从江香猪γ干扰素基因克隆与序列分析

试验旨在研究从江香猪γ干扰素（interferon gamma,IFN-γ）基因克隆与序列分析。试验提取贵州从江香猪肝脏组织总RNA,反转录生成cDNA,采用2对特异性引物进行巢式PCR扩增从江香猪IFN-γ（CJ-poIFN-γ）基因编码区,将其克隆至pUCm-T载体上,获得重组质粒pUCm-CJpoIFN-γ,并测序鉴定;利用NCBI、SOPMA、SignalP-4.1等在线服务器软件、DNAStar软件对CJ-poIFN-γ进行序列分析。结果表明,CJ-poIFN-γ基因编码区长501 bp,编码166个氨基酸;核苷酸序列比对结果显示,CJ-poIFN-γ与梅山猪、剑白猪、藏猪、成华猪、荣昌猪、印度猪、长白猪、内江猪同源性为99.4%~100.0%;进化树分析结果显示,CJ-poIFN-γ与梅山猪、剑白猪、藏猪、成华猪亲缘关系较近;CJ-poIFN-γ基因编码蛋白不存在跨膜结构,为分泌蛋白,前23个氨基酸为信号肽序列;CJ-poIFN-γ基因编码蛋白二级结构主要以α-螺旋（50.60%）和无规则卷曲（33.14%）为主,B细胞表位主要位于62-65、84-87、113-115、144-156和162-166位氨基酸。试验结果为进一步研究IFN-γ的生物活性、加快从江香猪品种资源的有效利用奠定基础。     

从江香猪

香猪是70年代末期,在贵州都柳江上游与广西壮族自治区接壤地带山区中新发现的一种小型地方猪种,中心产区在贵州从江县的宰便和加鸠两地。产区地处偏僻,交通闭塞,饲料贫乏,饲养管理粗放,当地少数民族有食乳猪的习惯,香猪就是在这种特定的环境条件下,经过长期近交和选育形成了具有“一小二香”和“基因纯化”的特色。     

从江香猪

从江香猪产于贵州省从江县 ,是我国稀有的优良地方微型猪种。 1 982年编入《中国猪种》第二集 ,1 993年被农业部列为二级保护畜种 ,1 999年荣获“99中国国际农业博览会名特优产品”称号 ,2 0 0 0年农业部 1 3 0号公告将其列入《国家级畜禽品种资源保护名录》。它以其体型矮小、肉质细嫩、基因纯合、纯净无污染等独特的优点而著称 ,并具有适应性好、抗病力强、饲养管理粗放等优点。它是在独特的自然生态条件和地理环境中通过当地少数民族群众特殊的饲养管理方式 ,经过长期的选种、选育而逐渐形成的优良地方微型猪种。1　自然生态概况及品种形…     

羊干扰素Tau基因克隆与序列分析

本文应用 PCR扩增技术 ,以国外已发表羊干扰素 Tau(IFN- τ)基因序列为基础设计引物 ,在国内首次从北京绵羊、南江黄羊这两种国产羊的血液中分别扩增出 IFN- τ基因 ,并将 IFN- τ基因插入 PQE- 30载体构建重组质粒 ,经 PCR鉴定及 Sph 、H ind 双酶切鉴定证实为羊 IFN- τ基因的重组质粒。重组表达质粒测序结果表明 IFN- τ(p3)基因全长 5 16 bp,编码 172个氨基酸。实验发现 ,从北京绵羊、南江黄羊扩增出来的 IFN- τ基因序列与已发表的序列相比 ,其碱基同源性分别为 96 .3%、99.0 4 % ,氨基酸同源性分别为 :92 .4 %、97.1%。     

从江香猪抑制素α基因克隆及其卵巢表达研究

为了探索抑制素α基因(inhibin-α,INHA)与从江香猪繁殖性状之间的相关性,试验采用特异性聚合酶链式反应(PCR)技术克隆从江香猪INHA基因,测定其核苷酸序列,通过等位基因特异性PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)方法检测从江香猪低产群与高产群之间INHA基因的多态性变化,以实时荧光定量PCR技术检测高产、低产从江香猪卵巢组织中INHA基因的表达量。结果表明,从从江香猪基因组中成功克隆了INHA基因,编码区完整,全长1095 bp,编码364个氨基酸;经比对发现, INHA基因外显子2序列中存在2个候选SNPs位点(G359A和A373G)。经大样本检测,从江香猪高产群与低产群之间2个候选SNPs位点的基因频率没有明显差异;相比之下,高产从江香猪卵巢中INHA基因的表达量较高。研究结果提示,从江香猪INHA基因结构保守,可能主要通过基因的表达量变化调节从江香猪卵巢的生长和卵泡的发育。     

从江香猪源干扰素γ植物表达载体构建及在生菜中瞬时表达

为构建从江香猪源干扰素γ(IFNγ)植物表达载体,通过农杆菌真空渗透法在新鲜生菜中实现瞬时表达。参考GenBank登录的猪IFNγ基因序列设计1对特异性IFNγ引物,采用RT-PCR方法从贵州从江香猪源肝脏组织扩增IFNγ基因序列,将其克隆至植物表达载体PBI121,转化根癌农杆菌LBA4404,筛选阳性菌株提取质粒,对重组质粒进行PCR扩增、双酶切及测序鉴定;携带重组质粒根癌农杆菌真空渗透法感染生菜,GUS染色检测感染的生菜叶片,ELISA检测感染生菜叶片中从江香猪源IFNγ蛋白,分析重组质粒在生菜中表达效果;采用细胞病变抑制实验检测生菜中从江香猪源IFNγ蛋白抗病毒活性。结果表明:本研究成功地从贵州从江香猪源肝脏组织扩增获得IFNγ基因序列并构建了从江香猪源IFNγ植物表达载体PBI121-IFNγ;GUS染色感染的生菜叶片可见蓝色物质;ELISA检测感染生菜叶片中从江香猪源IFNγ蛋白含量为169.397、170.657、170.37 pg/mL;生菜中表达从江香猪源IFNγ经4^-6稀释在Marc145细胞上仍能够抑制100 TCID50的PRRSV的致细胞病变作用。本实验成功构建从江香猪源IFNγ植物表达载体PBI121-IFNγ,生菜中瞬时表达蛋白具有免疫反应性和抗病毒活性,为从江香猪源IFNγ药用植物蛋白的研究开发提供参考依据。     

猪γ-干扰素全基因克隆及原核表达

利用RT-PCR技术,从ConA活化的猪外周血淋巴细胞中扩增出γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ) cDNA,克隆到pMD18-T载体中进行测序后,与原核表达载体pET32a(+)重组,表达含His×6的IFN-γ重组蛋白;测序结果与GenBank中已发表的序列进行比对,核苷酸同源性在98.6%~100.0%之间,氨基酸同源性在96.4%~99.4%;经SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,该重组蛋白分子质量约为27 ku,主要存在于包涵体中,且具有良好的免疫学活性,为进行γ-干扰素深入的研究奠定了基础。     

从江香猪IFN-β基因的序列分析及原核表达

试验旨在探明从江香猪β-干扰素（interferon-beta,IFN-β）基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象,提取肝脏总RNA并反转录为cDNA,设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区,将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上,获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β,并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析;将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明,从江香猪IFN-β基因编码区长为561 bp,编码186个氨基酸;该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸为信号肽序列;二级结构主要以α-螺旋（77.42%）和无规则卷曲（17.74%）为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%~100.0%,与禽的同源性最低（35.2%）;从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%,但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%,存在E43Q、K73R和C161R 3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,条带大小约为24 ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。     

从江香猪MYL2基因CDS区克隆及序列分析

为了克隆贵州从江香猪MYL2基因CDS区,并进行序列分析,为后续MYL2基因功能研究奠定基础,试验采集从江香猪背最长肌组织,进行RNA的提取和c DNA合成,对MYL2基因的CDS区进行克隆、构建重组载体,并进行生物信息学分析。结果表明:从江香猪MYL2基因的CDS区全长510 bp,编码166个氨基酸,为稳定蛋白,属于亲水性蛋白,无跨膜螺旋区域,不存在信号肽;MYL2蛋白亚细胞有8.7%存在于细胞核内,56.5%存在于细胞质中,21.7%存在于细胞骨架中。     

从江香猪IFN-β基因的序列分析及原核表达

试验旨在探明从江香猪β-干扰素(interferon-beta,IFN-β)基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象,提取肝脏总RNA并反转录为cDNA,设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区,将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上,获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β,并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析;将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明,从江香猪IFN-β基因编码区长为561bp,编码186个氨基酸;该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸为信号肽序列;二级结构主要以α-螺旋(77.42%)和无规则卷曲(17.74%)为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%～100.0%,与禽的同源性最低(35.2%);从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%,但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%,存在E43Q、K73R和C161R3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,条带大小约为24ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。     

成华猪γ-干扰素基因分子克隆与序列分析

为研究猪γ—干扰素在抗御传染性疾病和肿瘤生物治疗中的免疫增强作用，本实验以ConA刺激成华猪外周血淋巴细胞提取激活淋细胞的mRNA，设计合成特异的引物序列，应用反转录—聚合酶链式反应(RT—PCR)扩增和克隆成华猪IFN—γ基因并进行序列5ll定。成华猪IFN—γcDNA约长500bp，从第68位核苷酸开始编码其信号肽，到569位核苷酸为终止子。IFN—γ基因的开放框架(ORF)由498bp构成，编码166个氨基酸。成华猪IFN—γ与猪IFN—γ基因核苷酸间同源性为98％，在261—269存在点突变，在氨基酸水平完全一致。IFN—γ氨基酸与鼠同源性为30％，与人同源性为40％。     

从江香猪的保种与开发

1 概况香猪是我国稀有的地方微型猪种.它是在特定的自然环境和社会条件下,长期培育形成的.从江县是香猪的中心产区,香猪主要分布在加鸠、宰便、加榜、秀塘、刚边、加勉、光辉等乡镇及相邻地区.80年代初期,全县香猪年饲量3万余头.自1977年全国地方猪种资源普查发掘以来,香猪以其“体型小、肉味香嫩.基因纯合、纯净无污染”等特点而引起全国各地有     

从江香猪开发利用现状与对策

从江香猪开发利用现状与对策邵峰泉（贵州省农业厅品改站）从江香猪是１９７７年贵州地方猪种资源普查中发掘出来的一个小型猪种。以其体小、肉香、基因纯合、纯净无污染等特点，引起全国各地有关科研单位、农业院校专家学者的高度重视，被认为是理想的实验用动物和制作高...     

金华猪MYLPF基因克隆与序列分析

研究采用Trizol试剂提取70日龄金华猪肝脏组织的总RNA,反转录成c DNA,利用RT-PCR方法扩增MYLPF基因编码区全长序列,将纯化的目的片段与pClone007载体连接,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选出阳性克隆并测序,然后利用生物信息学软件分析其序列特征,并构建系统进化树。结果表明,金华猪MYLPF基因的c DNA核苷酸序列、RT-PCR产物长度为611 bp,重组后的质粒长度为756 bp,编码169个氨基酸,同源性分析表明,与大白猪的MYLPF氨基酸序列完全相同。MYLPF分子进化树表明金华猪与鸡和斑马鱼的亲缘关系较远,与大白猪的亲缘关系最为接近。     

陆川猪H-FABP基因克隆与序列分析

为了研究心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因与陆川猪肌内脂肪沉积的相关性,寻找猪脂肪沉积的主要候选基因,试验对陆川猪H-FABP基因进行了克隆与序列分析,参照Gen Bank已经公布的猪H-FABP基因序列(EF619344)设计引物,扩增克隆了陆川猪H-FABP基因的编码区序列,并应用DNAStar、Prot Scale等生物软件对其进行了序列分析和蛋白质二级结构预测。结果表明:陆川猪H-FABP基因编码区全长402 bp,编码133个氨基酸,碱基序列在235位点由A突变为G,并引起相应氨基酸由精氨酸转变为甘氨酸。其与野猪的亲缘关系最近,碱基同源性为99.3%;与人类、绵羊和家牛的碱基同源性也在90%以上。陆川猪H-FABP成熟肽包含有25.56%的α螺旋、12.03%的β转角、25.56%的无规卷曲和36.84%的延长线。说明H-FABP基因可作为研究陆川猪脂肪沉积的候选基因之一。     

三元猪β干扰素基因克隆与生物信息学分析

为了提高猪的抗病毒性,试验以三元猪(杜×长×大)为试验动物,提取猪肝脏的DNA,利用特异性引物PCR扩增三元猪β干扰素(IFN-β)基因,将其克隆到pGEM-T Easy质粒载体上,菌液PCR鉴定重组质粒后进行测序鉴定,同时对IFN-β进行了全面的生物信息学分析。结果表明:经PCR扩增获得了IFN-β全基因序列,其长度为682 bp;生物信息学分析显示三元猪IFN-β基因的开放性阅读框编码186个氨基酸残基,前21个为信号肽;三元猪IFN-β蛋白分子质量为21.97 ku,等电点为4.89;三元猪IFN-β与已报道的其他猪的IFN-β氨基酸序列具有较高的相似性;三元猪和马首先聚类,其次是人和猴,与鸡的同源性最低;三元猪IFN-β蛋白具有IFN-αβ的匹配区域,同时含有IFN-αβ受体复合物两个跨膜亚基IFNAR-1和IFNAR-2的结合位点,预测IFN-β蛋白属于IFN-αβ超家族。     

猪GPR54基因克隆与序列分析

从苏姜猪的下丘脑中提取组织总RNA,根据GenBank中猪GPR54 mRNA全序列设计引物,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行cD-NA扩增,获得一条528 bp的片段,克隆于pGEM-TEasy载体后进行测序,并进行序列分析。结果表明:该片段为GPR54基因的cDNA,它由528个核苷酸组成,编码172个氨基酸,分子量为18.714 ku,经序列分析显示,猪GPR54基因序列与其他物种间同源性低,但种内同源性比较高,该序列和已发表猪的基因序列同源性100%。     

从江香猪提纯复壮技术措施

香猪是从江县的地方特色猪种,以形体矮小、肉质香嫩、基因纯合、纯净无污染等独特的优点而闻名全国。饲养香猪是从江县西部贫困山区农民的传统习惯和主要经济来源。由于户均饲养规模较小以及品种、饲料、饲养管理等多方面的原因,经济效益相对较低,为了提高农民饲养香猪的经济效益,增加农民收入,使之真正成为从江县西部贫困山区农民脱贫致富的支柱产业,特提出下列从江香猪提纯复壮技术措施。1加强香猪本品种选育,保证品种优良要提高从江香猪的生产性能,必须加大香猪本品种选育的力度,确保品种优良。从江香猪分大、小两个类型,大型香猪除具有…     

从江香猪源切除信号肽β干扰素原核载体的构建

β干扰素(IFN-β)具有重要的抗病毒生物学功能,为了研究从江香猪源IFN-β生物活性,试验设计1对扩增切除信号肽序列的香猪源IFN-β编码区引物,以pUCm-T-IFN-β为模板进行PCR扩增,经菌液PCR筛选、测序鉴定后,获得重组质粒pColdⅠ-CJ-poIFN-β,将其转入大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达后用SDS-PAGE蛋白电泳,Western blot方法对重组表达蛋白进行分析。结果:切除信号肽序列的从江香猪源IFN-β序列编码区长为498 bp,表明该片段已正确插入原核表达质粒pColdⅠ中;SDS-PAGE蛋白电泳在预期位置未见蛋白条带,但Western blot检测显示带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,显色后条带为18.26 ku,与预期大小相符。结果显示:试验成功构建了携带切除信号肽序列的香猪源IFN-β基因的原核表达质粒,但重组蛋白表达量极低,试验结果为进一步研究从江香猪源-β干扰素的生物活性奠定基础。     

从江香猪气喘病血清学调查

为了解从江香猪气喘病(支原体)感染情况,2014年9月至2015年8月分别从江县和榕江县采集香猪血清共640份.用ELISA的方法对全部样品进行检测,结果显示,抗体阳性总数为526份,阳性率为82.19%.表明在从江县和榕江县香猪普遍存在猪支原体感染,因此,采取相应的防控措施,保证从江香猪的健康发展.