酸橙柠檬酸合酶基因电子克隆和生物信息学分析

通过电子克隆技术对酸橙柠檬酸合酶(CS)基因进行预测。以甜橙CS序列为探针,基于NCBI中酸橙的EST数据库和CAP3在线软件进行序列拼接,利用生物信息学数据库及相关软件对拼接序列结构和功能进行预测分析。结果表明:酸橙CS基因全长1 535 bp,包含1 416 bp的开放阅读框,编码471个氨基酸,该蛋白为亲水性蛋白。结果可为进一步解释基因的分子功能奠定理论及实验基础。     

草鱼柠檬酸合酶基因SNP筛选及与生长性状的关联分析

根据草鱼(Ctenopharyngodon idella)EST-SNP库中预测的柠檬酸合酶基因的1个Contig序列,设计引物扩增该基因的部分序列,然后采用PCR产物直接测序法筛选SNP突变点。测序的序列经比对后,共筛选到2个在内含子10上的SNP突变点:A-386G和C-499G。随机选择同批繁殖和同塘混养的144尾草鱼对2个SNP位点用Snapshot方法进行检测和分型,并统计基因型频率。A-386G位点的AA基因型占47.10%,AG基因型占38.41%、GG基因型占14.49%;C-499G位点的CC基因型占31.85%,CG基因型占46.67%,GG基因型占21.48%,均属于中度多态位点。利用一般线性模型(GLM)分析2个SNP位点与草鱼6个生长性状(体质量、体长、体高、头长、尾柄长和尾柄高)的相关性,结果显示,A-386G和C-499G位点的不同基因型在这6个生长性状均值有差异,但均不存在显著差异。将这2个SNP不同基因型两两组合,一共组成7种双倍型(去掉频率小于3%的组合D2和D5),GLM相关分析表明5种双倍型在5个生长性状(体质量、体长、体高、尾柄长和尾柄高)上均存在差异,其中在头长上存在显著差异,D6双倍型(A-386G/AG和C-499G/GG)在6个生长性状上均值均最大,属于生长优势双倍型。本研究显示,筛选到的柠檬酸合酶基因上的2个SNP位点具有用于草鱼生长性状的分子辅助育种的潜力。     

香蕉柠檬酸合酶基因MaGCS的克隆及生物信息学分析

采用RACE-PCR的方法首次在香蕉中获得一个柠檬酸合酶基因的cDNA序列。经序列测定和Blastx比对分析表明,该eDNA全长1885bp,编码513个氨基酸残基,具有植物柠檬酸合酶基因的特征结构域,并与其他植物来源的乙醛酸循环体的柠檬酸合酶具有很高的序列相似性,将其命名为MaGCS（Musa glyoxysomal citrate synthase）,并对其进行生物信息学分析,初步预测其理化性质及功能等。     

甘蔗NADP异柠檬酸脱氢酶基因（SoNADP-IDH）的克隆与表达分析

【目的】甘蔗是C₄作物,是中国最重要的糖料作物和最有希望的能源作物。克隆甘蔗NADP异柠檬酸脱氢酶（SoNADP-IDH）基因,为甘蔗的抗病乃至抗逆育种提供候选基因。【方法】采用双向电泳技术找到差异蛋白点,用质谱技术对相应蛋白点进行鉴定,用RT-PCR技术从甘蔗中克隆SoNADP-IDH,用在线软件对获得的氨基酸序列进行分析,并用qRT-PCR技术研究SoNADP-IDH在不同组织和不同逆境胁迫条件下的表达特性。【结果】质谱成功鉴定出差异蛋白点并克隆获得该基因,命名为SoNADP-IDH,GenBank登录号为KF808326。该cDNA全长1 497 bp,含有1个1 239 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码412个氨基酸。生物信息学分析表明,该蛋白为亲水蛋白,不含信号肽,为稳定蛋白,有跨膜区域,为可溶性蛋白,二级结构分析显示,含有α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲,并且α-螺旋和无规则卷曲占据了该蛋白质二级结构的大部分构成。在线软件分析表明该基因含有19个磷酸化位点、4个N-糖基化位点、4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、4个N-肉豆蔻酰化作用位点、6个蛋白激酶C磷酸化位点和1个酪氨酸激酶磷酸化位点。多重序列和系统进化树分析表明,SoNADP-IDH所编码的氨基酸序列与其他植物的异柠檬酸脱氢酶（IDH）蛋白有很高的同源性,与玉米的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析表明,SoNADP-IDH在甘蔗的根、茎、叶中均有表达,在甘蔗体内为组成型表达,在生物胁迫（RSD病菌）和4种非生物胁迫下低温（4℃）、干旱（PEG）、高盐（NaCl）和激素（ABA）均可影响SoNADP-IDH在甘蔗体内的表达,且表达模式不同。在PEG模拟的干旱胁迫下,SoNADP-IDH的表达表现出先上调后下调的表达模式,6 h表达量升到最高,之后又开始持续下降,在处理48 h时表达量降到最低;在4℃处理的低温胁迫下,3 h时,SoNADP-IDH的表达量降到最低,之后随着处理时间的延长,SoNADP-IDH的表达量增加,24 h升到最高点,48 h时,又有稍微下降;在ABA作用下,SoNADP-IDH表现出“抑-扬-抑-扬”的表达模式,在处理3 h时SoNADP-IDH表达量有所降低,6 h时升到最高,在处理24 h时降到最低,48 h又有所上升;在NaCl模拟的高盐胁迫下,SoNADP-IDH表现出“扬-抑-扬”的表达模式,SoNADP-IDH的表达量在处理6 h时升到最高,之后开始急剧下降,24 h时降到最低,之后开始有所上升,48 h时基本与对照持平。【结论】从甘蔗中获得了NADP异柠檬酸脱氢酶（SoNADP-IDH）基因,RSD病菌的侵染及上述4种非生物逆境胁迫均影响到SoNADP-IDH在甘蔗体内的表达水平,该基因可能参与了甘蔗抵抗氧化胁迫的过程。     

蜡梅结瘤素基因CpNOD的克隆与表达分析

根据已构建的蜡梅cDNA文库中得到的片段,通过cDNA末端克隆得到了一个早期结瘤素基因,命名为Cp-NOD(GenBank登录号:JQ622290),该基因cDNA序列全长611个碱基,包含一个71bp 5-UTR区,一个333bp的开放阅读框ORF和一个207bp的3-UTR区,该基因由111个氨基酸组成,其中丙氨酸组分为多,占18.2%,序列比对分析表明,CpNOD具有典型的蛋白质家族ENOD93特征,属于ENOD93家族早期结瘤素蛋白.实时荧光定量PCR表达检测显示,CpNOD在蜡梅根、茎、花器中都有表达,其中以花中瓣表达最高;在花的不同阶段表达结果是从萌动期、花蕾期、盛开期到衰败期,表达量呈正相关,以衰败期表达量最高.转录表达分析结果推测,CpNOD在蜡梅的开花生理和氮元素响应方面起着积极作用.     

杉木纤维素合酶(ClCesA2)基因的克隆与表达分析

为探索杉木木材发育的分子机制,以杉木幼苗嫩叶总RNA为模板,利用反转录获得的cDNA进行聚合酶链式反应(PCR),获得杉木纤维素合酶(ClCesA2)基因。对该基因进行测序以及序列分析表明,该基因开放阅读框全长3 276 bp,共编码1 091个氨基酸,具有锌指结构和8个跨膜区域,及保守的DX……QVLRW结构域。荧光定量PCR结果表明,该基因在杉木的根、茎、叶中相对表达量有明显差异,茎的相对表达量最高,根次之,叶最低。系统进化树分析表明该基因与初生壁合成相关基因聚在一起,推测该基因可能参与杉木细胞初生壁的形成。     

核盘菌EPSP合酶基因在大肠杆菌中的表达

不含有内含子的核盘菌arom基因已经被扩增、测序. 该基因编码五功能的AROM蛋白. 为了大量获得核盘菌AROM蛋白的结构域之一5烯醇丙酮酰莽草酸-3磷酸合酶（EPSPS）,将该菌arom基因编码脱氢奎尼酸合酶（DHQS）和EPSPS两结构域的DNA序列和只编码EPSPS结构域的DNA序列分别克隆入载体pGEX-4t-2和载体pET28b中,构建了4个表达载体pGEX-DE、pGEX-E、pET-DE和pET-E, 并将其转入大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21（DE3）或大肠杆菌JM109中表达. 酶活测定和SDS-PAGE分析结果显示,上述编码序列在大肠杆菌细胞内获得了表达,含有表达载体pGEX-E、pET-DE和pET-E的大肠杆菌BL21（DE3）转化子具有EPSPS的催化活性,说明核盘菌arom基因的这些DNA片段可以被单独表达. 核盘菌EPSPS异源表达系统的 建立为该酶的抑制剂设计奠定了基础.      

棉花P-typeATPases基因的克隆及表达分析

为了探明棉花P-type ATPases基因在植物不同组织和多种逆境条件下的表达情况,利用棉花黄萎病菌的P-type ATPases蛋白序列,在GenBank中搜索棉花EST序列,得到2个同源的棉花EST片段,结合RACE和Genome walking获得了这个基因的完整读码框序列,其开放阅读框长度为3570bp,编码1190个氨基酸,与毛果杨、蓖麻的同源性达86％左右,将其命名为Gbpatp.洋葱表皮亚细胞定位观察结果显示,Gbpatp编码的蛋白分布在细胞膜上.RT-PCR技术检测组织表达特异性分析表明,P-type ATPases在茎和棉絮中的表达量较高,在种子中低水平表达,在叶片和花蕾中表达量极低,说明Gbpatp可能与棉花较成熟的器官茎、棉絮和种子的生长发育密切相关.在逆境胁迫中发现,干旱处理后Gbpatp的表达强烈,并且随处理时间延长表达量逐渐增加;重金属Cu2+处理24h后Gbpatp表达量升高,但48h急剧下降;Gbpatp在低温处理下也有轻微表达.激素诱导后发现,Gbpatp对赤霉素和脱落酸均有响应,随胁迫时间延长其表达量仍能维持在一定水平.     

鸡HOPX基因的克隆及表达分析

前期研究发现,HOPX基因在鸡脂肪组织高表达,为了解该基因在脂肪发育过程中的作用,采用RT-PCR方法,扩增和克隆鸡HOPX基因全长CDS区,并进行序列分析;采用real-time RT-PCR和半定量RT-PCR的方法,开展了HOPX基因的组织表达谱分析、HOPX基因在东北农业大学肉鸡高、低脂双向选择品系脂肪组织发育过程中的表达差异分析以及鸡脂肪细胞分化过程中的表达分析。研究结果显示,鸡HOPX基因的全长CDS区为222 bp,编码73个氨基酸。HOPX基因在鸡的多种组织中表达,其中,在脂肪组织中的表达量最高;在高、低脂系肉鸡的脂肪组织生长发育过程中,HOPX基因的表达均随年龄增长而上升,且高脂系鸡HOPX基因的表达量高于低脂系;在鸡脂肪细胞分化过程中,HOPX基因的表达呈上升趋势。HOPX基因的表达分析结果提示,该基因在鸡脂肪组织生长发育过程中发挥作用。     

小豆抗病相关基因VaPR3的克隆与表达分析

从小豆品种56中克隆出一段包括阅读框架在内的全长为468 bp的cDNA片段,并在GenBank上登录并命名为EU046566,由该cDNA推导的氨基酸序列与菜豆中的PVPR2约有91%的同源性,与PVPR1约有88%的同源性.序列相似性分析表明,该基因在豆科作物中具有较高的同源性,将大豆花叶病毒病接种到小豆叶片后该基因强烈响应并高效表达.RT-PCR结果表明,该基因在地上部的茎、叶、花、荚等器官中也高效表达,而在地下部的根中表达量很小.综合分析显示,该基因可能与植物抗病机制中的防卫素合成有关.     

甜樱桃黄酮醇合酶基因的克隆及其表达分析

为了解黄酮醇合酶在甜樱桃类黄酮生物合成途径中的作用,根据其他物种已知的FLS cDNA保守序列设计简并引物,采用RT-PCR和RACE的技术,从甜樱桃(Prunus avium.L)嫩叶中扩增获得FLS cDNA全长,命名为PaFLS(GenBank登录号:JQ289290).该基因cDNA全长为1 077 bp,开放阅读框为1 014 bp,编码337个氨基酸,分子质量为38 ku,等电点pI为5.58.生物信息学分析表明PaFLS属于依赖2-酮戊二酸的双加氧酶家族(2OG-FeII_Oxy),该基因所编码的氨基酸序列与苹果、梨和草莓的同源性分别为99％、97％和77％.将该基因重组到表达载体pGEX4T-1中进行原核表达,电泳检测到一条约为65 ku的融合蛋白(含27 ku的GST标签).组织时空表达分析表明,PaFLS在甜樱桃的花中表达量最高,这可能和黄酮醇参与花粉萌发及利于授粉有关.     

团头鲂jphs家族基因的克隆及表达分析

以团头鲂为研究对象,扩增获得Junctophilin(Jph)家族4个成员,jph1a、jph1b、jph2和jph3的cDNA编码序列,分别为2 031、2 016、2 358和2361 bp,分别编码676、671、785和786 aa。团头鲂jphs均由5个外显子和4个内含子组成,与大多数物种的JPHs基因结构相似;结构域预测显示出8个MORN和1个TM结构域,且蛋白多序列比对分析显示Jphs在进化上非常保守。基于qRT-PCR(quantitative real-time PCR)分析显示,这4个基因呈现出组织特异性表达,其中jph1a、jph1b和jph2主要在肌肉和心脏中表达,而jph3主要表达于心脏、血液和大脑。在早期发育过程中,jph1a、jph1b、jph2和jph3的mRNA表达模式类似,分别在原肠胚期、心跳期和25 dph(days post hatching)达到高峰。综上研究结果表明,鱼类jphs基因在心脏和肌肉等组织中发挥重要作用,并且其功能可能不同于哺乳动物。     

甜瓜果实醇酰基转移酶基因的克隆及表达分析

根据在GenBank中登录的烟草、番茄等的醇酰基转移酶基因的保守序列设计引物,利用RT—PCR和RACE（Rapid Ampllfieation of cDNA Ends,cDNA末端快速扩增）技术从甜瓜白交系M01—3花后25d的果实总RNA中扩增到甜瓜醇酰基转移酶基因全长cDNA。该基因全长为1429bp,开放读码框为1383bp,编码461个氨基酸,GenBank中登录号为EU431334。利用荧光定量PCR方法进行了该基因在果实发育过程中的表达特性分析,结果表明该基因在花后15d果实中的表达量最低,成熟果实中表达量最高。     

小峰熊蜂可溶型海藻糖酶基因的克隆及表达分析

【目的】克隆小峰熊蜂（Bombus hypocrita）可溶型海藻糖酶基因（soluble trehalase,Tre-1）全长cDNA序列,预测该基因及其编码蛋白的理化性质,明确该基因在小峰熊蜂不同组织及不同发育时期的表达特性,为研究该基因在小峰熊蜂生长发育中的生物学功能奠定基础。【方法】根据地熊蜂（B. terrestris）和B. impatiens可溶型海藻糖酶基因Tre-1编码蛋白的保守区序列,利用Primer Premier 5.0设计简并引物扩增得到小峰熊蜂保守区片段;随后根据该片段设计基因特异性引物,用RACE方法获得5'端和3'端片段。在此基础上,根据RACE扩增所得片段和保守序列,预测开放阅读框（ORF）序列,分别在起始密码子近5'端和终止密码子的近3'端设计ORF区特异性引物扩增得到ORF,最后采用BioEdit软件比对、拼接获得小峰熊蜂Tre-1 cDNA全长序列。运用ExPASy、SignalP 4.1、NetOGlyc 1.0 sever、ClustalW和MEGA 5.0等软件对该基因进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR技术,采用2^-ΔΔCt方法检测不同组织及不同发育时期可溶型海藻糖酶基因的相对表达量。【结果】克隆所得基因cDNA全长为3 129 bp,命名为BhTre-1（GenBank登录号：KJ025078）,其中包含5'端441 bp非编码区和3'端945 bp非编码区,ORF为1 743 bp,共编码580个氨基酸。其编码的蛋白预测分子质量为67.16 kD,等电点为5.95;有1个信号肽结构（1-21位）,1个甘氨酸富集区（GGGGEY）,2个特色“标签序列”（PGGRFKEFYYWDSY和QWDFPNAWPP）,6个Asn-Xaa-Ser/Thr（N-X-S/T）序列,无跨膜区。序列分析发现BhTre-1氨基酸序列与地熊蜂BtTre-1和B. impatiens BiTre-1的一致性很高,分别为99%和98%,与西方蜜蜂（Apis mellifera）和云南小蜜蜂（A. florea）的Tre-1一致性也达到78%;系统发育分析也表明BhTre-1与BtTre-1、BiTre-1的亲缘关系最近,与AmTre-1、AfTre-1之间的亲缘关系次之。基因定量分析结果显示BhTre-1在成虫被检测的各组织中均有表达,在中肠的表达量最高,其次是马氏管,其他各组织表达量较低。成年工蜂的BhTre-1表达量高于幼虫和蛹,工蜂出房后随着龄期的增加表达量呈现先升高后降低的规律,在第15天表达量最高。【结论】克隆得到了BhTre-1全长cDNA序列,其分子生物学特性与其他昆虫Tre-1相似,该基因在小峰熊蜂中肠表达量最高,此外,幼虫和蛹的表达量低于成年工蜂,工蜂出房后表达量呈现先升高后降低的趋势,为进一步研究该基因在小峰熊蜂体内的生物学功能奠定了基础。     

菊花去饱和酶CmSAD基因的克隆与表达分析

以秋菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)抗寒品种‘星光灿烂’为材料,利用RT-PCR和RACE方法从叶片中克隆△9硬脂酰-ACP去饱和酶(Stearoyl-ACP desaturase,SAD)基因,命名为CmSAD,Gen Bank登录号为KC529335。该基因cDNA全长1 203 bp,编码401个氨基酸,相对分子质量为45.57 k D,等电点为6.48,编码的氨基酸序列与新疆雪莲同源性最高(80.29%)。通过对该蛋白进行生物信息学分析得出其没有跨膜结构,主要存在于叶绿体基质中,N端含有一段包含60个氨基酸的叶绿体转运肽。通过实时荧光定量PCR研究低温胁迫下叶片和根系中CmSAD基因的表达量变化,该基因在叶片和根系中均有表达。根系中CmSAD基因的表达量随着温度的降低而降低,16℃时表达量最高;叶片中CmSAD表达量随着温度的降低先升高再降低,5℃时最高。随着温度的降低,菊花叶片和根系中CmSAD基因的表达情况表现出一定的差异。CmSAD基因的表达变化与温度有关,为低温胁迫下菊花脂肪酸代谢的分子机理研究提供了基础。     

赤霞珠白藜芦醇合酶基因的克隆及酿酒酵母表达载体的构建

为克隆酿酒葡萄品种赤霞珠的白藜芦醇合酶基因并构建其酿酒酵母表达载体,利用改良CTAB法提取赤霞珠葡萄叶片组织中的DNA,根据文献报道的序列(Genbank登录号AF128861)设计引物扩增得到白藜芦醇合酶基因全长序列。将全长序列克隆至克隆载体后,通过重叠延伸PCR扩增到RS基因cDNA片段。然后分别将RS基因全序列和cDNA片段连接至真核表达载体pGBKT7,经克隆和测序分析后,构建两种真核表达载体pGBKT7/RSDNA和pGBKT7/RScDNA,用SD-trp选择培养基筛选出阳性克隆,菌落PCR验证得到阳性转化子。     

甜瓜果实八氢番茄红素脱氢酶基因（CmPDS）的克隆与表达

以甜瓜自交系‘M01-3’果实cDNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术,克隆了甜瓜果实八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因cDNA全长序列,命名为CmPDS（基因注册号：KC507802）。序列分析表明,该基因有开放阅读框1731 bp,编码576个氨基酸,与其他植物PDS氨基酸序列具有较高的同源性,尤其与黄瓜、南瓜、苦瓜PDS氨基酸序列高达92.6%~87.8%。荧光定量分析表明,该基因在甜瓜不同器官中均有表达,在叶片和授粉后25 d的果实中表达量较高,在根中表达量最低;随果实发育成熟,该基因表达量呈现先升高后降低趋势。     

蓝莓鲨烯合酶基因的克隆与表达分析

鲨烯合酶基因(SQS)在植物三萜类化合物合成途径中起着重要作用,是上游代谢通路中的关键基因。本研究采用RT-PCR技术从‘喜来’蓝莓根中克隆得到VcSQS基因,序列全长1 489 bp,序列分析结果表明,其含有1 242 bp的开放阅读框,编码413个氨基酸。氨基酸同源序列分析表明,蓝莓与其它物种SQS蛋白氨基酸序列相似性很高,与山茶科的茶相似性最高,达90.58%,与葡萄相似性达87.92%。荧光定量试验结果表明,SQS基因在蓝莓叶中的表达量最高,芽中的最低。