为2 ng·mL~(-1),检测范围为0~200 ng·mL~(-1),且检测方法特异性良好。本研究结果为疾病的前期诊断提供了简便快速廉价的检测方案。     

Growth of Moulds and Production of Mycotoxins in Wheat during Drying and Storage

Abstract

Studies were carried out on the growth of mould and the production of mycotoxins in grain during drying and storage. Various amounts of forced ambient air, 800, 600, 400, 200 and 0 m³ (air)/(hour ton), were used to dry wheat, which contained 32% moisture at harvest. Samples for mycological examination and determination of mycotoxins and moisture content were taken weekly. At harvest the mould flora consisted of various field fungi with less than 10% Fusarium spp. An increasing proportion of Aspergillius and Penicillium spp. were recorded in the bins at 0 and 200 m³ (air)/h t. The mycotoxin analysis indicated that the Fusarium spp. were also metabolically active until at least five weeks after the grain was put into the store room. The concentration of deoxynivalenol (DON) reached about 10 mg/kg after three weeks in the bins with no air flow, and about 2 mg/kg in the bins at 200 m³ (air)/h t. The zearalenone concentration also increased considerably, to about 5 mg/kg, in the bins with no air flow. The present results show that drying of grains using forced ambient air may produce good conditions for growth of field fungi as well as storage fungi if the flow of air is too low.     

抗CPV-2a单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

犬细小病毒病是危害养犬业的重要传染病之一,患病犬难以治愈。单克隆抗体治疗此病效果明显,本文介绍了制备抗CPV-2a单克隆抗体的方法。用纯化的犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）2a型分离株免疫新西兰大白兔和Balb/c小鼠制备抗CPV-2a多克隆抗体及单克隆抗体。经亚克隆得到1H9、2B5、2B7和2C7共4株单抗,Western blotting鉴定单抗的免疫反应性;间接ELISA方法检测单抗的特异性。为了快速对犬细小病毒病作出诊断,建立了CPV-2a双抗夹心ELISA方法。兔多抗作为捕获抗体,鼠单抗作为示踪抗体,辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG作为检测系统;捕获抗体和示踪抗体最佳稀释度分别为1：800和1：2000;检测系统最佳稀释度为1：4000。结果表明：所得4株单抗与pET-32a-VP2蛋白发生特异性反应,且与狂犬病毒（RV）、犬温热病毒（CDV）不交叉反应;建立的双抗夹心ELISA方法对病毒的最低检出量为4.375μg/mL,与美国RB试剂盒相比,符合率为95%。单抗制备为犬细小病毒病的治疗奠定了基础;双抗夹心ELISA方法的建立为疑似粪便样本提供了简单、快速和可靠的检测手段。