鸭胚骨骼肌成肌细胞中MyoD1和Myf5基因的表达与分析

以高邮鸭和金定鸭为研究对象,采用实时荧光定量PCR方法测定生肌调节因子MyoD1和Myf5基因在不同发育阶段鸭胚（13、15、17、19、21和23胚龄）骨骼肌成肌细胞中的表达水平,分析MyoD1和尬庐基因在鸭胚胎期骨骼肌成肌细胞中的表达模式和差异．结果表明,Myf5和MyoD1基因在胸腿肌成肌细胞中呈现不同的表达规律：胸肌成肌细胞中,Myf5基因的表达呈“低→高→低→较高”的趋势,类似反“-”形;MyoD1基因的表达呈“低-高-低”的趋势,在金定鸭17胚龄时达到高峰后迅速下降（P〈0．01）,并维持在低水平,类似“∧”形,而在高邮鸭17胚龄时达到高峰后维持高水平至19胚龄（P〉0．05）,再下降并维持在低水平（P〈0．05）,类似“∩”形．腿肌成肌细胞中,岣筘基因的表达呈“低-高-低”的趋势,类似“∧”形;MyoD1基因的表达呈“较高→低→高→低”的趋势,类似“－”形．结果提示：Myf5和MyoD1基因在骨骼肌成肌细胞中的表达具有时间和品种依赖性;两基因在两品种鸭胸腿肌中均在17胚龄时达到高峰,表明17胚龄可能是成肌细胞分化和增殖的一个重要时期．     

MYCN基因在鸡成肌细胞和胸肌组织表达及生长发育中变化

MYCN是癌基因中的核蛋白类调控基因.在前期采用Illumina60kSNP芯片开展的胴体性状的全基因组关联(GWAS)研究中发现,MYCN基因与胸肌、腿肌重达显著相关.为进一步验证该基因在肌肉发育调控中的作用,采用Q-PCR技术,系统检测成肌细胞增殖分化期、胚胎发育后期和出生至98日龄肌肉组织中MYCN基因的mRNA表达量,并比较12个组织的特异性表达差异.结果表明,在鸡成肌细胞增殖、分化过程中,MYCN基因mRNA表达量在分化期显著高于增殖期(P＜0.01),并随诱导分化时间的延长表达量上升;在胚胎期14～21胚龄,mRNA表达量随胚龄的延长而持续上升,18至21胚龄变化显著(P＜0.01);在出生至98日龄生产发育阶段,在0～14日龄的表达量呈急剧下降趋势(P＜0.01),14日龄后变化不显著(P＜0.05).通过12个组织特异性表达分析,MYCN在胸肌、腿肌中的表达量仅次于大脑和下丘脑中枢神经系统中的表达水平.综合各发育阶段的结果表明,MYCN基因参与了肌肉组织发育的调控,其功能主要作用在鸡胚胎发育后期至出生后14日龄之内.该研究为阐明鸡肌肉生长发育的遗传机制提供了理论依据.     

绵羊IGF-Ⅰ和IGF-Ⅰ R基因特征分析及其在肌肉组织中的表达差异

为了比较IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因在绵羊肌肉中的表达差异,根据GenBank公布的绵羊IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因mRNA序列设计特异性引物,采用实时定量PCR方法检测其在甘肃‘高山细毛羊’及其与南非肉用‘美利奴’杂交F1代(南甘F1代)羔羊肌肉组织中的表达量.利用生物信息学软件分析了绵羊IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因结构,并构建系统进化树,探讨了其生物学功能.结果表明:南甘F1代羔羊肌肉组织中IGF-Ⅰ基因的表达量显著高于‘甘肃高山细毛羊’(P0.05),而IGF-ⅠR基因的表达量在南甘F1代羔羊和‘甘肃高山细毛羊’肌肉组织中没有显著变化(P0.05).绵羊IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因分别含有465bp和4 518bp的完整开放阅读框,编码154个和1 505个氨基酸;其蛋白质分子量分别为17 011.71U和169 267.26U,等电点分别为9.36和6.70;IGF-Ⅰ基因信号肽切割点分别位于49~50位氨基酸之间,而IGF-ⅠR基因不含信号肽;IGF-Ⅰ基因编码产物的二级结构主要以无规则卷曲和α-螺旋为主,位于细胞核的可能性最高(62.5%);IGF-ⅠR基因编码产物的二级结构主要以无规则卷曲为主,位于细胞质的可能性最高(34.8%);IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因分别作为激素和信号传感器参与机体生物学过程.     

鹅肌肉IGF-Ⅰ基因mRNA的表达

以吉林白鹅肉用品系、蛋用品系和霍尔多巴吉白鹅为供试材料,采用实时定量PCR法对胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)基因在鹅1、30、60、90日龄时胸肌、腿肌中mRNA的表达水平进行测定分析。结果表明:鹅胸肌、腿肌IGF-ⅠmRNA的表达量随着日龄的增加呈先升后降的趋势,胸肌中IGF-ⅠmRNA的表达峰值在吉林白鹅肉用品系60日龄、蛋用品系30日龄、霍尔多巴吉白鹅60日龄出现,其中霍尔多巴吉白鹅30日龄与1日龄差异不显著(P>0.05);腿肌IGF-ⅠmRNA的表达量均在30日龄达到最大,随后下降。在胸肌组织中,吉林白鹅肉用品系IGF-ⅠmRNA的表达量在1、60和90日龄时均高于蛋用品系,霍尔多巴吉白鹅IGF-ⅠmRNA表达量在1日龄和90日龄时高于吉林白鹅蛋用品系(P<0.05),30日龄品种间差异不显著(P>0.05)。在腿肌组织中,吉林白鹅肉用品系IGF-ⅠmRNA在30和60日龄的表达量均高于霍尔多巴吉白鹅,在60和90日龄高于吉林白鹅蛋用品系(P<0.05);霍尔多巴吉白鹅在30日龄时IGF-ⅠmRNA表达量低于蛋用品系(P<0.05),90日龄时高于吉林白鹅两个品系(P<0.05),1日龄时表达水平无差异(P>0.05)。     

鸭胚胎发育早期MyoD和MSTN的表达变化规律

文章旨在对肌肉生长具有反向调控的两个关键基因Myo D和MSTN在鸭胚胎早期的表达模式进行探讨。采用实时荧光定量PCR方法对金定鸭8、8.5、9、9.5、10、11、12日胚龄脑部、肝脏以及腓肠肌中Myo D和MSTN m RNA表达量进行定量,并分别对两个基因的表达水平在组织之间、胚龄之间的变化规律进行分析,并对两个基因之间的相关性进行研究。结果表明,在脑组织、肝脏、腓肠肌中,Myo D和MSTN基因表达水平均在腓肠肌中最高。Myo D和MSTN基因9.5胚龄时均在脑组织中有一个表达小高峰;在8胚龄到12胚龄的发育中,腓肠肌中的Myo D、肝脏中的MSTN表达水平均无显著变化,且在8~12胚龄Myo D和MSTN基因均是在腓肠肌中表达量最高。脑组织和腓肠肌中的两基因表达量均呈极显著的正相关。结果显示,金定鸭胚胎期脑组织、肝脏、腓肠肌均能表达Myo D和MSTN基因,且腓肠肌中表达量均高于脑组织和肝脏,两基因对3个组织生长发育的协调关系可用Myo D/MSTN表达量比值表示。     

蛋内注射T3对鸭胚骨骼肌发育和MSTN mRNA表达的影响

为探讨生长因子三碘甲状腺原氨酸(Triiodothyronine,T3)对鸭胚骨骼肌生长发育和肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)mRNA表达的影响,在入孵前的鸭种蛋蛋清内分别注射100μl的生理盐水溶液(对照组)和含0.25μg T3的生理盐水溶液(注射组),检测13、17、21、25、27胚龄鸭胸肌和腿肌发育及骨骼肌MSTN mRNA的表达情况。结果显示,T3处理极显著提高27胚龄鸭胚的胸肌质量,但对腿肌质量影响不显著;21胚龄注射组胸肌MSTN mRNA表达显著高于对照组,27胚龄则显著低于对照组;注射组腿肌MSTN mRNA表达仅在25胚龄显著增加。相关性分析结果显示,两组骨骼肌质量与MSTN mRNA表达呈不同程度的线性相关。表明蛋内注射T3能增加鸭胚胸肌质量,并改变MSTN mRNA表达量,MSTN mRNA的差异表达可能在鸭胚胸肌发育过程中具有重要的作用。     

北京鸭IGF-1cDNA部分序列的克隆及其在胸肌组织表达的发育性变化

为探讨IGF-1基因对北京鸭胸肌发育的影响,试验克隆了北京鸭IGF-1 cDNA的部分序列,分析了其核苷酸及编码的氨基酸序列与其他物种的同源性,并检测了IGF-1 mRNA在不同日龄北京鸭胸肌中表达的发育性变化。结果表明,克隆的鸭IGF-1 cDNA部分序列长507 bp,编码168个氨基酸,核苷酸序列与鸡、家鸭、鹌鹑、火鸡、鸵鸟、人和猪的同源性分别为98％,99％,97％,98％,96％,84％和82％,编码的氨基酸序列与家鸭、鸡、火鸡、鹌鹑、人、挪威鼠和猪的同源性分别为99％,98％,97％,97％,84％,79％和84％。表明北京鸭与家鸭的亲缘关系最近,与鸡、鹌鹁、火鸡、鸵鸟也有较近的亲缘关系;北京鸭胸肌中IGF-1 mRNA表达丰度在7,14,21 日龄间和28, 35,42日龄间的差异均不显著(P>0．05),但28,35,42 日龄显著高于7,14,21日龄(P<0．05),说明在北京鸭胸肌发育较快的时期,IGF-1 mRNA表达量也较高,IGF-1 mRNA的表达量与胸肌的发育呈正相关。     

不同杂交组合鹅胸肌和腿肌GHR、MSTN基因mRNA表达量与屠宰性状间的相关分析

为研究不同杂交组合卡洛斯鹅在不同时期胸肌和腿肌GHR和MSTN基因mRNA的变化规律及与肉用性能的关系,对不同杂交组合卡洛斯鹅于10周时测定其屠宰性能,同时采用实时荧光定量PCR方法检测不同杂交组合鹅0,4,10周胸肌和腿肌中GHR和MSTN基因mRNA的表达水平。结果表明:5组试验鹅腿肌和胸肌中GHR基因的相对表达量均在4周龄达到最大值,且胸肌中的相对表达量高于腿肌,MSTN基因在腿肌中的相对表达量与GHR基因相似;GHR和MSTN基因的相对表达量存在极显著负相关(P0.01);GHR基因的相对表达量与宰前活重、屠体重、半净膛重、全净膛重之间均存在极显著正相关(P0.01),与腿肌重呈显著正相关(0.01P0.05);MSTN基因的相对表达量与宰前活重、屠体重、半净膛重、全净膛重、腿肌重均存在极显著负相关(P0.01),与胸肌重间呈显著负相关(0.01P0.05)。GHR和MSTN基因在不同杂交组合鹅的不同生长阶段和不同肌肉组织之间表达量存在差异,与鹅早期肉用性状的表达水平显著相关,可作为鹅早期肉用性状的候选基因。     

不同品种鸭胚胎期骨骼肌成肌细胞GHR和IGF 1 mRNA表达差异分析

为探讨生长激素受体（growth hormone receptor,GHR）和胰岛素样生长因子 1（Insulin like growth factor 1,IGF 1）在不同品种鸭胚胎期骨骼肌成肌细胞中的表达差异。选择生长速度不同的金定鸭和高邮鸭为试验动物,采用实时荧光定量PCR方法检测鸭13,15,17,19,21和23胚龄时胸肌和腿肌成肌细胞GHR,IGF 1 mRNA的表达情况,并进行了品种间比较。结果发现：13胚龄时,高邮鸭胸肌和腿肌成肌细胞IGF 1的表达均显著高于金定鸭（P<0.05）;17胚龄是两个品种鸭GHR和IGF 1共同的表达高峰期;17胚龄之后,鸭胸肌和腿肌成肌细胞GHR和IGF 1表达均显著降低。在19,21胚龄时,高邮鸭胸肌成肌细胞2个基因的表达均显著高于金定鸭（P<0.05）,而腿肌成肌细胞GHR和IGF 1表达在品种间无显著差异（P>0.05）。鸭胚胸肌和腿肌成肌细胞GHR和IGF 1表达呈现极显著的正线性相关（P<0.01）。提示：GHR和IGF 1的表达谱及各自在品种间的变化规律基本一致;鸭胚骨骼肌成肌细胞GHR和IGF 1 mRNA表达有组织特异性,二者之间可能存在正调控的作用机制。     

猪MSTN基因生物信息学分析

[目的]对猪MSTN基因进行生物信息学分析。[方法]以从GenBank中检索到的猪、大鼠、小鼠、狗、绵羊、山羊、牛、黑猩猩、人、马、鸡和斑马鱼的MSTN基因CDS序列为材料,将该12个物种的MSTN蛋白序列调入DNAStar软件的Megalign程序,进行系统进化分析;并对猪MSTN基因的基本信息、内切酶图谱、编码蛋白二级结构、信号肽、跨膜结构以及蛋白质亚细胞定位进行分析。[结果]猪MSTN基因与大鼠、小鼠、狗、绵羊、山羊、牛、黑猩猩、人、马亲缘关系很近;该基因包含多个酶切位点;其编码的蛋白是一个疏水性不稳定蛋白,分子量为42 791.3 u,等电点为6.98,包含375个氨基酸残基;蛋白二级结构上,含有20.53%的α-螺旋(Helix)、4%β-转角(Turn)、53.07%无规则卷曲(Coil)、22.4%伸展条(extenden strand)和1个跨膜结构区域;该蛋白定位于细胞外,作为信号肽的可能性很大。[结论]该研究为猪MSTN基因的进一步分析研究提供了参考依据。     

高邮鸭群体MSTN、MyoD1和MyoG基因外显子中SNP位点的分析

MSTN、MyoD1和MyoG基因与禽类骨骼肌的生长发育密切相关。本试验以高邮鸭为素材,对MSTN、MyoD1和MyoG3个基因的外显子单核苷酸多态性(SNP)位点进行了鉴定,并对这些位点对蛋白质的影响及群体遗传信息进行了分析。结果显示,MSTN、MyoD1和MyoG3个基因的外显子分别有9个、4个和7个SNP位点,其中具有中度多态的位点分别为8个、1个和5个,有义突变各1个,这些有义突变均改变了相应蛋白质的理化性质以及二级结构。     

鸭胚胎发育中后期胸肌发育阻滞的RNA-seq分析

【目的】选择两个中国地方品种高邮鸭和金定鸭,对鸭胚胎发育中后期胸肌进行转录组分析研究,旨在探明胸肌发育阻滞的分子变化机制,为鸭骨骼肌调控机理研究打下基础。【方法】在21胚龄和27胚龄两个时间点,分别解剖高邮鸭、金定鸭各3只,采集胸大肌,提取总RNA构建文库,利用Illumina的HiseqTM2000进行高通量测序,并利用生物信息学方法进行差异表达基因挖掘、基因功能注释等分析,探讨21胚龄和27胚龄两个时间点之间胸肌发育阻滞的分子机制。【结果】高邮鸭、金定鸭21胚龄和27胚龄胸大肌组织RNA-seq质量Q20均在94%以上,Q30均在89%以上,测序得到的结果可靠,可用于后续分析。RNA水平相关性检查和基因mRNA表达量聚类图结果都表明,21胚龄(27胚龄)高邮鸭和金定鸭之间表达模式的相关性高于高邮鸭(金定鸭)21胚龄和27胚龄之间的表达模式。不同品种内时间点之间的差异基因数量(高邮鸭6 128个,金定鸭6 452个)远多于同一时间点不同品种间的差异基因数量(21胚龄522个,27胚龄299个)。qRT-PCR验证试验结果与RNA-seq分析结果相关性较强。通过GO和KEGG富集分析发现,高邮鸭、金定鸭胸肌在21胚龄到27胚龄阶段,能量代谢相关基因(主要为辅酶Q相关基因、ATP酶合成相关基因和细胞色素C相关基因)均显著上调,DNA复制和细胞周期相关基因(主要为微型染色体维持蛋白(MCM)相关基因、复制因子C(RFC)相关基因)均显著下调。相关基因表达的变化可能与此阶段成肌细胞增殖速度减慢,逐渐退出细胞周期开始准备下一阶段融合成多核肌管并形成肌纤维有关。对肌肉生长发育相关的关键基因分析发现,促进肌肉生长的IGF1和诱导成肌细胞末端分化的MyoG显著下调,促进肌纤维分化融合的MUSTN1基因、诱导肌祖细胞向成肌细胞转化的MyoD1基因显著上调。【结论】鸭胚胎中后期胸肌发育过程中大量基因差异表达。其中能量代谢相关基因的上调和DNA复制、细胞周期相关基因的下调,以及肌肉发育相关基因MUSTN1显著上调,IGF1、MyoG等显著下调,可能与鸭胚胎中后期胸肌发育阻滞现象密切相关。     

陆川猪和大白猪IGF-Ⅰ基因对生长性状的效应分析

探讨陆川猪和大白猪IGF-Ⅰ基因多态性与生长性状的关系,以期为猪生产性状标记辅助选择候选基因提供理论依据.试验采用PCR-SSCP技术,在陆川猪和大白猪群中进行了IGF-Ⅰ基因的基因型频率检测及不同基因型的生长性状效应分析.结果表明,IGF-Ⅰ基因对陆川猪和大白猪的断奶重和平均日增重影响显著(P＜0.05),对初生重影响不显著(P＞0.05).     

转敲低MSTN基因绵羊重构胚的移植及鉴定

为培育肌肉丰满绵羊品系,以前期试验中获得的干涉MSTN基因的转基因细胞株为核供体,进行核移植,将获得的重构胚进行体外培养和胚胎移植。结果表明:所获得的重构胚与绵羊成纤维细胞为核供体时的重构胚分裂比率(分别为44.6%和24.1%)及其发育至桑椹胚比率(分别为15.6%和33.0%)相比,差异无统计学意义;将重构胚移植23只受体后,获得1只流产胎儿,对其进行PCR鉴定,结果显示MSTN基因干涉序列已整合入流产胎儿的基因组中。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP3基因的原核表达及其抗原性

参考GenBank中的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)全基因序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增了DHV-ⅠVP3基因,将VP3基因与pET-28a(+)表达载体连接后,转化宿主BL21(DE3),用0.1 mmol·L-1的IPTG诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE电泳,Western-blotting分析蛋白免疫原性。电泳结果表明,VP3在大肠杆菌中表达量较高,表达产物的分子量约为27 kD。免疫印迹试验表明Ⅰ型鸭肝炎病毒VP3蛋白在大肠杆菌中表达产物具有免疫原性。     

惠阳胡须鸡IGF-Ⅰ和GHRL基因多态性研究

以IGF-Ⅰ和GHRL基因为惠阳胡须鸡生长性状的候选基因,通过测序、酶切等方法对93日龄惠阳胡须鸡IGF-Ⅰ和GHRL基因多态性进行分析,并用GLM模型分析基因型与体质量的关联性。结果表明:IGF-Ⅰ基因在第181位发生碱基突变,A突变为G,属于同义突变,BsmⅠ酶切分析发现,IGF-Ⅰ基因只有1种基因型,表明该位点在胡须鸡保种群中已经纯合;GHRL基因在第124位发生碱基突变,T突变为G,改变了酶切位点,通过pfl MⅠ酶切分析发现,GHRL基因有3种基因型,即AA型、AB型和BB型。统计结果表明,93日龄惠阳胡须鸡3种基因型个体间体质量无显著差异。     

黔北麻羊MSTN基因的多态性分析

为给黔北麻羊品种遗传资源的保护及进一步选育提供科学依据,利用BsmAI、MspI、EcoRI、MvaI、XmnI、MnII等6种限制性内切酶对黔北麻羊MSTN基因部分内含子1、2和外显子2进行PCR-RFLP多态性分析。结果表明:在扩增的MSTN基因1 241bp序列中含有BsmAI、EcoRI、MvaI和MnII 4个酶切位点,但均不具有多态性;未发现MspI和XmnI酶切位点。     

鸭TTR基因cDNA克隆和表达研究

为研究转甲状腺素蛋白(transthyretin,TTR)与肉鸭脂肪代谢的相关性,通过快速扩增cDNA末端技术(RACE)获得北京鸭TTR基因全长cDNA序列,并采用实时荧光定量PCR法对鸭TTR基因表达谱进行研究。结果显示:鸭全长TTRmRNA编码150个氨基酸的前体肽,该肽含20个氨基酸的信号肽和130个氨基酸的成熟肽;与哺乳动物相比,鸭TTR亚基N-末端序列多出的3个氨基酸Val-Ser-His,可能使鸭TTR结合甲状腺素T3的亲合力增加。定量检测结果表明,鸭TTRmRNA在脉络丛中的表达量最高,与鸡、爬行类和哺乳动物类似。本实验证实鸭TTR基因在脉络丛中的表达量比鸡更高,并首次发现TTRmRNA在鸭皮下脂肪组织中表达。     

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP0基因在杆状病毒表达系统中的表达

为在昆虫细胞中表达Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus type-Ⅰ,DHAV-Ⅰ)SH株的结构蛋白VP0,首先根据DHAV-Ⅰ SH株VP0基因序列设计一对引物,RT-PCR方法扩增出VP0基因,亚克隆至杆状病毒转移载体pFast Bac1,获得重组质粒p FB-VP0,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒rBacmid-VP0,在脂质体介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-VP0。Western-blot结果显示,表达的重组蛋白相对分子量约为29 k D,间接免疫荧光结果显示重组蛋白能与鸭抗全病毒阳性血清发生特异性反应。研究结果表明,DHAV-Ⅰ SH株的结构蛋白VP0在昆虫细胞中获得了成功表达,为VP0结构蛋白的功能研究和基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

马IGF-Ⅰ基因3′端侧翼区PCR-SSCP多态性分析

[目的]为探明马IGF-Ⅰ基因3′端侧翼区的多态性。[方法]以蒙古马4个地方类型、三河马和英纯血马共270匹马为研究对象,从马的基因组DNA中扩增IGF-Ⅰ基因3′侧翼区序列,并对其进行PCR-SSCP分析。[结果]通过PCR-SSCP分析检测到AA、BB和AB 3种基因型,基因型频率计算结果显示,所选研究对象除锡尼河马(XN)和巴尔虎马(BH)之外,基因型分布均符合"哈代-温格伯定律"。[结论]IGF-Ⅰ基因3′端侧翼区存在多态性位点,可能影响马的生长发育机制。该研究对提高马的生产性能,促进马产业的发展具有重要的理论和现实意义。