准噶尔双峰驼DGAT1基因外显子8序列生物信息学分析

为了研究准噶尔双峰驼二酰基甘油酰基转移酶1(diacylgycerol acyltransferase 1, DGAT1)基因外显子8编码区的理化性质与结构,以及为寻找与双峰驼泌乳性状相关的分子遗传标记提供基础资料,试验对准噶尔双峰驼DGAT1基因外显子8进行PCR扩增,利用生物信息学方法对DGAT1蛋白结构、理化性质及信号肽、跨膜位置等进行分析,并比较了准噶尔双峰驼与其他物种DGAT1氨基酸序列的进化关系。结果表明：准噶尔双峰驼DGAT1基因外显子8扩增产物大小为421 bp,编码484个氨基酸,有1个保守域,位于62～468位氨基酸处。DGAT1蛋白属于亲水性蛋白,且为不稳定的非经典分泌蛋白。二级结构中,α-螺旋占48.35%,延伸链占14.46%,β-转角占4.13%,无规则卷曲占33.06%,存在9个蛋白跨膜结构区域。骆驼科的双峰驼、单峰驼和野骆驼的DGAT1蛋白独立成支,与牛DGAT1蛋白的分子进化距离相距较远。准噶尔双峰驼DGAT1基因外显子8序列及蛋白质结构与牛DGAT1蛋白卷曲方式、立体空间结构方面基本一致。说明DGAT1基因在物种间变异不大。     

鸡Nramp1基因第9外显子的单核苷酸序列多态性分析

以文昌鸡、安卡鸡及藏鸡为试验动物,利用PCR-SSCP方法检测Nramp1基因部分区域的单核苷酸多态性(SNP)。结果发现,该区域存在2个突变,分别为C315G、C357T;共出现4种基因型,分别为GG、GT、TT及AA型,在文昌鸡和藏鸡群体内,T为优势等位基因,而安卡鸡中G为优势等位基因。3个群体该座位均处于哈代-温伯格平衡(PO.05),且3个群体间基因型分布无显著差异(P0.05)。     

水牛κ-酪蛋白外显子4基因的克隆及序列分析

本研究根据普通牛的κ-酪蛋白基因设计一对引物,首次成功扩增出了水牛的κ-酪蛋白外显子4基因,并经序列分析,结果表明κ-酪蛋白外显子4基因片段长780 bp。利用GenBank上的Blast进行比较,中国水牛κ-酪蛋白外显子4序列与地中海水牛、牛、牦牛的κ-酪蛋白外显子4序列同源性分别为99.5%、96.4%、95.9%;氨基酸同源性比较,中国水牛、地中海水牛、牛、牦牛均编码260个氨基酸,中国水牛与地中海水牛、牛、牦牛同源性分别为98.9%、92.0%和91.2%。核苷酸和氨基酸序列同源性结果显示,中国水牛和地中海水牛κ-酪蛋白基因变异不大。但由于在碱基230 bp处发生了一个碱基(A→C)的变化,从而导致其氨基酸也发生了变化,即K(Lys赖氨酸)→R(Arg精氨酸)。本研究为进一步对该基因的功能奠定基础。     

我国地方鸡种CYP21A2基因外显子1序列比较分析

为了探究CYP21A2基因在鸡中的遗传多样性,对25个地方鸡品种的CYP21A2基因外显子1序列进行目标捕获测序,以红色原鸡(Gallusgallus)为标准基因库,并用MEGA6软件对25个鸡种CYP21A2基因外显子1序列进行对比分析,筛选CYP21A2基因外显子1的SNPs位点和Indels位点,以及氨基酸对应的变化,最后运用邻接法构建进化树进行聚类分析。结果显示:在25个品种中有2个SNPs位点和1个Indels位点;在36bp处的SNP1,由G→C,为同义突变;在119bp处的SNP2,由G→A,为错义突变,编码的氨基酸由谷氨酰胺突变为精氨酸;聚类分析显示25个鸡种大致分为3类,其中AA鸡单独为一类,安卡鸡、SPF来航鸡和广西黄鸡等12个鸡种聚为一类,其余12个鸡种聚为一类,表明AA鸡CYP21A2基因外显子1为单独起源。综上分析,我国地方鸡品种中CYP21A2基因外显子1具有丰富的遗传多样性,在抗病性和免疫能力不同的鸡品种间存在差异,提示其与我国地方鸡种的先天免疫功能和抗病有关。     

鸡GPC1基因外显子8的SNPs与部分免疫性状的相关性分析

采用PCR-SSCP对12个不同鸡种glypican-1(GPC1)基因外显子8的单核苷酸多态性进行检测,同时检测如皋鸡、安卡鸡和文昌鸡3个鸡种56日龄的5个免疫性状,进一步分析SNP位点与免疫性状的关系。结果表明:12个鸡种中均出现3种带型,存在g.155 C>A错义突变,引起苏氨酸突变为精氨酸。12个鸡种群中,AA、AB和BB基因型平均频率分别为0.259、0.545和0.211;平均观察杂合度为0.466,平均Shannon信息指数为0.671。除乌骨鸡、大骨鸡偏离了Hardy-Weinberg平衡外(P<0.05),其余群体均处平衡状态。基于该位点构建的UPGMA聚类图将12个鸡种分为3大类,反映了12个鸡种在抗性方面存在的差异。经过关联分析,如皋、安卡鸡中AB型个体的IL-1浓度、H/L值与BB型存在显著差异,与AA型差异不显著;在其他免疫性状中各基因型之间均无显著差异。安卡鸡的一般抗性总体低于如皋鸡和文昌鸡。     

13个鸡品种NLRC5基因外显子8多态性分析

本研究采用PCR-SSCP方法对13个鸡品种的NLRC5基因外显子8的多态性进行了SNP检测,共检测到2个等位基因,2种基因型,其中北京油鸡、固始鸡、皖南三黄鸡、大骨鸡群体中检测到AA和AB两种基因型,其余群体中只检测出AA基因型。序列分析结果显示,在NLRC5基因外显子8的43bp处存在G/A突变,将该突变翻译为氨基酸仍然为缬氨酸,因此该突变是一个同义突变;卡方适合性检验结果显示:13个鸡品种均处于Hardy-Weinberg平衡(P>0.05);根据群体遗传变异分析,13个鸡品种均处于低度多态或无多态(PIC<0.25)。本研究为NLRC5基因作为一种新兴研究的抗性基因是否能为鸡抗病性状选育工作的分子标记提供了初步的参考。     

小尾寒羊雌激素受体基因外显子4的克隆与序列分析

根据GenBank发表的人、鸡、大鼠雌激素受体(estrogen receptor,ESR)基因外显子4的序列设计1对引物,采用PCR 技术扩增出小尾寒羊ESR基因外显子4的DNA片段,将该片段克隆到pGEM-T Easy 质粒中,重组质粒用PCR 扩增进行阳性克隆鉴定,然后测定其核苷酸序列并推导氨基酸序列,同时将测定的小尾寒羊ESR基因外显子4序列与人、牛、猪、大鼠、鸡的外显子4序列进行比较。结果表明：克隆测序所得的核苷酸和翻译后的氨基酸序列与人、牛、猪、大鼠、鸡相比,同源性分别为77.68%～97.28%和71.82%～98.18%,显示了很强的保守性;小尾寒羊的核苷酸序列与人、牛、猪、大鼠、鸡相比存在1处特有变异,氨基酸序列23～36存在高变异区。     

鸡IL-6基因外显子4的克隆及多态性分析

为了研究鸡白介素-6(Interleukin-6,IL-6)抗病基因外显子4在群体中的多态性,试验采用测序法和群体遗传学方法进行数据分析,提取150日龄吉林高脚芦花鸡、吉林矮脚芦花鸡、吉林黑鸡肝脏DNA,依据Gen Bank中鸡IL-6基因序列扩增外显子4。结果表明:外显子4第76位氨基酸有AG的突变,共得到AA、AB、BB三种基因型。纯合度(Ho)分别为0.535,0.671,0.556,杂合度(He)分别为0.465,0.329,0.444,有效等位基因数(Ne)分别为1.869,1.490,1.799,多态信息含量(PIC)分别为0.345,0.275,0.346。     

绒山羊雌激素受体基因外显子1多态性及序列分析

雌激素受体(estrogen receptor,ESR)基因对动物的生殖功能发挥着重要的作用。根据GenBank发表ESR基因外显子1的序列设计引物,采用PCR-SSCP技术分析ESR基因外显子1在河西绒山羊中的单核苷酸多态性,研究该基因对繁殖性能的影响。结果:ESR基因外显子1在所检测河西绒山羊品种中不存在PCR-SSCP多态性,所扩增的片段核苷酸和氨基酸序列与绵羊、人、牛、猪、马、大鼠、小鼠和鸡8个物种的同源性分别为52.0%～98.1%和57.9%～98.2%,序列分析证明山羊ESR基因外显子1序列比较保守,该区域不是影响河西绒山羊繁殖力的功能结构域。     

不同鸡种GARS-AIRS-GART基因21号外显子单核苷酸序列多态性分析

以安卡鸡、文昌鸡、如皋草鸡为实验材料,采用PCR-SSCP法对GARS-AIRS-GART基因的21号外显子进行SNPs检测.结果发现4个核苷酸多态位点:G29943C、C29968T、T30011C、C30017T,其中3处为非同义突变,分别为:29943处天冬氨酸(Asp)→天冬酰胺(Asn)、30011处色氨酸(Trp)→精氨酸(Arg)、30017处精氨酸(Arg)→半胱氨酸(Cys);另1处为同义突变.对多态位点进行单倍型分析,发现12种单倍型,有3种单倍型的频率超过10%,其余9种都小于10%.另外共检测到11种基因型,存在5种等位基因,安卡鸡的D和E等位基因的基因频率较高,基因型频率与其他2个鸡品种之间都存在着极显著的差异(P<0.01),表明我国地方鸡种和外来鸡种在遗传组成上存在着差异.     

HIF-1α基因第12外显子序列生物信息学分析

低氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是细胞缺氧后产生的一种适应性的DNA结合蛋白,由α亚基和β亚基组成,α亚基受低氧诱导,既是HIF-1的活性亚基又是调节亚基。HIF-1对受低氧诱导的低氧反应性基因(hypoxia responsivegenes,HRG)具有调控作用,如促红细胞生成素(EPO)、糖酵解代谢酶、血管内皮生长因子(VEGF)、葡萄糖转移子(Glut)等。这些基因序列有共同特点,     

牛FSHR基因第4外显子多态性检测及序列分析

以西门塔尔和夏洛莱种公牛为对象,采用PCR-SSCP技术检测了促卵泡素受体(FSHR)基因第4外显子在西门塔尔、夏洛莱种公牛45个个体中的遗传多态性,结果发现多态性,旨在为研究该基因多态性与西门塔尔和夏洛莱种公牛繁殖性状的相关性提供理论依据,为筛选繁殖性状分子标记奠定基础.结果表明,牛FSHR基因第4外显子存在2个等位基因A和B,3种基因型分别为AA型、AB型和BB型.对多态片段的测序分析表明,FSHR基因第4外显子第38位碱基处发生碱基C→G的颠换,使得FSHR基因编码的受体胞外域部分出现一个脯氨酸到丙氨酸的变化,结合FSHR蛋白空间结构分析发现该氨基酸变化不直接影响FSHR与FSH的结合及FSHR转导信号能力.此外,据牛、绵羊、猪、马、人和大鼠FSHR基因第4外显子序列同源性比较表明:牛与绵羊该部分序列的同源最高为100%,与大鼠同源性最低为83%.     

水貂酪氨酸酶基因外显子1的鉴定及序列变异分析

根据GenBank中公布的雪貂(登录号:EF405957)、大熊猫(登录号:XM_002930310)、家犬(登录号:CFU42219)及猫(登录号:AY959314)的酪氨酸酶(tyrosinase, TYR)基因DNA序列保守区域,设计1对特异性引物,利用PCR及克隆技术测定了短毛黑水貂、红眼白水貂和米黄色水貂的TYR基因外显子1部分序列,并对该序列进行了BLAST鉴定及变异位点分析,基于该基因编码氨基酸序列构建了16个物种的系统进化树。结果表明,测定的3种毛色水貂TYR基因序列长度均为796 bp,包括795 bp的外显子1和1 bp 5'UTR,共检测到5个单一突变位点:g.A34G、g.T138A、g.T248C、g.A545G和g.C765A,包含4个错义突变:g.A34G(p.Ser12Gly)、g.T248C(p.Val83Ala)、g.A545G(p.Tyr182Cys)和g.C765A(p.His255Gln),1个移码突变分别出现在短毛黑水貂和红眼白水貂个体间:g.T138A(p.Cys46*),获得TYR基因GenBank登录号分别为:短毛黑水貂(KJ198847)、红眼白水貂(KJ658343)和米黄色水貂(KJ152769)。水貂与雪貂、大熊猫、家犬、猫、家兔、猪、羊驼、山羊、绵羊、牛、人、猕猴、黑猩猩、原鸡和日本鹌鹑的TYR基因核苷酸序列同源性为72.8%～98.6%,相应氨基酸序列同源性为75.0%～98.1%。TYR基因分子进化树显示水貂与雪貂遗传关系最近,分化时间约为1000万年前,且与原鸡和日本鹌鹑亲缘关系最远。该结果为进一步开展TYR基因多态性与水貂毛色表型的相关性研究奠定了生物信息学基础。     

不同物种TYR基因外显子1序列的生物信息分析

本研究使用生物信息学的方法比较分析了牛、水牛、藏羚羊、绵羊、山羊、骆驼、骆马、野猪、马等9个物种酪氨酸酶基因(TYR基因)外显子1序列的遗传变异,对其核苷酸序列、氨基酸序列进行了分析,结果在9个物种共计24条序列中发现了180个多态位点,其中单一突变位点80个,简约信息位点100个,总的突变位点为202个,在挑选的9个物种间无长度多态性;共发现了14种单倍型,并未发现物种间共享某一单倍型的情况;外显子1在种间存在较丰富的基因多样性;绵羊和山羊、牛和水牛以及骆驼和骆马两个物种之间的距离较其它物种,亲缘关系最近,而马与其它物种的距离最远。     

猪TYR基因外显子1的克隆测序及序列分析

本研究对荣昌猪和内江猪的TYR基因外显子1进行了克隆测序及序列分析，结果发现3个新的突变位点：319C→T，537C的插入，551A→G。部分突变序列已被GenBank收录，登录号为：AY236997。将突变序列翻译成氨基酸序列后发现，319C→T和551A→G是同义交变。537C的插入是移码突变，其是否会对猪的毛色造成影响，还有待进一步研究。     

陇东绒山羊GH基因第1外显子及第4外显子遗传多态性分析

为了研究陇东绒山羊生长激素(growth hormone,GH)基因的遗传多态性,确定其等位基因数以及各等位基因间的遗传关系。以陇东绒山羊为研究对象,选择陇东绒山羊GH基因Exon1和Exon4作为候选基因,采用PCR-SSCP分子标记技术和DNA测序技术进行多态性研究。结果表明:在Exon4位点1 450bp处发生了C→T的单碱基突变,产生了产G、H两个等位基因和GG、GH、HH 3种基因型,G基因为优势基因,GG为优势基因型,这为后期开展寻找影响陇东绒山羊经济性状的遗传标记奠定了理论基础。     

基因外显子2的克隆与序列分析

 本研究对高繁殖力的山羊品种济宁青山羊和低繁殖力的山羊品种内蒙古绒山羊共20只母羊的骨形态发生蛋白15（bone morphogenetic protein 15, BMP15）基因第2外显子的扩增产物进行了克隆测序及序列比较分析。结果表明：BMP15基因第2外显子的第3对引物扩增片段存在多态。济宁青山羊与内蒙古绒山羊相比，其BMP15基因外显子2差异由2个核苷酸和2个氨基酸改变组成，核苷酸同源性为99%。济宁青山羊与鸡、小鼠、人、猪、牛、绵羊之间BMP15基因外显子2的核苷酸序列同源性为71%～99%，氨基酸序列同源性为43%～99%。     

ESRα基因外显子7和外显子8的多态性分析

为了寻找繁殖主效基因雌激素受体(ESR)α基因新多态性(SNP)位点,试验采用PCR-单链构象多态性(RCR-SSCP)以及测序的方法检测了60头糯谷猪母猪ESRα基因外显子7和外显子8的多态性。结果表明:在外显子7中未发现多态性,外显子8中发现了2个新的多态性位点,在3’UTR区检测到1个多态性位点,分别是472位点的胸腺嘧啶(T)→胞嘌啶(C)突变,562位点的腺嘌呤(A)→鸟嘌呤(G)突变,623位点的T→C突变,A、B基因频率分别为0.816 7,0.183 3,初步推测这3个位点具有连锁效应。     

鸡MAOA基因外显子6的SNP分析

研究采用PCR-SSCP方法分析了吐鲁番斗鸡和新罗曼鸡单胺氧化酶A基因外显子6部分序列的多态性。结果表明：吐鲁番斗鸡单胺氧化酶A基因外显子6存在1个单核苷酸多态性（SNP）位点T-102C,产生AA、AB两种基因型;新罗曼鸡未检测到多态,只表现AA一种基因型。χ^2适合性检验结果表明：2个鸡种均处于Hardy—weinberg平衡状态（P〉0．05）,说明吐鲁番斗鸡单胺氧化酶A基因外显子6位点基因型频率的分布与新罗曼鸡差异极显著（P〈0．01）。     

鸡β-防御素Gallinacin-8基因片段的克隆与序列分析

本试验从鸡的肝脏中提取总RNA,根据GenBank公布的鸡β-防御素Gallinacin-8(简称gal-8)基因序列设计2对引物,运用RT-PCR技术扩增出大小为20lbp的鸡β-防御素gal-8的基因片段.通过序列分析得知其由66个氨基酸组成,包括20个氨基酸残基的信号肽、5个氨基酸的原片肽及41个氨基酸的成熟肽.BLAST分析表明与GenBank中已公布的序列相比较缺失2个碱基,其同源性达到98%.将该基因克隆进pGEM-T Easy载体中,并转化大肠杆茵感受态DH5α,经筛选和测序鉴定获得了阳性重组质粒.从重组质粒中扩增出的成熟肽,大小约123 bp.试验为进一步构建重组核蛋白及表达具有广谱抗微生物活性的防御素提供了实验基础.