早熟马铃薯 ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为得出马铃薯ISSR-PCR最佳的反应体系,采用正交试验设计,对rTaq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs和引物进行5因素4水平筛选.结果表明,马铃薯ISSR-PCR的最佳反应体系为:总体积25 μL的反应体系中含有rTaq DNA聚合酶0.5 U、Mg2+浓度为2.5 mmol/L、模板DNA用量为75 ng、dNTPs浓度为200 μmol/L、引物浓度为0.8 μmol/L.这些因素对PCR反应的影响大小顺序为Mg2+浓度＞rTaq DNA聚合酶用量＞dNTPs浓度=引物浓度＞模板DNA用量.应用该最佳反应体系对39条ISSR引物进行筛选,得出15条条带清晰、条带数多、重复性好的引物.并通过退火温度梯度试验得出筛选引物的最佳退火温度.     

荷花ISSR引物筛选及反应体系优化

利用加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的100条ISSR引物,以2个荷花品种的DNA为模板进行PCR扩增。采用单因素试验方法对荷花ISSR-PCR反应体系的5个因素(Mg2+、引物、dNTP、模板DNA、Taq酶)进行浓度优化,确定了荷花ISSR反应的25μL最佳扩增体系为:10×Taq Buffer 2.5μL,Mg2+3.0 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物1.0μmol/L,Taq酶1.00 U,模板DNA 40 ng。筛选出8条扩增条带较好的ISSR引物,并对其引物进行梯度PCR试验,筛选出各引物对应的最佳退火温度,扩增共计获得61条ISSR条带。     

西葫芦ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为了确定西葫芦ISSR-PCR的最佳反应体系,以西葫芦基因组DNA为模板,采用正交试验方法,对模板DNA、引物及2×Taq PCR Master Mix的用量进行了优化,并通过梯度PCR确定不同引物的最佳退火温度。结果表明,最佳反应体系为:在20μL的体系中,模板DNA(50 ng/μL)1 L,引物(10μmol/L)3 L,Master Mix 10μL;利用该体系从50条ISSR引物中筛选出18条扩增条带清晰、多态性好的引物。这一体系的建立及引物筛选为以后利用ISSR分子标记技术对西葫芦进行研究提供了科学依据。     

浙江红山茶总DNA提取及ISSR-PCR引物筛选

[目的]筛选出简易的DNA提取方法及适合于所有浙江红山茶种质材料进行ISSR分析的有效引物。[方法]采用改良的CTAB法提取基因组DNA,参考其他山茶科植物的50个ISSR引物,对来自浙江、福建、江西、安徽10个居群中共20份浙江红山茶种质材料进行了PCR扩增。[结果]改进的CTAB法可简单、快速地提取到高纯度DNA产物;筛选出的20条引物多态性丰富、条带清晰且可重复性良好。共扩增出337条DNA谱带,其中281条为多态性带,占总扩增带数的83.4%,平均每个引物扩增出16.85条谱带。[结论]所筛选的20条引物可有效应用于浙江红山茶种质资源材料的ISSR分析。     

大明竹属部分植物ISSR-PCR反应体系优化及有效引物筛选

采用单因素试验方法,建立了适合大明竹属25个竹种的ISSR-PCR反应体系,优化了各影响因子的用量,筛选出18条有效引物,并确定它们的退火温度,最后对体系进行了检验.优化后大明竹属植物ISSR-PCR的20 μL反应体系含2.0 μL10×PCR Buffer、2.5 mmol·L-1 Mg2＋、0.15 mmol·L-1 dNTPs、0.5 μmol·L-1引物、1.0 U Tap DNA聚合酶、50 ng模板DNA、10.6μL灭菌ddH2O.扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性60 s,55℃复性45s,72℃延伸90 s,循环40次;72℃延伸7min,4℃保存.该ISSR-PCR反应体系可用于大明竹属部分植物的遗传多样性及遗传结构研究.     

浙江红山茶总DNA提取及ISSR-PCR引物筛选

[目的]筛选出简易的DNA提取方法及适合于所有浙江红山茶种质材料进行ISSR分析的有效引物。[方法]采用改良的CTAB法提取基因组DNA,参考其他山茶科植物的50个ISSR引物,对来自浙江、福建、江西、安徽10个居群中共20份浙江红山茶种质材料进行了PCR扩增。[结果]改进的CTAB法可简单、快速地提取到高纯度DNA产物;筛选出的20条引物多态性丰富、条带清晰且可重复性良好。共扩增出337条DNA谱带,其中281条为多态性带,占总扩增带数的83.4%,平均每个引物扩增出16.85条谱带。[结论]所筛选的20条引物可有效应用于浙江红山茶种质资源材料的ISSR分析。     

油橄榄ISSR-PCR反应体系优化与引物筛选

[目的]对油橄榄ISSR-PCR反应体系进行优化,并筛选出多态性ISSR引物。[方法]以油橄榄嫩叶片提取的基因组DNA为模板,通过单因子试验针对反应体系主要因子Mg2+、dNTPs、引物浓度及模板用量进行油橄榄ISSR-PCR反应体系优化。[结果]优化的油橄榄ISSR-PCR反应体系为:总体系20μl中含1×Taq Buffer,3.5 mmol/L Mg2+,0.4 mmol/L dNTPs,1.0μmol/L引物,1.0 U Taq DNA聚合酶,20 ng DNA模板。反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,52～55℃退火30 s,72℃延伸2 min,40个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。同时利用上述反应体系和反应程序筛选出了扩增稳定、多态性高、扩增条带清晰的ISSR引物11条。[结论]为进一步油橄榄种质资源的多样性研究和品种鉴定奠定了基础。     

华东黄杉ISSR引物反应体系的优化与筛选

在研究华东黄杉(Pseudotsuga gaussenii Flous)的遗传多样性过程中,为了获得清晰、重复性好的ISSR扩增结果,对影响ISSR-PCR的多个因素包括模板浓度、Mg2 浓度、dNTPs浓度、Taq酶的用量、退火温度和循环次数等指标进行了筛选和优化,确定了华东黄杉ISSR-PCR分析的最佳扩增条件为:20μL PCR反应体系中,2μL10×Taq酶配套缓冲液,1.5 UTaq聚合酶(上海Promega公司),1.5~2.5 mmol/L MgCl2,0.2μmol/L引物,0.2 mmol/L dNTPs,10 ng/L模板DNA。用来自江西三清山的4个个体,以100个ISSR引物进行PCR扩增,筛选出扩增效果较好的12个引物。     

钩距虾脊兰ISSR-PCR反应体系的建立与优化

[目的]为钩距虾脊兰种质资源研究奠定基础。[方法]以钩距虾脊兰为试验材料,、利所改良的CTAB法提取钩距虾脊兰基因组DNA,并对影响ISSR扩增反应的各因素进行优化。[结果]获得了高质量的钩距虾脊兰基因。组DNA;同时,建立了最适的钩距虾脊兰ISSR-PCR体系,即25山PCR反应体积中,2．5μl10×PCRbuffer,2．0mmol／LMgCl2,100ng模板DNA,240μmol／LdNTPs,1．75UTaqDNA聚合酶,0．4μmol／L引物;最佳扩增程序为94℃预变性5min。然后进行40个循环：94℃变性30s,复性温度根据各引物的TM值略低1～2℃,30s,72℃延伸50s,循环结束后72℃延伸7min,4℃保存。[结论]这一优化系统的建立为进一步利用ISSR分子标记技术进行钩距虾脊兰遗传多样性研究提供了基础。     

葛根SCoT-PCR反应体系优化及引物筛选

[目的]优化葛根SCoT-PCR反应体系,筛选适用于葛根的SCoT引物,为利用SCoT分子标记进行葛根种质资源鉴定、遗传多样性分析及分子标记辅助育种提供技术支持.[方法]采用正交设计对SCoT-PCR反应体系中的DNA模板量、dNTPs浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶量和引物浓度5个因素进行优化,利用最佳SCoT-PCR反应体系筛选出适用于葛根的SCoT引物,并对该体系进行验证.[结果]最佳葛根SCoT-PCR反应体系20.00μL:DNA模板50.00ng,dNTPs 0.25mmol/L,Mg2+1.50mmol/L,引物0.80μmol/L,TaqDNA聚合酶0.50U.利用该体系从36条SCoT引物中筛选出35条可从葛根中扩增出清晰条带的引物.使用3条引物对18个葛根材料进行PCR扩增,PCR产物表现出良好的重复性、稳定性和丰富的多态性.[结论]建立的最佳葛根SCoT-PCR反应体系和筛选获得的35条SCoT引物可适用于葛根种质资种鉴定、遗传多样性分析、相关分子标记开发等研究.     

香榧ISSR-PCR扩增条件的优化和引物筛选

以香榧Torreya grandis ‘Merrillii’基因组DNA为材料,对影响简单序列重复区间扩增?鄄聚合酶链式反应（ISSR-PCR）的Taq酶用量、Mg²⁺浓度、模板DNA用量、磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs）浓度和引物浓度等进行了优化试验。优化后的香榧ISSR-PCR扩增体系为：总容积20 μL,包括30 ng模板DNA,16.67 nkat Taq酶,0.350 μmol·L -1引物,1.625 mmol·L^-1 Mg²⁺,0.250 mmol·L^-1 dNTPs,10 × PCR buffer 2 μL。PCR扩增程序：94 ℃变性5.0 min;35个循环：94 ℃变性30 s,退火45 s,退火温度视引物而定,72 ℃延伸1.5 min;最后72 ℃延伸7.0 min,4 ℃保温。在此基础上,从77个ISSR引物中筛选出34个适合香榧ISSR分析的引物,且通过梯度PCR确定了各自最适的退火温度。研究结果为香榧遗传图谱构建打下了基础。图4表1参12     

丝瓜ISSR-PCR反应体系的优化

以丝瓜为研究材料,通过单因素试验结合正交设计研究ISSR-PCR反应的影响因素,建立反应体系.结果表明;在20 μL的反应体系中,含2.0 μL 10×buffer,1.5 U TaqDNA聚合酶,0.25 mmol·L-1dNTPs,0.35 μmol·L-1引物,30 ng模板DNA,为丝瓜ISSR-PCR分析的最...     

葡萄种质资源ISSR-PCR反应体系的建立与优化

【目的】建立并优化葡萄种质资源稳定的ISSR—PCR体系,为葡萄种质资源研究和种质创新奠定基础。【方法】以新疆22个葡萄种质资源叶片为材料,采用改良CTAB法提取葡萄基因组DNA,并利用单因素法对影响ISSR反应体系中的各个影响因子进行优化。【结果】优化的最佳ISSR—PCR反应体系为：模板DNA30ng,dNTPs0．3mmol／L,引物0．5μmol／L,Taq DNA聚合酶1．0U,反应体系为25．0μL。【结论】优化了新疆葡萄种质资源ISSR-PCR反应体系中的各个影响因子,利用该体系能够扩增获得清晰、稳定的条带,可以用于葡萄种质资源遗传多样性分析。     

茶树ISSR-PCR反应体系优化研究

通过优化影响茶树ISSR PCR的主要参数,确立适合于茶树的ISSR反应体系和扩增条件。结果表明,在20μl反应体系中模板DNA的用量、T aq酶用量、引物浓度、M g2 浓度、dNT p浓度分别为:模板DNA为40 ng;T aq酶为0.5 U;引物为0.25μm o.lL-1;M gC l2为1.5 mm o.lL-1;dNT p为0.2 mm o.lL-1。适宜退火温度比Tm值高2~3℃。     

梨品种ISSR-PCR反应体系的优化与应用

以海子梨渊Haizili冤品种的DNA 为材料袁对影响ISSR-PCR 扩增的重要因子进行单因素的优化设计袁建 立了最佳体系: 25 滋L 反应体系中含2.5 滋L 10伊buffer尧0.75 U Taq DNA 聚合酶尧0.2 mmol/L dNTPs尧2.5 mmol/L MgCl2尧0.25 滋mol/L 引物尧10~60 ng 模板DNA遥将最佳体系应用于黔西南的22 个梨品种袁证实了该体系的重复性好袁 很稳定遥     

番茄ISSR-PCR反应体系的优化

以番茄(Lycopersicon esculentum)基因组DNA为模板,对番茄ISSR-PCR反应体系的Mg2 、dNTPs、Taq DNA聚合酶浓度和退火温度进行了探讨,确立了适合番茄植物ISSR分析技术体系,为番茄植物遗传多样性和分子系统学研究提供技术支持。     

松毛虫AFLP反应体系的建立及引物筛选

为研究不同环境条件下松毛虫的遗传多样性,以油松毛虫为材料研究松毛虫的AFLP反应体系。对选择性扩增中的预扩增产物稀释倍数、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度和Taq酶浓度进行了比较分析。结果显示,在选择性扩增体系中,预扩增产物稀释40倍,Mg2+浓度1.5 mmol/L、dNTP浓度0.2 mmol/L,引物浓度0.500pmol/L,Taq酶用量为1U,扩增产物经5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可以得到稳定的结果。用优化的AFLP反应体系,以油松毛虫、赤松毛虫和马尾松毛虫为材料筛选引物,从81对引物组合中筛选出10对多态性高的引物组合。     

悬铃木AFLP反应体系优化及引物筛选

以三球悬铃木为试验材料,通过对影响AFLP反应体系的各主要因素的研究,建立了悬铃木AFLP分析技术的体系.结果表明,悬铃木AFLP最佳酶切体系(20 μL)为模板DNA 1 000 ng,PstⅠ和MseⅠ各为3U,在37℃下双酶切3h;在20 μL最佳连接体系中,15 μL酶切产物为3U,T4连接酶,0.25 μmo...