大麦β-葡聚糖的制备研究

采用酶解的方法对大麦中β葡聚糖进行分离制备,β葡聚糖的提取率为2%。DNS法和考马斯亮蓝法检测提取品无还原糖和蛋白质。与标准的β葡聚糖进行比较,可作为底物对β葡聚糖酶活性测定。     

茶树β-1,3葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的优化表达

从茶树中获得β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-glucanase , β-1,3-glu )基因cDNA,发现其中存在着一些序列,它们与核糖体竞争性地结合pET32a载体上的RBS位点, 造成该基因cDNA在原核生物中很难表达.作者对其中的两处基因序列进行了突变,通过设计PCR引物,利用密码子的简并性,保证了突变后蛋白质的一级结构不变.使葡聚糖酶基因在大肠杆菌中明显表达.通过SDS-PAGE分析,证明表达产物分子量约75.8 kD,与预计大小一致,并通过水杨酸法对其进行酶活测定,证明其有活性.     

条锈菌诱导的小麦β-1,3-葡聚糖酶基因编码区的克隆及原核表达

为研究小麦与条锈菌互作过程中β-1,3-葡聚糖酶基因的功能,根据小麦β-1,3-葡聚糖酶cDNA全长序列设计合成引物,通过RT-PCR方法获得小麦β-1,3-葡聚糖酶基因编码区,将其克隆至pGEM T-easy Vector,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切回收目的片断,并将其定向克隆到pET-32a(+)Vector中构建表达载体GLU-pET-32a(+),转化E.coliBL21(DE3),用IPTG进行诱导表达。结果表明,小麦β-1,3-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中得到了高效表达,获得了分子量约为49 ku的融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的19%。最佳诱导条件为:0.3 mmol/LIPTG,37℃诱导4 h。     

超滤纯化青稞β-葡聚糖的研究

为对青稞(Hordeum vulgare)β-葡聚糖进行纯化,以膜通量为指标,采用单因素和正交试验,对青稞β-葡聚糖进行超滤处理,分析超滤过程中操作压力、温度和料液流速对膜通量的影响。结果表明,优化的超滤条件为操作压力0.12 MPa、温度45℃、料液流速20 mL/s。该条件下超滤膜通量可达38.5 L/(m2·h),β-葡聚糖截留率达到99.2%,表明超滤处理可应用于青稞β-葡聚糖纯化。     

几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因克隆微生物表达和抑菌效果研究

采用PCR扩增的方法,扩增获得几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的基因,分别将其基因克隆到原核表达载体pET28a(+)上,构建了原核表达载体pETChi和pETGlu。经IPTG诱导后几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因在大肠杆菌BL21中得到高效表达。通过对连孢(Alternaria alternate)的抑菌实验表明,这两基因的表达产物对此真菌有较强的抵抗能力。     

钙对苹果果实过氧化物酶、β-1,3-葡聚糖合成酶和β-1,3-葡聚糖分解酶活性的影响

 采用贮藏实验与果实薄片培养实验相结合的方法,研究了钙素对苹果果实β-1,3-葡聚糖合成酶、β-1,3-葡聚糖分解酶和过氧化物酶(POD)的活性及对丙二醛(MDA)含量的影响。结果表明,与对照比较,幼果期喷钙显著降低了苹果苦痘病发病率, POD和β-1,3-葡聚糖合成酶的活性增加,β-1,3-葡聚糖分解酶活性和MDA含量降低;果实薄片培养中,与低钙处理比较,高钙处理POD和β-1,3-葡聚糖合成酶的活性增加,β-1,3-葡聚糖分解酶活性和MDA含量下降。说明苹果果实生理变化与钙素营养关系密切,果实钙营养不足导     

辣椒疫霉菌葡聚糖酶抑制蛋白的原核表达、纯化及结晶

葡聚糖酶抑制蛋白(GIP)是辣椒疫霉菌在病理环境下诱导产生的一类蛋白,是病原菌抗性蛋白的一种。本研究根据辣椒疫霉菌全基因组序列,通过生物信息学分析、序列比对获得葡聚糖酶抑制蛋白全长基因序列。以辣椒疫霉高致病菌株SD33全基因组为模板扩增GIP基因cDNA,并对其进行相关生物信息学分析。基因经测序验证后与载体pET28a(+)连接,构建好的重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli Rosetta),用IPTG诱导表达重组蛋白6×His-GIP。重组蛋白在5 mol/L尿素变性环境下进行亲和层析纯化,对纯蛋白进行透析、复性、浓缩后进行分子排阻层析纯化,并对获得的纯蛋白进行蛋白结晶试验,为进一步阐明GIP作用机理奠定基础。     

苎麻纤维中β-葡聚糖酶活力测定条件的比较研究

[目的]为了获得苎麻纤维β-葡聚糖活力测定的最佳条件,比较苎麻纤维和饲料添加剂中β-葡聚糖酶测定方法的异同点。[方法]采用DNS法,对苎麻纤维中β-葡聚糖酶活性的测定条件进行比较研究。[结果]测定苎麻纤维中β-葡聚糖酶活力的最佳条件为:50℃条件下反应30 min后沸水浴10 min。[结论]该方法可以为苎麻纤维中β-葡聚糖酶的酶活力测定提供借鉴。     

薤白EPSP合成酶基因cDNA的克隆与原核表达分析

 【目的】揭示棉田杂草薤白（Allium macrostemon Bunge）抗草甘膦的分子机理,开发利用其草甘膦抗性特性。【方法】运用RT-PCR结合RACE技术,分离克隆了薤白中草甘膦作用的靶酶EPSP合成酶（EPSPs）基因cDNA,并将其构建成原核表达载体在大肠杆菌中诱导表达和鉴定其抗性。【结果】薤白EPSP合成酶基因cDNA序列全长1 821 bp,编码一段522个氨基酸的推导蛋白质。经BLAST及蛋白质结构预测,蛋白具有EPSPs的特征序列,并与已报道的EPSPs序列有高同源性,确认克隆的cDNA序列即是薤白EPSPs基因序列,命名为EPSPsA。将该cDNA与原核表达载体pRSET-A重组后,构建成重组表达质粒pRSET-A-EPSPsA,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导了目标蛋白的高效表达。经SDS-PAGE电泳分析显示,该蛋白的分子量约为55 kD,与预期大小一致。通过草甘膦对表达细菌处理,表达菌对草甘膦的抗性显著提高。【结论】薤白EPSPs对草甘膦具有一定抗性。     

水稻β-石竹烯合成酶基因OsCAS的克隆鉴定、原核表达及其遗传转化

    为阐明水稻β-石竹烯在调节水稻、害虫及其天敌相互关系中的作用,克隆鉴定了一个水稻β-石竹烯合成酶基因OsCAS,并对其原核表达与遗传转化进行研究.该基因的cDNA全长1731 bp,包含一个1728 bp的开放阅读框,编码一个由576个氨基酸组成的蛋白,预测分子量66.5 kDa.系统进化树分析表明,水稻OsCAS基因编码蛋白的氨基酸序列与同为单子叶植物玉米的β-石竹烯合成酶氨基酸序列同源性达99%,而与其他植物(拟南芥、青篙、黄瓜)的同源性仅51%.褐飞虱为害和茉莉酸处理能明显上调OsCAS基因的表达水平.同时原核表达了OsCAS基因,并利用农杆菌转化系统获得OsCAS基因过量表达和RNAi的水稻品系,为分析OsCAS基因的生化与生物学功能奠定了基础.     

奶牛β-防御素5基因的克隆与原核表达

根据已发表的β-防御素5基因序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增奶牛白细胞β-防御素5基因片段,构建原核表达载体并进行诱导表达.结果表明:将PCR产物插入pGEM-T easy载体后,经琼脂糖凝胶电泳、PCR、酶切及DNA测序证明构建的重组克隆载体完全正确,以该重组质粒为模板扩增目的基因的成熟肽片段,产物用EcoR I+NotⅠ双酶切并与原核表达载体PET28a连接,获得了预期的重组表达质粒.将重组表达质粒转化到BL21(DE3)宿主菌中,用异丙基--βD-硫代半乳糖苷诱导表达,经尿素-SDS-PAGE检测表明表达产物为6.4 kda的融合蛋白.     

桑天牛内切β-1，4-葡聚糖酶活性分析及其基因CDs区的克隆与表达

[目的]研究陕南地区桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶基因,为构建高效分解纤维素的工程菌奠定基础,[方法]用质量分数为1%的羟甲基纤维素钠(CMC-Na)测定桑天牛幼虫内切β-1,4-葡聚糖酶活性,Trizol法提取桑天牛肠道总mRNA,扩增其内切β-1,4-葡聚糖酶基因,用DNAStar和NCBI上的BLAST进行序列分...     

绿色木霉β-葡萄糖苷酶的重组表达及进一步纯化

β-葡萄糖苷酶在食品风味物质形成和生物活性物质转化中发挥重要作用。以纤维素酶工业生产菌株绿色木霉Sn-9106的总RNA为模板,采用RT-PCR技术获得大小为2235bp的cDNA片段,该序列与GenBank中的U09580.1β-葡萄糖苷酶序列相比,氨基酸序列同源性达99%。经大肠杆菌原核表达,β-葡萄糖苷酶的活力达到20.3U/mg,为β-葡萄糖苷酶制剂大规模生产及在食品工业中的应用提供了理论依据。     

一株绿色木霉产外切β-葡聚糖苷酶条件及其纯化与性质的研究

从树林中腐烂木块上采集并筛选出一株分泌外切β-葡聚糖苷酶(exo-1,4-β-D-glucanase or cellobiohydrolase,CBH)的绿色木霉菌株．在100mL的锥形瓶中装入40mL培养基的产酶状况最好,其通气量最佳,培养液初始pH为8时绿色木霉产生的CBH活力最高．随绿色木霉生长时间的延长,CBH的活力与培养基中的葡萄糖含量呈交替的一高一低的波浪状变化．通过硫酸铵分部分离、葡聚糖G-100凝胶过滤、DEAE-纤维素52阴离子交换柱层析等方法使绿色木霉所产的CBH达到了电泳纯,纯化倍数为16．3．CBH的反应最适温度为60℃,最适pH为6．0,Km(底物为羧甲基纤维素钠)为17．34mg／ml．     

青花菜β-1,3葡聚糖酶基因的克隆、表达分析及其植物表达载体的构建

根据其他植物的β-1,3-葡聚糖酶基因保守域序列设计简并引物,扩增出青花菜β-1,3-葡聚糖酶基因的中心区段,结合5′RACE和3′RACE技术获得该基因的5′端序列和3′端序列,经序列拼接获得1个1 277 bp 的cDNA,在GenBank 中登录号为EF484879,定名为BObg.序列分析结果表明,该cDNA 包含1个1 056 bp的开放阅读框,编码352个氨基酸,其理论上的等电点PI=7.314,相对分子质量为3.892×104,聚类分析显示该序列与已报道的其他植物的β-1,3-葡聚糖酶基因具有较高氨基酸序列同源性.利用未接种和接种霜霉病后不同时期的青花菜植株细胞进行半定量RT-PCR分析,结果表明,该基因在霜霉病接种后48 h优势转录表达,未接种和接种后其他时期都呈低水平转录表达.利用pBI121质粒构建含35S启动子的正义表达载体,酶切图谱和PCR分析结果证明该表达载体构建成功.     

鸡贫血病毒衣壳蛋白基因的原核表达

[目的]为VP1蛋白的免疫学研究和鸡贫血病毒基因工程疫苗的研制奠定基础。[方法]将1个新克隆的鸡贫血病毒vpl基因（AF448446）在大肠杆菌DE3中进行表达,并对该蛋白进行纯化。[结果]结果表明：已成功构建了表达载体pET30（b^＋）-vp1;VP1蛋白已成功诱导表达并得以纯化;获得的VP1蛋白序列与已发表的VPl蛋白序列存在差异。[结论]试验克隆的vp1基因大小为1347bp,编码449个氨基酸的蛋白。     

短小芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆、表达及其酶特性研究

提取短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)基因组,通过PCR克隆了短小芽孢杆菌β-葡聚糖酶基因全长序列.结果表明:该基因全长754 bp,ORF为717 bp,编码239个氨基酸,计算分子量为26.98 kD,等电点为6.08.经Blast分析,该序列与地衣芽孢杆菌同源性最高(91%),该基因首次在GenBank上登录(登录号AY164456).在克隆载体上亚克隆基因全长,构建重组表达载体pET-pum,导入大肠杆菌BL 21中表达.SDS-PAGE电泳表明:在27 kD左右有表达带,酶活较低(7.24 U/mL),仅为出发菌酶活的16%,其最适温度为50 ℃左右,最适pH在5左右.     

芥蓝1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因BaDXS1的克隆及原核表达

本研究以芥蓝为实验材料,采用同源克隆的方法分离出BaDXS1基因,其开放阅读框为2 139 bp,编码712个氨基酸。理化性质分析表明,BaDXS1蛋白的分子量为77.21 ku,等电点pI为8.59,不含跨膜区域,位于植物细胞叶绿体内。氨基酸序列比对发现,芥蓝DXS1与甘蓝、拟南芥、烟草、番茄等植物的DXS蛋白序列的一致性达到79%以上;系统进化树分析显示,芥蓝DXS1与甘蓝DXS的亲缘关系最近。构建原核表达载体pEASY-Blunt E1-BaDXS1,并对其进行诱导表达,发现该蛋白在大肠埃希菌体内主要以包涵体的形式存在。     

莜麦麸中β-葡聚糖的提取与纯化

通过研究料液比、温度、pH值和提取时间等单因素对莜麦麸中β-葡聚糖提取率的影响,设计多因素试验,利用正交试验优化工艺,筛选出了提取β-葡聚糖的最佳组合:温度75℃、pH10、料液比1∶17、提取时间2 h.同时,分别讨论了不同方法脱除蛋白质、不同溶剂沉淀β-葡聚糖以及不同酒精度下醇析β-葡聚糖等关键工艺.     

构建表达载体提高枯草杆菌β-葡聚糖酶表达量

构建了β-葡聚糖酶表达载体 P~(SGI)。转化枯草杆菌 SO113后,可高效表达β-葡聚糖酶,并分泌到培养基中。其酶活性约为无表达质粒的枯草杆菌的十倍。