猪圆环病毒2型天津及周边地区分离株的遗传演化分析

为了解天津及周边地区猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2,PCV2）的流行毒株遗传变异情况,本研究应用基因克隆技术和生物信息学分析软件对24株PCV2分离株全基因及ORF2基因分别进行克隆、测序、同源性比对和遗传进化分析。全基因组序列分析结果显示,24株PCV2分离株全基因组序列有14株为1 767 bp,10株为1 768 bp。用DNAStar软件对全基因组序列同源性比对表明,24株PCV2分离株与NCBI上的PCV2参考株的全基因序列同源性为93.6%~99.8%,24株分离株之间的全基因组序列差异很小,同源性为94.0%~99.9%。同时,用DNAStar对PCV2分离株的ORF2基因序列同源性分析表明,其与NCBI上的PCV2 ORF2基因参考序列的核苷酸序列同源性为87.3%~99.3%,24株分离株ORF2基因核苷酸序列同源性为89.0%~100.0%,3株分离株（10084F4、R14040及R14086）的核苷酸序列同源性为100.0%。对全基因和ORF2基因的遗传进化分析表明,24株分离株的系统进化树被分为2个大分支,其中23株分离毒株属于PCV2b亚型,1株属于PCV2a亚型,未分离出PCV2c亚型。综上所述,天津及周边地区PCV2的流行模式仍以PCV 2b亚型为主,本研究为该地区PCV2的流行变异情况研究提供了一定的理论依据。     

陕西省部分地区猪圆环病毒2型全基因组的遗传变异分析

为了解陕西省猪圆环病毒2型(PCV2)的遗传变异情况,根据GenBank登录的PCV2全基因组序列,设计1对引物,从陕西省部分地区规模化猪场疑似PCV2感染的病猪采集病料9份,应用PCR扩增PCV2的全基因,其中6份为阳性,并对扩增的6个PCV2全基因组序列进行测序和序列分析。基因测序表明,PCV2基因组全长为1 767bp;对6株病毒序列进行同源性比较,6个毒株全基因之间核苷酸同源性为98.3%~100%,与GenBank上已发表的国内外毒株全基因组比较,同源性为96.3%~97.8%;与近几年陕西株比较发现基因变异程度不稳定,与2013年分离株(KX352154.1)同源性最高,2015年分离株(KX352159.1)次之,反而与2014年分离株(KX068219.1)最低;对6个毒株的ORF1和ORF2基因进行同源性比较,6个毒株的ORF1和ORF2基因的核苷酸同源性分别为98.1%~100%和98.2%~100%,与GenBank上已发表的国内外参考株ORF1和ORF2基因进行同源性比较,同源性分别为97.6%~99.8%和91.5~96.0%。陕西省流行的PCV2基因组较为保守,变异不大,同源性很高。     

猪圆环病毒2型山西分离株的遗传变异多样性分析

为了进一步研究山西猪圆环病毒2型(PCV2)的遗传变异多样性情况,对山西2013—2016年间分离的9株猪圆环病毒流行株(SXQX、SXCZ、SXJC、SXJX、SXLL、SXPY、SXPG、SXXY、SXTY2株)的全基因组进行了扩增、克隆和测序,已收录入GenBank中。并将其全基因序列、ORF2序列和推导出的Cap蛋白氨基酸序列与不同国家和地区的28株主要流行株进行了遗传变异多样性分析,结果显示:9株PCV2山西流行株全基因组核酸序列全长SXJX、SXXY、SXJC株为1 768bp,其余均为1 767bp,分别约占33%和67%。9株PCV2流行株之间核苷酸同源性为94.7%~99.8%,与国内外28株参考株同源性为93.9%~99.9%,与国产疫苗株同源性(LG、DBN-SXO7-2、SH株)为95.1%~99.8%;PCV2全基因组序列的进化分析表明:本试验分离的SXJX、SXJC、SXXY株属于PCV2a亚型的2D亚群,SXLL、SXPY、SXCZ株属于PCV2b亚型的1C亚群,SXTY14、SXQX、SXPG株属于PCV2b亚型的1A/1B亚群,可见近几年,山西PCV2流行株以PCV-2b亚型为主。分离的9株PCV2的ORF2之间核苷酸和Cap蛋白氨基酸同源性分别为90.0%~100.0%和87.1%~100.0%,与28株参考株之间核苷酸和氨基酸同源性分别为87.6%~100.0%和84.1%~100.0%,与国产疫苗株核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为91.0%~100.0%和89.3%~100.0%,同源性都较高。9株分离株中,有6株分离株(SXQX、SXTY14、SXPG、SXXY、SXJC、SXJX)Cap蛋白氨基酸为233个,其中SXQX、SXTY14、SXPG株的ORF2位于1 033~1 734bp,SXXY、SXJC、SXJX株的ORF2位于1 034~1 735bp,3株分离株(SXCZ、SXLL、SXPY)Cap蛋白氨基酸为234个,其ORF2位于1 030~1 734bp,而与其他基因组序列为1 767bp分离株的ORF2相比,1 030~1 734bp位置多了3个碱基TCA,导致其氨基酸序列在234位置增加1个K(Lys)。另外还发现9株PCV2Cap蛋白除了唯一糖基化位点(NYS)(第143~145位氨基酸)呈高度保守外,还存在较多的氨基酸变异,这为山西地区PCV2的免疫预防等的研究提供理论依据,并为深入开展PCV2的分子致病机理提供基础理论数据。     

猪圆环病毒2型北京株的分离及基因组序列分析

为了解北京地区猪圆环病毒2型(PCV2)毒株的遗传变异特性,本研究对2010年病料中分离的2株PCV2通过PCR、IPMA进行初步鉴定,并扩增病毒全基因组,用DNAStar进行序列分析,用MEGA5进行PCV2ORF2序列比对,构建系统进化树。结果表明,分离得到的BJ2010LC株(登录号为JQ002671)、BJ2010PG株(登录号为JQ002672)2个PCV2毒株其全基因组长度均为1 767bp,与国内外参考毒株核苷酸序列同源性为94.2%～99.5%,2个分离株之间的核苷酸序列同源性为96.6%。BJ2010LC株属于基因型PCV2d,BJ2010PG株属于基因型PCV2b。     

5株湖南猪圆环病毒1型全基因组测序与遗传进化分析

为了解湖南猪群猪圆环病毒1型（PCV1）的遗传变异情况,以PCV1阳性DNA为模板,使用PCR方法分两段扩增PCV1全基因序列并进行拼接。结果共获得5个PCV1全基因组,其中3株全基因大小为1 759 bp,另外2株分别为1 758 bp和1 760 bp。5株全基因组同源性为98.4%~99.7%,与国内外的PCV1全基因组同源性为98.1%~99.7%;ORF2序列同源性为97.6%~99.6%,与国内外的PCV1 ORF2同源性为96.1%~99.9%。系统发育树显示,5株PCV1均属于同一分支,并显示出一定的地理差异,但差异较小。结果表明,湖南省流行的PCV1毒株基因较为稳定,分离株间差异较小。本研究为湖南省猪圆环病毒病防控及相关研究奠定了基础。     

北京市猪场猪圆环病毒3型感染状况调查及其ORF2基因遗传进化分析

为了解猪圆环病毒3型(PCV3)在北京市不同区县猪场中的流行情况,研究建立PCR检测方法,对来自北京市8个区县56个养殖场的1177份临床样品进行检测,并对获得的部分ORF2全基因序列进行遗传进化分析。结果显示,PCV3总体阳性率为1.0%(12/1177),猪场阳性率为8.9%(5/56)。对PCV3阳性样本进行ORF2基因测序及同源性比对,共测得12株PCV3 ORF2全长基因序列,其中包括6株不同的ORF2全长基因序列。结果显示,该6株序列之间的核苷酸相似性为97.7%～99.5%,推导氨基酸序列的相似性为97.2%～100%;与参考毒株之间的核苷酸同源性为96.0%～99.5%,推导氨基酸同源性为92.1%～100.0%;进化树显示北京毒株属于PCV3b基因型。试验表明,PCV3在北京多个猪场呈现一定的流行趋势,流行毒株以PCV3b基因型为主。     

猪圆环病毒2型乌鲁木齐分离株全基因序列遗传变异分析

为分析乌鲁木齐市猪圆环病毒2型(PCV2)遗传变异情况,对疑似感染PCV2组织样品的全基因组进行PCR扩增、克隆和测序,并进行序列比对与遗传进化分析。结果表明,测序的5株PCV2基因组3株全长为1 766 bp,2株全长为1 767 bp,5株PCV2核苷酸序列同源性在96.1%~99.5%之间,与Gen Bank国内外已发表的17株PCV2基因核苷酸序列同源性在94.5%~99.7%之间;遗传进化树显示,3株属于新出现的PCV2d亚型毒株,2株属于国内优势流行的PCV2b亚型毒株。     

猪圆环病毒2型吉林分离株的全基因组序列分析

采用PCR扩增1株吉林新分离的PCV2-2017全基因组序列,经过测序拼接后进行了序列分析。毒株PCV2-2017基因全长1 767 bp,在GenBank上进行同源性比对,同源性在96%～99%之间;与法国株AF055394同源性可达99%,与美国株AF055391、四川株HM102350同源性最低,为96%。PCV2中ORF1编码Rep蛋白,核苷酸和氨基酸同源性达到99%,ORF1突变很小,相对保守;ORF2基因全长为702 bp,编码Cap蛋白,氨基酸同源性达94%～99%,核苷酸同源性与美国株比对,可达96%,与法国株和国内部分毒株同源性达99%,是变异主要发生部位,共有12处点突变;ORF3编码蛋白,核苷酸同源性高达100%,说明变异不大。基因的遗传进化分析表明,PCV2-2017吉林新分离株全基因组与法国株AF055394亲缘关系最近,同属于PCV-2b亚型;与AY322001、AB426905和国内GU370064、AY691169、AY969004、DQ180393毒株亲缘关系较远。     

2010-2013年四川地区猪圆环病毒2型的分子流行病学调查

为了掌握四川地区近年猪圆环病毒(PCV2)的分子流行和分子进化动态规律。将2010-2013年期间采集自四川成都、德阳、雅安、西昌、遂宁、乐山、资阳等11个养猪地区的疑似PCV2病料共324份进行了检测与分析。设计1对检测PCV2的特异性引物,PCR检测病料表明PCV2阳性为229份,PCV2感染率为70.7%。随后对本实验室分离到的11株PCV2分离毒株进行全基因组克隆与序列分析,11株PCV2四川分离株的全基因组序列分析均为PCV2b基因型,各地分离株之间的全基因同源性为95.2%⁹9.7%,与参考毒株之间的全基因同源性分别为94.1%99.7%,与参考毒株之间的全基因同源性分别为94.1%⁹9.7%;与国内外参考毒株相比,ORF1的核苷酸及推导氨基酸的序列的同源性分别为96.7%99.7%;与国内外参考毒株相比,ORF1的核苷酸及推导氨基酸的序列的同源性分别为96.7%¹00%、98.4%100%、98.4%¹00%,ORF2核苷酸及推导氨基酸的序列的同源性88.0%100%,ORF2核苷酸及推导氨基酸的序列的同源性88.0%⁹9.7%、85.4%99.7%、85.4%¹00%,序列分析发现ORF2变异位点较多,而ORF1相对较保守。本研究结果显示:2010-2013年间,四川地区PCV2感染率高,主要分布在乐山、德阳等市,且流行的基因型以PCV2b为主。     

猪圆环病毒2型山西株全基因组序列分析

为了解山西省猪圆环病毒2型（PCV2）的遗传变异情况,本试验采用PCR方法对山西省分离的4株猪圆环病毒流行株（SXXZ1株、SXXZ2株、SXTY株和SXJZ株）的全基因组进行了扩增、克隆和测序,并将其全基因组序列与国内外34株主要流行毒株进行核苷酸同源性与系统进化树分析。结果显示,4株PCV2山西流行株全基因组核酸序列全长SXJZ株为1 768 bp,其余均为1 767 bp,分别占25%和75%。4株毒株核苷酸同源性为95.9%~100.0%,与国内外34株参考株同源性为94.5%~99.9%,与国产疫苗株同源性为95.6%~99.8%;PCV2全基因组序列进化分析表明,本研究分离的SXXZ1株、SXXZ2株和SXTY株属于PCV-2b基因型,SXJZ株属于PCV-2e基因型,其中SXXZ1株和SXXZ2株与广东QY株的进化关系最近,SXTY与奥地利AUT5株的进化关系最近,SXJZ与福建FJ株的进化关系最近;而SXXZ1株、SXXZ2株和SXTY株与山西PCV2疫苗DBN-SX07-2株的进化关系较近,SXJZ株与国内PCV2疫苗LG株的进化关系较近。从而证实在山西省流行的PCV2毒株以PCV-2b为主,同时还分离出了PCV-2e亚型,表明山西省存在PCV-2e亚型毒株。本试验结果为山西省PCV2的分子流行病学、遗传变异及防控奠定了基础。     

3株猪Ⅱ型圆环病毒的分离及基因组序列分析

为了解混合感染中猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)毒株的遗传变异特性,本研究对2009年与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染的病料中分离的3株PCV2通过PCR、免疫荧光等进行初步鉴定,并扩增病毒全基因组,用DNAStar对序列进行拼接和分析。结果表明:分离得到的HUN-09株(GQ449670)、HUB-09株(GQ449671)和SD-09株(GQ449669)3个PCV2毒株其全基因组长度均为1768bp,与国内外参考毒株核苷酸序列同源性为95%～99.7%,3个分离株之间的核苷酸序列同源性为97.6%～98.5%,与PCV1分离株核苷酸序列同源性为69%～70%。进化分析表明,本研究2009年分离的3株PCV2属于基因型PCV-2a。     

猪圆环病毒2型江西株的全基因组克隆和序列分析

为了解江西地区猪圆环病毒2型（PCV-2）的流行和进化情况,根据GenBank上已发表的PCV-2全基因序列设计1对引物,PCR扩增后得到9条PCV-2全基因序列,并对其全基因序列核苷酸和蛋白序列进行分析,绘制遗传进化树。结果表明,江西地区流行的9株PCV-2中,基因组序列全长分为8株1 767 bp和1株1 768 bp,9株PCV-2的核苷酸同源性为94.7%~99.9%,与GenBank己发表的PCV-2分离株全基因组同源性介于94.3%~99.8%之间,而9株PCV-2的ORF1核苷酸序列同源性为96.9%~100.0%。ORF2和ORF3编码的蛋白氨基酸序列存在部分位点突变。遗传进化树显示为3种基因型：5株PCV-2b、3株PCV-2d、1株PCV-2a。本研究有助于江西地区PCV-2的监测和防制。     

猪圆环病毒2型广东分离株ORF2基因的克隆和序列分析

为了解广东部分地区猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)流行毒株的基因型和遗传变异情况,本研究根据GenBank中PCV2的核苷酸序列设计针对ORF2基因的1对特异性引物,从分离于广东省的8株PCV2分离株BL、HD、Li、GD01、GD02、HD01、HD02和HD03株的细胞培养物中扩增ORF2基因,扩增片段克隆到pMD18-T上,获得重组质粒,并对其进行测序。序列分析结果表明,8株PCV2分离株ORF2基因与其他PCV2 ORF2基因核苷酸序列同源性为89.7%~100%,氨基酸序列同源性为87.2%~99.6%,进化分析结果表明,其中7株分离株处于同一分支,属于PCV2b-1A/1B,HD01株属于PCV2b-1C。     

1株犬源PCV3的全基因克隆与序列分析

根据GenBank上已发表的PCV3毒株序列设计1对检测引物和2对扩增全长引物。应用检测引物对广西地区的犬血清样品进行PCR检测,应用扩增全长引物对检测阳性样品进行PCR扩增、克隆和测序,并对其全基因序列进行分析,绘制遗传进化树。结果显示,广西地区147份犬血清样品中,阳性样品为36份,感染率为24.3%。本试验成功扩增1株2 000 bp的PCV3毒株的全基因核苷酸序列,并命名为PCV3/Guangxi-5。将PCV3/Guangxi-5序列与NCBI公布的PCV3的参考序列进行同源性比对,结果显示PCV3/Guangxi-5与参考序列的全基因序列同源性为98.9%～100.0%,其中与DE27.16同源性最低,与PCV3/CN/Chongqing-148/2016同源性最高。应用MEGA7.0对PCV3进行ORF2基因的氨基酸序列进行比对发现,第24位至第27位氨基酸存在6种形式,分别为VRRK、ARRR、ARKR、LRRK、VRRR和ARRK。利用MEGA7.0软件中Maximum Likelihood (ML)法p-distance模式构建基于ORF2基因和PCV3全基因的系统发育分析表明,PCV3可分为PCV3a和PCV3b等2种基因型,本试验获得的PCV3/Guangxi-5为PCV3a亚型,其ORF2基因与PCV3/CN/Liaoning-23/2016亲缘关系最近,与NWHEB21、毒株亲缘关系相距最远;其全基因组与CN/Jiangxi-62/2016毒株亲缘关系最近,与CNFJ-1毒株亲缘性最远。结果表明,广西地区犬群普遍存在感染PCV3的情况,理论上丰富了广西地区PCV3的流行病学资料,为PCV3的防治措施的制定和流行病学研究提供一定的参考依据。     

广东地区新生仔猪先天性震颤猪群中PCV3感染情况的调查

对广东省不同地区新生仔猪先天性震颤猪群中PCV3的流行病学情况进行调查。采集的病料样品,通过常规PCR进行PCV3检测与全基因扩增,分析其全基因的遗传进化关系。将获得的16株PCV3毒株核酸序列与其他环状病毒参考毒株对全基因组和Cap基因进行遗传变异分析,结果显示,新生仔猪的先天性震颤猪群中PCV3样本总阳性率高达58.2%。16株PCV3毒株之间全基因核苷酸序列同源性为99.5%~100%,与美洲代表毒株PCV3-US/MO2015全基因核苷酸序列同源性在98.8%~99.1%之间;16株PCV3毒株之间Cap基因的核苷酸序列同源性为99.7%~100%,与国内外参考毒株的核苷酸同源性为99.1%~100%。遗传进化分析显示,16株PCV3毒株都属于PCV3a分支。PCV3在我国广东省新生仔猪先天性震颤猪群中广泛存在。     

猪圆环病毒2型湖南株的分离及全基因组序列分析

为了解湖南省猪圆环病毒2型(PCV2)的来源及与其他地区毒株的关系,从湖南省疑患断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMW S)猪群中分离PCV2毒株1株(PCVHunan),提取病毒DNA,进行PCR扩增,扩增产物经克隆与酶切鉴定,获得1.7 kb片段的阳性重组质粒,对其进行全基因组测序分析,与Genbank中已知全基因组序列进行同源性比较。结果,该序列与国内外毒株核苷酸同源性为93.0%~97.7%,其中与美国株(AR145609)及澳大利亚株(AY424405)同源性最高,为97.7%。2个主要阅读框(ORF1与ORF2)氨基酸序列与国内外毒株同源性分别为98.4%~99.4%和88.0%~95.7%。     

天津及周边地区猪圆环病毒2型流行情况调查及分离鉴定

为了调查天津及周边地区猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）的感染情况及其分子特征,本研究应用PCR方法对疑似PCV2感染病例开展调查,将阳性病料接种dulac细胞分离病毒,应用PCV2 ORF2基因特异性引物对分离的PCV2进行PCR扩增,克隆、测序后进行核苷酸序列同源性分析。结果显示,不同地区PCV2的阳性率为25.0%~38.1%,其中夏季的阳性率明显高于其他3个季节,达到44.0%;不同阶段猪群中,育肥猪群的PCV2阳性率最高,而哺乳母猪相对较低。经细胞分离得到24株PCV2,其ORF2序列与GenBank中PCV2序列的同源性为87.8%~99.2%,24株分离株之间的同源性为89.4%~100.0%;遗传进化分析显示,24个分离株归属于2个分支。对其中一株分离毒株（Y16155-1株）的体外增殖特性研究表明,第4代接种dulac细胞后6 h即可检出PCV2核酸,72 h病毒含量达到高峰,病毒滴度为10^-4.3 TCID₅₀/0.2 mL。本试验结果为进一步研究该地区PCV2分子流行病学及相关疾病的免疫防控奠定了基础。     

天津及周边地区猪圆环病毒2型流行情况调查及分离鉴定

为了调查天津及周边地区猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的感染情况及其分子特征,本研究应用PCR方法对疑似PCV2感染病例开展调查,将阳性病料接种dulac细胞分离病毒,应用PCV2 ORF2基因特异性引物对分离的PCV2进行PCR扩增,克隆、测序后进行核苷酸序列同源性分析。结果显示,不同地区PCV2的阳性率为25.0%~38.1%,其中夏季的阳性率明显高于其他3个季节,达到44.0%;不同阶段猪群中,育肥猪群的PCV2阳性率最高,而哺乳母猪相对较低。经细胞分离得到24株PCV2,其ORF2序列与GenBank中PCV2序列的同源性为87.8%~99.2%,24株分离株之间的同源性为89.4%~100.0%;遗传进化分析显示,24个分离株归属于2个分支。对其中一株分离毒株(Y16155-1株)的体外增殖特性研究表明,第4代接种dulac细胞后6h即可检出PCV2核酸,72h病毒含量达到高峰,病毒滴度为10-4.3 TCID50/0.2mL。本试验结果为进一步研究该地区PCV2分子流行病学及相关疾病的免疫防控奠定了基础。     

河北省猪星状病毒4型全基因组测定及遗传进化分析

为了解河北省流行的猪星状病毒(PAstV)遗传特性和重组现象,设计了7对特异性扩增引物,利用RT-PCR方法进行全基因组序列扩增;应用DNAStar软件和MEGA 7.0软件对扩增得到的序列进行拼接和核苷酸同源性分析,并建立基于全基因组和ORF2基因的系统进化树;利用生物学分析软件对全基因组序列结构特点和重组现象进行分析。结果显示,成功扩增得到1株PAstV4 HB-SJZ全基因组序列;全基因组遗传分析显示,HB-SJZ株与PAstV4参考毒株同源性显著高于其他基因型毒株,为74.2%～81.0%,与匈牙利4型毒株WBAstV-1同源性最高(81.0%);基于ORF2基因分析显示,HB-SJZ株与PAstV4参考毒株同源性为64.8%～68.9%,与日本毒株PoAstV-VIRES-GX03-C3遗传关系最近(68.9%);重组分析显示,HB-SJZ株的ORF1基因与JPN Bu5 2014株和JPN Mol2-3 2015株存在重组现象。这一研究提示河北省流行的PAstV4是同物种重组毒株,为该病的流行病学调查提供科学依据,也为该病的防控提供理论基础。     

河北部分地区猪圆环病毒2型分离鉴定及遗传变异分析

为了解河北省猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)基因型感染及遗传变异情况,对采自河北省6个不同地区的32份疑似PCV2感染的组织通过PCR进行初步鉴定,并将鉴定为阳性的组织通过接种PK-15细胞分离病毒,通过PCR、间接免疫荧光、透射电镜对分离的病毒进行鉴定,利用特异性引物对PCV2进行PCR全基因序列扩增,测序后进行全基因及ORF2基因核苷酸序列分析。结果显示,32份疑似样品中有13份PCV2阳性组织,阳性率为40.65%。对其中1份仅感染PCV2的样品进行病毒的细胞分离及后续鉴定,得到1株可稳定感染和增殖的PCV2毒株。将初步筛选的阳性组织进行PCV2全基因扩增并测序,得到8株PCV2全基因序列,基因组全长均为1 768 bp; 8株PCV2全基因同源性比对结果为95%～99.8%,ORF2同源性比对结果为94%～100%;遗传进化分析显示,8个分离株归属于3个基因亚型(PCV2a、PCV2b和PCV2d),同源性氨基酸序列分析显示主要变异区在47～63 aa抗原表位区。本试验结果为进一步研究该地区PCV2分子流行病学及相关疾病的免疫防控奠...