唾液酸黏附素SN及其介导PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞的研究进展

PRRSV是一种能够引起母猪的生殖性疾病和各个年龄阶段猪的呼吸性疾病的RNA正链病毒,在动物体内,PRRSV对单核细胞和巨噬细胞分化的亚群细胞有选择性趋性.唾液酸黏附素SN,又称为CD169或Siglec-1,是唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集素,属于Ig超家族的I型膜蛋白.猪SN基因与人、小鼠等物种存在显著的差异,物种间...     

PRRSV诱导炎症及氧化应激的研究进展

猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)是一种能够引起母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病的单股正链RNA病毒,PRRSV对全球养猪业造成了严重的打击和巨大的经济损失.PRRSV感染仔猪可以引起严重的系统性炎症、间质性肺炎和发热等症状,说明炎症反应在PRRSV感染的致病机制中起重要作用.PRRSV感染后,细胞会产生过量的活性氧自由...     

PRRSV、PCV-2临床感染猪外周血中ACTH含量的变化

采集61头有呼吸道疾病症状猪的病料,采用分子生物学方法进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、PRRSV变异株、猪圆环病毒2型(PCV-2)的检测,并采集血液分离血清,用放射性免疫法检测其外周血中促肾上腺皮质激素(ACTH)的含量.结果表明:PCV-2核酸阳性率为72.13%,PRRSV为39.34%,PRRSV变异株为22.95%;临床存在混合感染,特别是PRRSV与PCV-2的混合感染,感染率达16.39%;PRRSV、PRRSV变异株和PCV-2的感染均比对照组极显著地提高ACTH的含量,其中以PRRSV变异株与PRRSV的混合感染对ACTH的影响最大,ACTH含量达32.20 pg.mL-1.可见,PRRSV、PCV-2的感染促进了ACTH的分泌,增加猪的应激反应,从而降低病猪的免疫功能.     

陕西省PRRSV与CSFV、PCV2、PRV混合感染的检测

运用RT-PCR和PCR技术对高热病期间陕西西安、宝鸡、渭南、榆林、汉中、商洛等地区猪场送检的146 份样品进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV) 、猪圆环病毒2 型( PCV2) 和猪伪狂犬病毒(PRV)检测.结果显示:被检样品中PRRSV的阳性率达46.6%(68/146);PRRSV与CSFV、PCV2 和PRV 3种病毒均有混合感染现象, PRRSV + CSFV混合感染率为25%(17/68),PRRSV +PCV2为19.1%(13/68),PRRSV + PRV为4.4% (3/68),PRRSV + PCV2+ CSFV为14.7%(10/68), PRRSV + PCV2+ CSFV+PRV为2.9%(2/68).结果表明以PRRSV为主要病原的混合感染在所检测的高热病发病猪群的存在是非常普遍的.     

2014—2016 年广东省PRRSV GP5 基因遗传变异分析

为监测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的遗传变异情况,采集了2014—2016年间广东地区46个猪场317份疑患PRRS的临床样品进行检测,并对阳性样品的GP5基因进行了RT-PCR扩增、克隆和测序,选出21株PRRSV GP5基因进行序列比对和遗传进化分析。结果表明:所分离的PRRSV均属于美洲株,21株PRRSV GP5基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为82.4%~98.7%和78.6%~98.5%,其中2株与美国NADC30分离株同属亚群Ⅲ,10株与近几年广东省内分离的PRRSV毒株QYYZ和GM2同属于亚群Ⅳ。PRRSV GP5基因的遗传进化分析结果表明,亚群Ⅲ和亚群Ⅳ是近几年在广东省内流行的新兴亚群,研究结果将为PRRSV疫苗的选择以及防控方案的制定提供参考。     

2020—2022年闽粤赣地区PRRSV ORF5基因的分子流行病学调查

【目的】了解闽粤赣地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的分子流行动态,为该疫病的科学防控提供参考。【方法】采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对2020—2022年闽粤赣地区1 475份临床猪组织和血清样品进行检测,对PRRSV阳性样品进行ORF5基因扩增和测序,并对ORF5基因的序列进行系统发育分析。【结果】2020、2021、2022年闽粤赣地区发病猪PRRSV的阳性率分别为24.23%(95/392)、27.69%(162/585)、18.07%(90/498),2020—2022年福建、广东、江西地区PRRSV的阳性率分别为23.20%(272/1 172)、23.96%(52/217)、26.44%(23/87)。挑选来自不同猪场的86份阳性样品进行PCR扩增,成功获得62株PRRSV ORF5基因序列,并下载GenBank已发布的18株2020—2022年闽粤赣地区PRRSV的ORF5基因序列,与127株PRRSV国内外参考株ORF5基因序列构建系统发育树。系统发育树显示,80株闽粤赣PRRSV分离株均属美洲株。其中,40株分布在谱系1(NADC30-like株...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒FJ04A株的分离及其结构蛋白基因特性分析

从临床表现为繁殖障碍的猪群中分离到一株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)FJ04A株,用RT-PCR方法进行鉴定,扩增出该分离毒的结构蛋白基因并进行了序列测定.预测其推导的结构蛋白相对分子质量、等电点、抗原位点和糖基化位点等.序列比较结果表明:该分离毒ORFs2-7与美洲型代表株VR2332核苷酸同源性为98.1%-99.5%,氨基酸同源性为96.5%-99.2%;而与欧洲代表株LV的核苷酸同源性为57.3%-63.4%,氨基酸同源性为54.7%-77.6%.表明该分离毒为PRRSV美洲型毒株.     

PRRSV辽宁分离株ORF3基因的克隆与序列分析

以辽宁地区某猪场猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病料为材料,采用RT-PCR方法特异性扩增编码猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3蛋白的ORF3基因全长cDNA,结果该分离株ORF3基因cDNA编码区长765bp,可编码254个氨基酸残基,与美洲型代表株VR-2332和欧洲型代表株LV进行同源性比较,氨基酸同源性分别为87.8%和54.5%,因此推测辽宁分离株属于美洲型。     

PRRSV弱毒细胞疫苗与灭活疫苗生殖道黏膜免疫效果观察

应用组织学方法比较观察了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)弱毒细胞疫苗与灭活疫苗生殖道黏膜免疫的效果。试验选用5月龄长白×大约克夏二元杂交母猪18头。PRRSV弱毒细胞疫苗和灭活疫苗通过生殖道黏膜免疫接种。结果表明PRRSV弱毒细胞疫苗生殖道黏膜接种组母猪的子宫黏膜上皮内淋巴细胞数较灭活疫苗生殖道黏膜免疫接种组和对照组母猪显著减少(P<0.01);而且子宫黏膜上皮变矮变薄,变得有些不规则。灭活疫苗生殖道黏膜接种组母猪子宫黏膜上皮内淋巴细胞数与对照组母猪间差异不显著(P>0.05)。本试验结果显示PRRSV弱毒细胞疫苗经生殖道黏膜免疫接种则对生殖道黏膜上皮内淋巴细胞产生抑制作用。说明PRRSV弱毒细胞疫苗和灭活疫苗经生殖道黏膜免疫效果不理想     

猪蓝耳病的几种血清学诊断方法

调查云南省猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的流行规律和混合感染情况。

采用分子生物学方法对2013—2021年间的3112份血液样品进行PRRSV核酸检测,并进一步分析其流行和混合感染情况。

检测样品中,有801份样品为PPRSV阳性,阳性率为25.74%,二重、三重和四重混合感染率分别为41.20%、12.48%和1.87%;不同生长阶段猪群的PRRSV感染程度差异较大,生长育肥猪感染最严重(33.24%);相对于育肥场和散养户,种猪场的感染程度较轻,三者的感染率分别为27.94%、28.94%和14.29%。对不同毒株类型分析发现：高致病性毒株和经典毒株仍是主要的流行毒株,分别占毒株数的58.49%和22.64%,但占比呈逐年下降趋势。于2019年和2021年在云南省内分别发现了类NADC30毒株和类NADC34毒株,分别占毒株数的15.09%和3.77%,其感染率呈逐渐上升趋势。

猪繁殖与呼吸综合征仍是影响云南省生猪产业健康发展最重要的疫病之一,表现形式以和其他疾病混合感染为主。随着新毒株的发现,云南省PRRSV基因更加多样,防控形势愈加复杂。

     

稳定表达CD163蛋白的猪肺泡巨噬细胞系的建立

以RT-PCR方法从原代猪肺泡巨噬细胞中获得CD163 cDNA序列,然后测序鉴定,对突变碱基进行修正,将修正后碱基序列克隆入真核表达载体pcDNA4.0中,构建重组真核表达质粒pcDNA4.0-CD163,通过BamHⅠ/NotⅠ双酶切及测序鉴定其正确性。使用脂质体2000将pcDNA4.0-CD163转染猪肺泡巨噬细胞系3D4/21(CRL-2843),通过Zeocin抗性筛选,建立稳定表达CD163的猪肺泡巨噬细胞系。RT-PCR、间接免疫荧光(IFA)检测结果表明CD163在mRNA和蛋白质水平均已表达。通过Zeocin抗性筛选,共获得8株表达CD163的重组细胞株,IFA检测结果表明表达的CD163定位于重组细胞的细胞膜表面。去除筛选抗性后连续传代10代,间接免疫荧光检测结果确定重组细胞株在10代内性状稳定,说明稳定表达CD163的猪肺泡巨噬细胞系构建成功。     

猪长链非编码RNA lnc-000649在PRRSV感染增殖中的作用

长链非编码RNA(lncRNA)在免疫及病毒与宿主互作中发挥重要作用.本研究在猪PAM细胞中发现一种新的猪长链非编码RNA tnc-000649,其全序列长1 483 bp.利用荧光定量PCR技术检测了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染前后PAM细胞中lnc-000649的表达水平,发现其在PRRSV感染后表达显...     

猪繁殖与呼吸道综合征病毒荧光定量PCR检测方法的研究

通过条件优化,以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-ORF7为标准品,进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了PRRSV的荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μl;利用该方法对3份不同的组织样品进行重复性检测,计算出平均循环阈值的标准差分别为0.14、0.14和0.44,变异系数分别为0.01%、0.01%和0.02%,说明该方法具有良好的重复性和重现性。对阳性组织病料的检测表明,该方法与常规RT-PCR的阳性符合率为100%,但其检测灵敏度较常规RT-PCR约高100倍。     

LPS诱导奶牛子宫内膜上皮细胞氧化损伤模型的建立

[目的]采用脂多糖(LPS)作为刺激源,建立奶牛子宫内膜上皮细胞(BEEC)氧化损伤模型.[方法]体外培养BEEC并进行细胞鉴定,用不同浓度的LPS刺激细胞,在不同时间点用CCK-8法测定细胞存活率,以确定BEEC氧化损伤模型条件.倒置显微镜下观察细胞形态学变化,流式细胞术检测细胞凋亡率,DCFH-DA检测细胞内活性氧(ROS)含量,比色法检测细胞中的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT).[结果]与空白对照组相比,当LPS浓度为80μg/mL,作用时间为12 h时,造成细胞损伤,其细胞凋亡率、ROS产生量和MDA含量明显高于对照组,SOD和CAT活性显著低于对照组.[结论]建立奶牛子宫内膜上皮细胞氧化损伤模型的条件为LPS作用浓度80 μg/mL,作用时间12 h.     

Cigarette smoke: protection of alveolar macrophages by glutathione and cysteine

Phagocytosis of bacteria by rabbit alveolar macrophages is inhibited quantitatively by cigarette smoke in vitro. This phagocytoxic effect was abolished by addition of 0.2 to 0.4 micromole of glutathione or cysteine per milliliter of cigarette smoke. Serum protein was required to obtain both the toxic effect of the smoke and the protective action of the sulfhydryl compounds. The protective role of the sulfhydryl agents suggests an oxidant action of the cigarette smoke on these pulmonary cells.     

猪圆环病毒2型体外诱导RAW264.7细胞氧化应激模型的建立

[目的]探讨猪圆环病毒2型(PCV2)感染量、感染时间与被感染RAW264.7细胞活性氧水平动态变化的相关性,为建立RAW264.7细胞氧化胁迫体外模型提供参考依据.[方法]PCV2原液调至5×106/mL,经10、102、103和104倍稀释(10-1、10-2、10-3和10-4释度)后,感染作用RAW264.7细胞2h,弃病毒液,加入含5% FBS的DMEM培养液继续培养,分别于第4、8、12、24和48 h收集细胞上清液或细胞,测定一氧化氮(NO)、活性氧自由基(ROS)、还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、髓过氧化物酶(MPO)和诱生型一氧化氮合酶(iNOS)等指标.[结果]10-1PCV2感染RAW264.7细胞后能有效升高细胞NO、ROS水平,降低细胞GSH水平和GSH/GSSG,升高细胞XOD、MPO和iNOS活性,表明以10-1pcv2感染RAW264.7细胞一定程度上能改变细胞氧化还原状态,诱导细胞产生氧化应激.[结论]PCV2感染能诱导RAW264.7细胞发生氧化应激,并确立10-1 PCV2(5× 105/mL)体外感染RAW264.7细胞4~24 h是建立RAW264.7细胞氧化胁迫模型的最佳条件.     

四氯化碳致鸡肝脏和肾脏损伤实验动物模型的建立

给试验鸡人工灌服亲肝毒物四氯化碳（CCl4）,检测血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）活性的改变,观察肝脏和肾脏病理组织学变化,以建立肝脏和肾脏损伤的实验动物模型。试验结果显示,CCl4对鸡肝脏的损伤呈现出毒性累加效应,CCl4对鸡肝脏的损伤和致血清中转氨酶活性升高需要一定的作用时间和较高的攻毒剂量,而且随着投药剂量的增加,试验鸡血清中ALT的活性呈现出升高的趋势。试验鸡灌服CCl4后引起的肝细胞急性变性呈现出以典型的水泡变性为特征的病理变化。     

CRISPR/Cas9介导TLR5敲除猪肺泡巨噬细胞系建立及对革兰阴性菌黏附能力的影响

Toll样受体5(TLR5)是Toll-like受体家族中的重要成员,在革兰阴性菌引起的炎症反应中发挥着重要的调控作用.通过CRISPR/Cas9基因敲除技术对猪肺泡巨噬细胞(PAMS)的TLR5基因进行敲除,然后经菌落计数,检测TLR5基因敲除后对大肠埃希菌F18ab和F18ac以及沙门菌黏附能力的影响.结果 表明:...     

猪圆环病毒2型减少猪肺泡巨噬细胞中伪狂犬病疫苗载量和CD80-CD86基因转录

[目的]探明猪圆环病毒2型(PCV2)干扰伪狂犬病疫苗(PRV)免疫效果的可能机制.[方法]用PCV2与PRV在体外分别单接种和共接种仔猪肺泡巨噬细胞(AM),在接种后不同时间用荧光定量PCR技术检测PRV载量与共刺激分子CD80-CD86 mRNA水平的动态变化.[结果]PRV组上清中PRV载量在接种后都显著(P＜0.05)高于PCV2+ PRV组.与对照组相比,在接种后48 h内,PRV组CD80 mRNA水平在接种后增加并在48 h时达到显著水平,而PCV2组与PCV2+ PRV组的CD80 mRNA水平都显著减少;在接种后48 h内,CD86 mRNA水平在PRV组都显著增加,在PCV2+ PRV组则都显著减少,但在PCV2组仅在接种后48 h显著减少.[结论]PCV2能够减少猪AM中PRV载量与CD80-CD86基因转录,这可能是PCV2抑制PRV免疫效果的机制之一.