观赏百合病毒病原形态及内含体研究

通过带病组织汁液和带病组织超薄切片负染电镜技术对侵染观赏百合的病毒粒子和内含体进行观察,证明在表现不同症状的5个品种中存在球状、短线状、长线状、短杆状4种病毒粒子和晶体状、风轮状、束状、卷筒状、正六边形5种内含体,通过ELISA检测及病毒粒子形态、大小及内含体形态分析,确定球状病毒粒子(直径29.5 nm)为黄瓜花叶病毒,短线状病毒粒子(593.29～639.97 nm×12.15～14.12 nm)为百合无症病毒,长线状病毒粒子(757.58～846.25 nm×12.12～12.75 nm)为马铃薯Y病毒,短杆状病毒粒子(500～807.69 nm×153.85～192.31 nm)为烟草脆裂病毒。     

酶联免疫吸附法(ELISA)检测豆类种传病毒的研究

本文介绍使用微量板酶联免疫吸附法(ELISA)检测TMV(杆状)、SMV(线状)、CMV(球状)、AMV(杆菌状多粒体)四种不同形态、不同分类组群的病毒。此法非常灵敏,能够检测病毒提纯液的最低浓度为7.6～10亳微克/毫升,也能检出稀释1563～10240倍病叶粗澄清液中的病毒,灵敏度比琼脂双扩散法高1000倍以上。 ELISA可以直接检出单粒种子中的病毒,而且可以分别检出单粒种子不同部位如大豆的种皮、种胚、胚乳及胚根中的病毒存在。该法适用于检测大量标样,对植物检疫来说,这是一个很好的方法。     

水稻东格鲁病杆状病毒在我国的发生

 经来自IRRI的水稻东格鲁球状及杆状病毒抗血清的检测及电镜观察等表明:我国水稻东格鲁病的病原不仅有球状病毒,且有杆状病毒。球状病毒直径大小约30nm,杆状病毒的大小约150-350×25nm。病株叶片叶肉细胞以至维管束鞘细胞有淀粉累积,部分韧皮部细胞变形或坏死。有杆状病毒存在的病株或同时也有球状病毒存在的病株较单独球状病毒存在的病株黄化严重,且易枯死。至于该杆状病毒的详细分布范围尚待进一步研究。     

从荷兰进口植物中检出南芥菜花叶病毒

南芥菜花叶病毒Arabis mosaic virus(ArMV)是豇豆花叶病毒科Comoviridae线虫传多面体病毒属Nepovirus成员,主要分布在荷兰、比利时等欧洲国家和美国、加拿大、澳大利亚、新西兰、南非、日本,我国尚未有报道。该病毒通常采用血清学和鉴别寄主方法进行检测,但该方法较易出现假阳性,存在检测时间长,准确性和灵敏度较低等问题。近几年发展起来的基因芯片技术已经广泛用于人类病毒如乙肝病毒、人类免疫缺陷病毒、严重急性呼吸系统综合征病毒[1～3]等医学诊断和动物病毒如口蹄疫、禽流感[4]的检测和检疫,而应用基因芯片检测植物病毒实例的报道…     

胶体金免疫电镜技术检测和鉴定病汁液中不同形态的植物病毒

 本文报道胶体金免疫电镜技术的建立:铜网捕获病毒后,用其稀释约200倍的同源抗血清修饰处理3~5分钟,羊抗兔IgG-金复合物标记3~5分钟,经磷钨酸负染,电镜下可见病毒粒子周围金颗粒特异性吸附,而背景上非特异性吸附很少。用此技术成功地快速检测和鉴定了病汁液中线状病毒(大麦黄花叶病毒,大麦温和花叶病毒,小麦梭条斑花叶病毒,芜菁花叶病连和马铃薯Y病毒)、棒状病毒(烟草花叶病毒、长叶车前草花叶病毒和土传小麦花叶病毒)以及球状病毒(水稻矮缩病毒、黄瓜花叶病毒和大麦黄矮病毒)。用0.5M PBSpH7.0制备病汁液,可大幅度提高同源抗血清对黄瓜花叶病毒的捕获能力。     

进境荷兰郁金香种苗中南芥菜花叶病毒的鉴定

为了防止南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)传入我国,采用血清学、分子生物学、电镜观察及生物学接种等方法对从荷兰进口的郁金香种苗进行了ArMV检测。结果表明:ArMV血清学反应为强阳性;RT-PCR反应扩增出370bp的特异性目标条带;RT-PCR产物与已报道的3个ArMV部分外壳蛋白基因的核苷酸序列同源性为91.00%～93.24%,氨基酸序列同源性为99%～100%;免疫电镜观察到叶片病汁液中含有直径约30nm的球状病毒粒体;该病毒在黄花烟、白肋烟、矮牵牛和昆诺藜等鉴别寄主上引起坏死和褪绿等典型症状,经DAS-ELISA检测,这些接种寄主均呈ArMV血清学阳性反应。故将该病毒鉴定为南芥菜花叶病毒。     

用单克隆抗体结合酶联免疫吸附试验检测棉铃虫幼虫体内的核多角体病毒

在常规ＥＬＩＳＡ间接法的基础上，应用单克隆抗体检测感染棉铃虫核型多角体病毒的棉铃虫幼虫体内病毒粒子。３龄幼虫饲喂表层涂有ＨａＮＰＶ人工饲料后９小时，即可在幼虫抽提液中检出病毒粒子抗原，而典型病虫显症需５～６天后才出现。因此本法是一种灵敏、快速、特异性强的检测昆虫杆状病毒的方法。利用单克隆抗体结合ＥＬＩＳＡ试验分别检测来自江苏和山东不同地区棉田自然死亡的棉铃虫幼虫，表明在江苏和山东不同棉区均可检测到ＨａＮＰＶ病毒粒子，但地区间棉铃虫核型多角体病毒检出频率有显著差异     

一种快速简便检测马铃薯病毒的方法——病毒细菌协同凝集法(VBA)的研究

在国内、外首次选用金黄色葡萄球菌(Staphylococc aureus)的No.180菌株用于病毒细菌协同凝集试验(Virobacterial agglutination test简称VBA)检测了来自马铃薯的4种不同形态粒子的病毒:马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯丫病毒(PVY)、烟草花叶病毒(TMV)和马铃薯卷叶病毒(PLRV),其灵敏度达2.7～6.1ng/ml,检出病汁液的最大稀释度达10~4～10~5(PLRV1:500),较国内、外采用的Cown I菌株的灵敏度提高5～10倍。与血清学方法相比,VBA在2～3分种内就可获得结果,无假阳性反应,其灵敏度显著高于间接酶联法和免疫电镜,而接近于A蛋白酶联法。经抗血清致敏的菌体在4℃下保存4个月,对VBA检测的灵敏度没有影响。用VBA对采自田间的93个马铃薯病样进行检测,它们大多受2～3种病毒(PVX、PVY及PLRV)的复合侵染;和用间接酶联法及鉴别寄主检测的结果趋向一致。室内和田间试验均表明VBA灵敏度高、特异性强、快速简便和经济,尤其适合在基层单位中推广应用。     

香石竹斑驳病毒的鉴定和RT-PCR检测

从表现为叶斑驳、花碎色症状的香石竹病株上获得一病毒分离物 ,电镜负染观察到直径为28～33nm的球状粒子。病毒提取液经紫外光测定呈典型核蛋白吸收曲线 ,OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.70;血清学反应与CarMV抗血清出现明显的沉淀线。通过以上实验结果 ,确定该病毒分离物为香石竹斑驳病毒(carnation mottle virus ,CarMV)。根据该病毒的RNA序列设计引物 ,对病健材料进行了RT-PCR检测 ,结果从感病材料中扩增出大约600bp的特异片段 ,而健康植物无此扩增带。将PCR产物连接 pGEM-T-easy载体 ,转化大肠杆菌JM109,得到了含目的片段的重组子 ,经双脱氧序列分析 ,与Guilley报道的序列对应部分的核苷酸序列基本一致 (其同源性达96% ) ,最低检出病毒核酸含量为5ng ,表明应用RT-PCR检测香石竹斑驳病毒是可行的     

病毒的纯化

病毒最好从系统感染的寄主中提取,因为病毒在这些植株中的浓度比在那些受局部损伤的寄主中一般要高。用碾碎组织法或压汁法提取病毒常比用强烈的机械匀浆法为好,由于用后一种方法会使长形病毒粒体断裂。最好用冷缓冲液作为提取介质。缓冲液的类型及其 pH 值在每次提取过程中各不相     

唐菖蒲病毒病

唐菖蒲 Gladiolus hybridus Hort 是鸢尾科唐菖蒲属的花卉植物。其花期长、花朵大、花色多而鲜艳,尤其适于做切花,因而具有很高的观赏价值。但由于唐菖蒲病毒病的发生,使唐菖蒲的产量和质量受到很大影响。在我国,近年来花卉事业蓬勃发展,与国外的花卉交流日益频繁,传入唐菖蒲病毒的机率亦随之增加。因此,对唐菖蒲病毒的检疫和防治应当予以重视。     

侵染唐菖蒲和百合3种病毒的多重RT-PCR检测方法

本文针对侵染百合和唐菖蒲的南芥菜花叶病毒、百合无症病毒和菜豆黄花叶病毒,建立了同时检测3种病毒的多重RT-PCR检测方法.该方法根据上述3种病毒保守的衣壳蛋白基因序列,设计特异性引物,优化了反应条件.通过对9种不同寄主和6种病毒的检测,验证该检测方法具有很高的特异性、稳定性,其灵敏度为植物总RNA稀释101～102倍.特别是,该方法缩短了检测周期,适合于植物病毒快速检测工作的需要.     

进境欧洲水仙种球上病毒的检测与鉴定

为明确2013年福建口岸截获的进境欧洲水仙种球上携带的病毒种类,应用血清学、电镜观察和分子生物学检测方法对其可能携带的病毒进行了检测与鉴定。结果显示,水仙花叶病毒(Narcissus mosaic virus,NMV)、水仙黄条病毒(Narcissus yellow stripe virus,NYSV)、水仙潜隐病毒(Narcissus latent virus,NLV)、水仙迟季黄化病毒(Narcissus late season yellows virus,NLSYV)和南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)5种病毒为阳性,其中NLSYV、ArMV为强阳性;NMV、NYSV、NLV和NLSYV为阳性的样品中含有大小约500~750 nm×12 nm的线状病毒粒体,ArMV为阳性的样品中含有直径约30 nm的球状病毒粒体;经序列测定和分析,扩增到的目的片段大小与各病毒预期扩增片段大小一致,并与已报道的各病毒序列高度同源;病毒复合侵染检测结果显示,该批水仙种球39.7%的样品存在2种以上病毒复合侵染。研究表明,该批进境欧洲水仙种球上携带有NMV、NYSV、NLV、NLSYV和ArMV,且复合侵染现象明显。     

抗病毒植物基因工程策略的研究进展

病毒病害一直是果树生产上的一大问题 ,世界上先后报道了 1 0 0多种果树病毒 (包括类病毒 ) ,其中多数病毒在果树上造成极大的危害 ,导致产量和品质显著下降。控制病毒病害在果树生产上具有十分重要的意义。人类在同病毒病害斗争的历史过程中 ,积累了不少经验 ,其中最有效的就是抗病育种。常规的杂交育种方法在下列方面有其局限性 :耗时长 ,异源配合率低 ,低劣性状需多次回交去除费时费工。随着生物技术的发展使常规育种方法存在的问题迎刃而解。尤其是基因工程技术 ,可以避免有性过程克服任何杂交障碍 ,使基因在生物间相互转移成为可能。基…     

木尔坦棉花曲叶病毒RPA快速检测方法的建立

木尔坦棉花曲叶病毒Cotton leaf curl Multan virus(CLCuMuV)引起的病害是世界棉花生产上的毁灭性灾害,也是我国进境植物检疫性有害生物之一。因此,建立快速检测技术对CLCuMuV的检疫和防控具有重要意义。本研究根据CLCuMuV外壳蛋白(CP)基因序列设计引物,建立了该病毒的重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)检测方法,并评价了该方法的灵敏度和特异性,进一步测定了对田间疑似病样的检测准确性。结果表明,建立的RPA检测方法仅能从感染CLCuMuV的样品中扩增出目的条带,而感染同属的其他5种病毒的样品中未扩增出目的条带。该方法检测灵敏度是常规PCR的10倍,且对田间疑似病样的检出结果与PCR试验结果一致。因此,本研究所建立的CLCuMuV RPA快速检测方法具有特异、灵敏、准确、操作简便、无需特殊设备等优点,这些为CLCuMuV的快速检测提供了一种新技术。     

大白菜不同品种苗期的单宁含量与品种抵抗孤丁病毒能力的相关性初探

测定大白菜不同品种对孤丁病毒的抵抗能力,一般使用病毒在苗期接种,经过全部生长发育以后,确定其病情指数,从而确定其抗病程度。这个过程是相当长的。因此能在幼苗期找到一个相关因子,从而能在白菜幼苗期基本上确定其成株期抗病的能力,是有实际意义的。过去两年来,我们曾试探一些品种间细胞生理现象的差异,以求获得这样一种因子,结果大多数都不稳定。在这些试探的细     

检测植物病毒的几种免疫电镜法

免疫电镜一般是指用电镜检测特异抗原抗体反映的技术,可以大致分为二类:一种是用来检测固定或切片材料中的免疫反应;另一种用来检测在特殊材料特别是病毒制剂中的免疫反应。对于后者我们先简单回顾一下早期的几种方法,然后详述二种快速的改进方法。     

ELISA检测植物病毒过程中减少非特异反应的有效方法—酶联板处理

酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种快速、准确、经济、简便的免疫学检测手段,并具有作大规模检测和灵敏度高的优点。但用于植物病毒粗汁液检测,往往存在着病健样品的吸收值之比(P/N)太低,阴阳性反应难以判别的问题。酶联板的处理能消除或大大减缓此问題。在本实验中,我们用氢氧化钠/乙醇液处理酶联板,效果十分显著。在对不同组10种植物病毒粗汁液的检测中,使用处理板并设未处理板作对照,结果前者无一例外的大大提高了病毒特异性吸收值及P/N值,从而使ELISA检测植物病毒粗汁液的特异性吸收值提高0.8～5倍,灵敏度提高10～1000倍。